李 雪 郭玉婷

1山東中醫(yī)藥大學(xué)2015級在讀研究生，濟南 250355 2山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，濟南 250001

10.3969/j.issn.1674-4616.2017.03.006

△通信作者，Corresponding author，E-mail：zhmqlw@sina.com

MK801抑制人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的實驗研究

李 雪1郭玉婷2△

1山東中醫(yī)藥大學(xué)2015級在讀研究生，濟南 2503552山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，濟南 250001

目的研究NMDA受體1(NMDA receptor1，NMDAR1)抑制劑MK801對人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用及其機制。方法建立人結(jié)腸癌HT-29細胞株裸鼠移植瘤模型，分為實驗組和對照組，實驗組給予MK801 0.6 mg/(kg·d)腹腔注射給藥，對照組腹腔注射等量生理鹽水，給藥4周后處死裸鼠并稱取瘤重，采用免疫組織化學(xué)法檢測2組腫瘤組織中NMDAR1的表達變化。結(jié)果實驗組裸鼠的腫瘤體積明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，實驗組腫瘤組織中NMDAR1的表達明顯減少(P<0.01)。結(jié)論NMDAR1抑制劑MK801通過抑制NMDAR1的表達來抑制人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的生長。

NMDAR1抑制劑；MK801；結(jié)腸癌；裸鼠；移植瘤

結(jié)直腸癌是人類高發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)病率正逐年升高，在全球惡性腫瘤發(fā)病率中已上升至第三位，男性僅次于肺癌和胃癌，女性僅次于乳腺癌和子宮頸癌，其病死率居惡性腫瘤死因的第二位[1-2]。雖然目前有包括手術(shù)、化療、基因、中醫(yī)等治療手段，但仍需尋找新的治療途徑。

NMDA受體是一種谷氨酸離子型受體，以NR1為其組成的必需亞基，此受體在神經(jīng)系統(tǒng)突觸形成、突觸可塑性改變等方面具有較強調(diào)節(jié)作用，并在精神分裂癥、癲癇等疾病中也發(fā)揮著重要作用。近年來，研究[3-5]發(fā)現(xiàn)NMDA受體(NMDAR)不僅在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中有著重要作用，其還參與消化道腫瘤細胞的增殖、分化及胃腸運動，被認為是一種腦腸肽。研究[6-7]表明，NMDA受體1(NMDAR1)拮抗劑能抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)細胞周期阻滯及細胞的死亡，有望成為腫瘤細胞抑制藥物。本實驗通過觀察NMDAR1抑制劑MK801對人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長的影響，并用免疫組織化學(xué)法(免疫組化法)檢測移植瘤中NMDAR1的表達情況，為臨床上結(jié)腸癌的治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞

BALB/c-nu裸鼠，6～8周齡，雌性，體重16～18 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004。HT-29人結(jié)腸癌細胞株由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗室提供。

1.2 藥物與試劑

MK801購自MCE公司；胎牛血清購自HyClone公司；McCoy’s 5A培養(yǎng)基購于Genom公司；0.25%胰蛋白酶購自Solarbio公司；一抗NMDAR1抗體及其他免疫組織化學(xué)試劑、蘇木精-伊紅染色試劑均購自濟南檸檬生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

獨立送回風凈化籠具購于蘇州市蘇杭科技器材有限公司；5%CO2恒溫孵箱購自Thermo公司；潔凈動物柜購自北京文慧凈化設(shè)備廠；低溫高速離心機購于Sigma公司；倒置光學(xué)顯微鏡購于日本尼康公司；超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；超低溫冰箱購自Thermo Forma公司。

1.4 細胞培養(yǎng)及傳代

在無菌細胞培養(yǎng)室超凈工作臺中完成以下操作步驟：將人結(jié)腸癌細胞株HT-29置于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)傳代，取生長狀態(tài)良好的指數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.5 收集細胞及小鼠造模

將處于指數(shù)生長期細胞用胰酶消化成細胞懸液，予以無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度為5.0×106個/ml，每只裸鼠右上肢腋下皮膚消毒后，將該細胞懸液0.2 ml注射于皮下，建立HT-29結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型。

1.6 分組及治療

模型制備成功后，將裸鼠隨機分為實驗組和對照組，每組12只。實驗組給予MK801 0.6 mg/(kg·d)腹腔注射給藥，對照組給予腹腔注射等量生理鹽水。記錄腫瘤生長狀況，每隔2天測量腫瘤的短徑a(mm)和長徑b(mm)，根據(jù)Steel公式：V=a×b2/2，計算腫瘤體積。給藥4周后處死裸鼠并稱取瘤重。采用免疫組化法檢測2組腫瘤組織中NMDAR1的表達變化。

1.7 免疫組化檢測腫瘤組織NMDAR1的表達

將腫瘤組織用4%多聚甲醛固定后脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4 μm厚的切片，切片用5%BSA封閉1 h，然后加入一抗NMDAR1抗體，4 ℃孵育過夜，洗滌，加入二抗,37 ℃孵育30 min，DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察，并對所有組織切片進行拍照，然后使用軟件Image-Pro Plus 6.0對NMDAR1的表達進行定量測量，即平均光密度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MK801對裸鼠移植瘤生長的影響

