芒柄花黃素對人膀胱癌細胞T739增殖、凋亡的影響及機制探討

柳青+梁梅花+張幸

[摘要] 目的 觀察芒柄花黃素對人膀胱癌細胞T739增殖與凋亡的影響及其機制探討。 方法 分別采用0、15、30、60 μmol/L的芒柄花黃素作用T739細胞后，CCK8法檢測T739細胞的增殖情況，流式細胞術檢測凋亡率的變化，Hoechst 33258熒光染色法觀察凋亡情況，Western blot檢測GSK-3β、Axin、β-catenin蛋白含量變化。 結果 15、30、60 μmol/L的芒柄花黃素以濃度和時間依賴方式明顯抑制T739細胞的增殖（P < 0.05），且作用T739細胞48 h后凋亡率隨藥物劑量增加顯著上升（P < 0.05），呈濃度-效應關系。Hoechst33258染色顯示T739細胞隨藥物濃度的升高，凋亡明顯增多。Western blot法顯示GSK-3β及Axin蛋白表達隨藥物濃度升高而增加（P < 0.05），β-catenin蛋白水平則隨藥物濃度升高而降低（P < 0.05），且均呈濃度-效應關系。 結論 芒柄花黃素對T739細胞有顯著的增殖抑制和誘導凋亡作用，其機制可能與芒柄花黃素上調GSK-3β、Axin蛋白表達和降低β-catenin蛋白水平有關。

[關鍵詞] 芒柄花黃素；T739；凋亡；GSK-3β；Axin；β-catenin

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（a）-0004-04

[Abstract] Objective To study the effect of formononetin on the proliferation and apoptosis of human bladder cancer cells T739 cells， and discuss the mechanism. Methods Different contents of 0， 15， 30， 60 μmol/L formononetin were added to T739 cells. CCK8 assay was applied to determine the effect of formononetin on proliferation of T739 cells. Apoptosis was analyzed by flow cytometry and Hoechst33258 staining. The expressions of GSK-3β， Axin and β-catenin proteins in T739 cells were determined by Western Blot. Results Different contents of 15， 30， 60 μmol/L formononetin treatments suppressed the proliferation of T739 cells in a time- or dose-dependent manner （P < 0.05）， and the apoptotic rates of formononetin-treated T739 cells for 48 hours were increased in a dose-dependent manner （P < 0.05）. In addition， Hoechst 33258 staining revealed that the apoptotic cells of formononetin-treated T739 were increased in a dose-dependent manner. Further， Western blot results showed that formononetin significantly up-regulated the protein levels of GSK-3β and Axin in a dose-dependent manner （P < 0.05）， while the protein level of β-catenin was inhibited （P < 0.05）. Conclusion Formononetin exerts inhibitory growth effect and induced apoptosis on human bladder cancer of T739 cells. The underlyng mechanism involved may be associated with activating GSK-3β and Axin expressions and inhibiting β-catenin activity in T739 cells.

[Key words] Formononetin； T739； Apoptosis； GSK-3β； Axin； β-catenin

膀胱癌是泌尿外科最常見的惡性腫瘤[1]。由于近年來膀胱癌發(fā)病率呈上升趨勢，所以受到越來越多的關注[2]。目前臨床上首選手術治療，但是術后復發(fā)率極高[3]。因此，尋找一種高效低毒的藥物對防治膀胱癌有著重要意義。芒柄花黃素來源于植物紅三葉草，能有效抑制多種腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡[4-6]。課題組近年來研究發(fā)現芒柄花黃素可以通過p38/Akt及IGF-1/IGF-1R信號通路誘導前列腺癌細胞凋亡，還能通過IGF1/PI3K/Akt通路誘導乳腺癌細胞凋亡[7-9]。而芒柄花黃素對人膀胱癌細胞T739增殖、凋亡的影響及機制卻未見報道。因此，本文通過研究不同濃度芒柄花黃素對T739細胞增殖、凋亡產生的影響和T739細胞GSK-3β、Axin、β-catenin蛋白表達水平的變化，進一步探討其作用機制。endprint

