趙凱亮 陳辰 石喬 趙亮 梅方超 王萍 王衛(wèi)星

糖原合酶激酶-3β在急性壞死性胰腺炎腎損傷中的表達(dá)及作用機(jī)制

趙凱亮 陳辰 石喬 趙亮 梅方超 王萍 王衛(wèi)星

目的觀察急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腎臟的組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化，檢測(cè)ANP大鼠腎臟組織糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)及磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)的蛋白表達(dá)。方法60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及ANP 3、6、12、24 h組，每組12只。采用膽胰管逆行注射5%牛磺膽酸鈉溶液制備大鼠ANP模型。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠后取血及胰腺和左腎組織，檢測(cè)血淀粉酶、脂肪酶、肌酐和尿素氮水平，常規(guī)行胰腺和腎臟組織病理學(xué)檢查，透射電鏡下觀察大鼠腎超微結(jié)構(gòu)改變，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)腎臟組織GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達(dá)。結(jié)果ANP大鼠血淀粉酶、脂肪酶、肌酐、尿素氮水平以及胰腺及腎組織的病理評(píng)分均較對(duì)照組顯著升高，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高。ANP大鼠腎小管上皮細(xì)胞表面微絨毛腫脹、排列紊亂，胞核固縮、碎裂，核內(nèi)見(jiàn)染色質(zhì)濃縮、核膜分離，胞質(zhì)內(nèi)線粒體凝集、腫脹，空泡樣變。對(duì)照組及ANP 3、6、12、24 h組大鼠腎組織GSK-3β蛋白表達(dá)量分別為0.702±0.044、0.876±0.017、0.872±0.034、0.855±0.035、0.852±0.032；p-GSK-3β表達(dá)量為0.626±0.029、0.790±0.029、0.616±0.021、0.448±0.028、0.439±0.017。ANP各時(shí)點(diǎn)組腎組織GSK-3β蛋白表達(dá)均較對(duì)照組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，但ANP各時(shí)點(diǎn)組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p-GSK-3β表達(dá)在造模后3 h升高，以后逐漸下降，其中ANP 3 h組顯著高于對(duì)照組及ANP其他時(shí)點(diǎn)組，ANP 12、24 h組顯著低于對(duì)照組及ANP 3、6 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。結(jié)論ANP大鼠腎臟GSK-3β表達(dá)在造模3 h即升高，并維持在較高水平，p-GSK-3β在造模3 h時(shí)一過(guò)性升高，以后逐漸下降，并降至顯著低于對(duì)照組，這一變化在ANP并發(fā)腎損傷的過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

胰腺炎，急性壞死性； 急性腎功能不全； 糖原合酶激酶-3β

Fundprogram：National Natural Science Foundation of China(81370562)；Fundamental Research Funds for the Central Universities(2042015kf0086)

重癥急性胰腺炎(SAP)并發(fā)腎功能損傷的概率僅次于肺損傷，嚴(yán)重者可進(jìn)展為急性腎功能衰竭，病死率可高達(dá)80%[1-2]。大量研究表明，微循環(huán)障礙、體內(nèi)產(chǎn)生的大量炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子及細(xì)胞凋亡等因素在SAP并發(fā)腎損傷的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，但其具體機(jī)制仍不十分清楚。糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種多功能蛋白激酶，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。GSK-3β不僅通過(guò)激活糖原合成酶調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝從而調(diào)控細(xì)胞能量代謝過(guò)程，而且在炎癥相關(guān)疾病的細(xì)胞壞死和器官衰竭中發(fā)揮重要作用[3-4]。但GSK-3β是否參與SAP并發(fā)的腎損傷尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究建立急性壞死性胰腺炎(ANP)并發(fā)腎損傷的大鼠模型，檢測(cè)腎組織GSK-3β蛋白表達(dá)及其磷酸化狀態(tài)(p-GSK-3β)的變化趨勢(shì)，探討其在ANP相關(guān)性腎損傷發(fā)病中的可能作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重150～200 g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組及ANP 3、6、12、24 h組，每組12只。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，自由飲水。采用主胰管逆向注射5%牛磺膽酸鈉溶液1 ml/kg體重(Sigma公司)的方法制備ANP模型。對(duì)照組胰膽管內(nèi)注入等容積生理鹽水。對(duì)照組術(shù)后12 h、ANP組按各時(shí)間點(diǎn)分批處死大鼠。下腔靜脈穿刺采血，離心分離血清，置-20℃保存?zhèn)溆茫蝗〔糠忠认俳M織和左側(cè)腎臟組織置4%多聚甲醛液固定，部分左側(cè)腎臟組織置2%戊二醛液固定，其余腎臟組織立即經(jīng)液氮凍存后置-80℃冰箱保存。