治療后，與對照組相比，實驗組對人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤具有明顯抑制作用，對照組和實驗組腫瘤體積分別為(2 178.00±164.40) mm3和(1 326.00±87.68) mm3，腫瘤質(zhì)量分別為(3.53±0.13) g和(1.45±0.13) g，2組腫瘤體積和質(zhì)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MK801可減緩人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的生長，縮小腫瘤體積，抑瘤率為58.87%。見圖1、表1。

A：對照組；B：實驗組圖1 人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤圖

組別腫瘤體積(mm3)腫瘤質(zhì)量(g)抑瘤率(%)對照組2178.00±164.403.53±0.13-實驗組1326.00±87.68△1.45±0.13△58.87△

與對照組比較△P<0.05

2.2 MK801對NMDAR1表達的影響

治療后，實驗組NMDAR1的表達較對照組顯著降低。對照組和實驗組腫瘤組織中NMDAR1平均光密度值分別為(1.54±0.03)和(0.41±0.03)，實驗組NMDAR1平均光密度值明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表2。

A：對照組；B：實驗組圖2 人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤NMDAR1表達(蘇木精-伊紅染色，光鏡×20，×40)

組別平均光密度對照組1.54±0.03實驗組0.41±0.03△

與對照組比較△P<0.05

3 討論

谷氨酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其受體主要分為離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體[8]。其中NMDA受體為主要的離子型受體，由NR1、NR2和NR3等亞基組成。NR1是該受體的功能部分，為其組成的必需亞基，在突觸可塑性、神經(jīng)毒性方面有著重要的生理功能，并在精神分裂癥、情緒障礙、癲癇等疾病的發(fā)生中也發(fā)揮著顯著作用[9-11]。近年來，人們對NMDA受體的研究不僅局限于神經(jīng)系統(tǒng)，Stepulak等[12]研究發(fā)現(xiàn)NMDA受體不僅在神經(jīng)細胞中表達，在腫瘤細胞中也有表達。Watanabe等[13]研究證實，胃癌中存在NMDA受體的表達，并且NMDA受體抑制劑可以抑制腫瘤細胞的生長。也有研究[5，14]表明，肝癌、胰腺癌等腫瘤細胞中NMDA受體表達上調(diào)，應(yīng)用NMDA受體拮抗劑可抑制腫瘤細胞增殖、遷移，并能誘導(dǎo)細胞周期的阻滯。有文獻[15]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞中存在NMDA受體的表達，故本文以此為靶向，研究NMDAR1抑制劑MK801對人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用。

本實驗選擇人結(jié)腸癌HT-29細胞株在裸鼠皮下接種，制備裸鼠移植瘤模型，建模成功率為100%。給藥后結(jié)果表明，NMDAR1抑制劑對人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤具有明顯抑制作用，可減緩人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的生長，縮小腫瘤體積，明顯降低NMDAR1的表達，提示MK801通過下調(diào)NMDAR1的表達抑制人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的生長。

NMDAR1抑制劑MK801抑制結(jié)腸癌的信號通路機制至今尚未明確，但有研究[16]證實Ca2+可以刺激腫瘤的生長，影響腫瘤細胞的遷移。腫瘤細胞相對較低的靜息膜電位(-30～50 mV)可有較高的概率通過NMDA受體使Ca2+內(nèi)流，刺激腫瘤增殖。并有研究[17]表明沒有Ca2+在細胞外介質(zhì)中的NMDA受體拮抗劑的抗增殖作用明顯減弱。后期可以從Ca2+方面著手，研究NMDA受體拮抗劑抗腫瘤的信號通路機制，以便為以后的抗腫瘤藥物提供更具體的實驗依據(jù)。

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ExperimentalStudyofMK801inInhibitingHumanColonCancerXenograftinNudeMiceLI Xue1，GUO Yuting2△

1ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Ji’nan250355，China

2TheSecondAffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Ji’nan250001，China

ObjectiveTo study the inhibitory effect of NMDA receptor1(NMDAR1) inhibitor MK801 on the growth of human colon cancer xenografts in nude mice and its mechanism.MethodsThe nude mice model of human colon cancer HT-29 cell line was established and divided into experimental group and control group.The experimental group was given MK801 0.6 mg/(kg·d) intraperitoneally for 4 weeks.At the same time，the control group was given intraperitoneal injection of equal volume of normal saline.The expression of NMDAR1 was detected using immunohistochemistry in both two groups.ResultsAfter 4 weeks of intervention，the tumor volume in the experimental group was significantly smaller than that in the control group(P<0.05).Compared with the control group，the expression of NMDAR1 in tumor tissue in experimental group decreased significantly(P<0.01).ConclusionNMDAR1 inhibitor MK801 can inhibit the growth of human colon cancer xenograft in nude mice through inhibiting the expression of NMDAR1.

NMDA receptor1 inhibitor；MK801；colon cancer；nude mice；xenograft

2017-03-28)