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

芒柄花黃素（Formononetin，純度>98%）、二甲基亞砜（DMSO，純度98%）、熒光染料Hoechst33258購自美國Sigma公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，人膀胱癌細胞株T739由中科院上海細胞生物研究所提供，實驗所用GSK-3β、Axin、β-catenin一抗均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗小鼠IgG二抗為北京中杉金橋生物技術公司生產，CCK8試劑盒、V-FITC凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天研究所，總蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，全自動酶標板分析儀由美國Bio-Rad公司生產，FACSAriaⅢ流式細胞儀由美國BectonDickson公司生產。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人膀胱癌細胞T739在37℃、5% CO2環(huán)境下置于含10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 藥物配制 芒柄花黃素與二甲基亞砜溶液配成濃度為100 mmol/L藥液，置于4℃冰箱避光保存，待使用時以完全培養(yǎng)基按比例稀釋成0（對照組）、15、30、60 μmol/L濃度藥液。

1.2.3 CCK8法檢測T739細胞的增殖活性 取對數生長期T739細胞，以細胞濃度6×103個/孔，每孔100 μL細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，在細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后取出，棄培養(yǎng)液，分別加入“1.2.2”項下濃度藥液，每組設5個復孔。繼續(xù)孵育24、48、72 h后，避光每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后取出，酶標儀于450 nm波長測定吸光度OD值，實驗重復3次，結果取算數均數。細胞增殖抑制率=（1-實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值）×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測T739細胞的凋亡率變化 取對數生長期T739細胞接種于6孔板。12 h細胞貼壁后去上清液，分別加入“1.2.2”項下濃度藥液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用胰酶消化成單細胞懸液，PBS清洗3遍，2000 r/min離心5 min，之后棄掉上清液，每管加入500 μL結合緩沖液重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL Propidium Iodide，混勻室溫避光反應15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次，結果取算數均數。

1.2.5 Hoechst染色觀察T739細胞凋亡情況 取對數生長期T739細胞接種于6孔板，12 h細胞貼壁后去上清液，分別加入“1.2.2”項下濃度藥液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)基，加入0.5 mL固定液，10 min后棄固定液，PBS清洗2遍，加入0.5 mL Hoechst33258染色液，避光染色5 min。在熒光顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)（激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為460 nm），實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測T739細胞GSK-3β、Axin、β-catenin蛋白表達 取“1.2.2”項下濃度藥液孵育48 h后的細胞，提取總蛋白，用考馬斯亮蘭法（Bradford micro）測定樣品蛋白濃度。每孔20 μL上樣，濃縮膠電泳電壓為80 V，分離膠電壓為130 V，電泳4 h后，PVDF膜半干轉，時間為1.5 h。用含5%脫脂奶粉的PBS液封閉1 h，之后分別加入GSK-3β、Axin、β-catenin抗體（抗體稀釋度1∶500）4℃過夜，次日TBS洗膜3次，每次10 min，洗膜后用HRP標記的二抗（抗體稀釋度1∶5000）室溫反應1 h，于暗室中用超敏化學發(fā)光法曝光膠帶。采用凝膠分析系統(tǒng)記錄條帶光密度并且圖像分析系統(tǒng)分析，以蛋白條帶的積分光密度值反映檢測蛋白相對強度。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 芒柄花黃素對T739細胞增殖的影響

與對照組相比，15、30、60 μmol/L的芒柄花黃素在分別作用24、48、72 h后，T739細胞的增殖受到不同程度抑制（P < 0.05），增殖抑制率隨著藥物濃度升高和時間延長而增加。見表1。

2.2 芒柄花黃素對T739細胞凋亡的影響

相比對照組，15、30、60 μmol/L的芒柄花黃素作用48 h后T739細胞凋亡率明顯升高，呈濃度-效應關系（P < 0.05），見表2。Hoechst 33258染色觀察發(fā)現，對照組和細胞核完整，形態(tài)飽滿，而藥物組可見細胞核呈致密濃染，嚴重時甚至裂解為碎塊，產生凋亡小體。隨著藥物濃度的升高，細胞的凋亡越明顯，呈劑量依賴性。見圖1。

2.3 芒柄花黃素對T739細胞GSK-3β、Axin、β-catenin蛋白表達的影響

15、30、60 μmol/L的芒柄花黃素處理T739細胞48 h后，GSK-3β的表達水平分別上調至對照組的（1.530±0.034）、（2.110±0.042）、（2.500±0.047）倍（P < 0.05），Axin的表達水平分別上調至對照組的（1.390±0.022）、（1.571±0.027）、（1.733±0.036）倍（P < 0.05），而β-catenin的表達水平分別下降到對照組的（0.890±0.024）、（0.692±0.021）、（0.491±0.023）倍（P < 0.05）。見圖2。

3 討論endprint

近年來，從植物中提取藥物用于抗腫瘤治療已成為目前研究的新方向[10]。從紅三葉草中提取的芒柄花黃素是一種生物活性異黃酮，目前已有研究報道芒柄花黃素具有較強抗腫瘤作用，可通過多種途徑抑制腫瘤細胞株的生長及誘導其發(fā)生凋亡[11-13]。但對人膀胱癌細胞T739的作用及其機制還未見國內外報道。

本實驗CCK8法證實了芒柄花黃素對T739細胞具有抑制增殖作用，且此作用隨藥物濃度的升高和時間延長而增強。隨后進行的流式細胞儀檢測和Hoechst 33258染色結果顯示，T739細胞出現不同程度的凋亡，凋亡率隨藥物濃度升高而增加，這與CCK8實驗結果相符。因此推測芒柄花黃素對膀胱癌的抑制增殖作用可能是通過誘導細胞凋亡實現的。

Wnt信號通路的經典途徑是Wnt/β-catenin途徑，該途徑參與多種腫瘤惡性生物學行為的調節(jié)，其各組成成分均可能與膀胱癌的浸潤和轉移密切相關，主要通過促進癌細胞的遷移黏附和腫瘤血管生成，以及誘導細胞增殖等方式參與膀胱癌的浸潤及轉移[14-15]。Wnt/β-catenin信號通路的機制是阻滯了β-catenin的降解，使β-catenin逐漸蓄積在細胞漿內，由此進入到細胞核與TCF-4結合，啟動c-myc、cyclin D1、MMP-7、VEGF等基因轉錄，導致多種惡性腫瘤的產生和發(fā)展[16-19]。因此，β-catenin的過多蓄積與腫瘤的異常增殖及侵襲轉移有重要關系。Axin為細胞內的主要架構蛋白（scaffold），它能同GSK-3β、大腸腺瘤息肉樣蛋白（APC）構成復合體，促使β-catenin磷酸化并降解，進而使Wnt/β-catenin通路處于低活性狀態(tài)[20]。因此，Axin與GSK-3β在Wnt/β-catenin信號通路中扮演“抑瘤因子”的角色，β-catenin扮演“促瘤因子”角色。本實驗研究結果表明：芒柄花黃素能呈劑量依賴性地抑制T739細胞的增殖并能誘導其凋亡，此種作用可能與其能抑制Wnt/β-catenin信號通路有關，表現為Wnt/β-catenin信號通路中的GSK-3β、Axin表達隨芒柄花黃素濃度增加而升高，β-catenin表達隨芒柄花黃素濃度增加而降低。

綜上所述，芒柄花黃素對膀胱癌T739細胞的增殖有明顯劑量、時間依賴性抑制作用，并且能誘導凋亡，其機制可能與激活GSK-3β、Axin表達，降低β-catenin表達，從而抑制Wnt/β-catenin信號轉導有關。

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（收稿日期：2017-03-30 本文編輯：程 銘）endprint