二、方法

1．胰腺、腎臟組織病理學(xué)檢查：取4%多聚甲醛固定的胰腺、腎臟組織，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察。分別參照Schmidt等[5]、Paller等[6]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胰腺及腎臟組織進(jìn)行病理評(píng)分。

2．腎臟組織超微結(jié)構(gòu)觀察：取1 mm×1 mm×1 mm 2%戊二醛磷酸鈉固定的腎臟組織塊制成超薄切片，置日立H-300型透射電鏡下觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)變化并拍照。

3．血淀粉酶、脂肪酶、肌酐和尿素氮水平檢測(cè)：委托武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心進(jìn)行檢測(cè)。

4．腎臟組織GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達(dá)檢測(cè)：取凍存的腎臟組織，應(yīng)用蛋白裂解液制備勻漿，置冰上孵育30 min，4℃ 13 000 r/min離心30 min，取上清液。應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取40 μg蛋白行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達(dá)。兔抗大鼠GSK-3β、p-GSK-3β及內(nèi)參β-actin多克隆抗體均購(gòu)自Cell Signalling Technology公司，工作濃度分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗工作濃度為1∶3 000。最后ECL化學(xué)發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。采用Image-ProPlus蛋白灰度分析軟件掃描檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算p-GSK-3β/GSK-3β比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、血淀粉酶、脂肪酶、肌酐、尿素氮水平變化

造模后3 h大鼠血清淀粉酶、脂肪酶活性及肌酐、尿素氮水平即升高，并隨病程進(jìn)展而逐漸增加，分別于24 h、24 h、24 h及12 h達(dá)峰值，ANP各時(shí)間點(diǎn)的水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。ANP 12 h組與24 h組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表1)。

二、各組大鼠胰腺及腎臟組織病理學(xué)改變

對(duì)照組胰腺組織無(wú)明顯病理改變。ANP組各時(shí)點(diǎn)胰腺組織呈現(xiàn)不同程度充血、水腫、出血、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和胰周脂肪壞死，隨時(shí)間進(jìn)展，胰腺壞死程度加重、范圍明顯擴(kuò)大，12 h和24 h時(shí)可見(jiàn)大片狀壞死、腺體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重(圖1上)。ANP各時(shí)點(diǎn)組病理評(píng)分均較對(duì)照組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，且ANP各時(shí)點(diǎn)組間的差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表2)。

對(duì)照組大鼠腎臟組織無(wú)明顯病理改變。ANP 3 h組見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞水腫，間質(zhì)血管輕度充血，無(wú)出血改變；6 h組見(jiàn)部分腎小球瘀血，腎小管管壁明顯充血、水腫，少量腎小管上皮細(xì)胞壞死，向管腔脫落，間質(zhì)可見(jiàn)少量紅細(xì)胞及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；12 h組見(jiàn)腎小球淤血性改變，細(xì)胞界限模糊，腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落，管腔內(nèi)可見(jiàn)大量管型形成，腎小管管腔變窄或閉塞，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；24 h組見(jiàn)大片腎小球缺血、壞死，腎小管大量管型形成，大量上皮細(xì)胞壞死(圖1下)。ANP各時(shí)點(diǎn)組病理評(píng)分均較對(duì)照組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。除12與24 h組之外，其他ANP各時(shí)點(diǎn)組間的差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表2)。

三、腎臟組織超微結(jié)構(gòu)改變

對(duì)照組大鼠腎臟組織腎小管上皮細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)排列整齊，胞核內(nèi)染色質(zhì)分布較均勻，無(wú)核膜分離現(xiàn)象，線粒體大小及排列均勻一致，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，無(wú)擴(kuò)張；ANP 12 h組大鼠腎臟的腎小管上皮細(xì)胞表面微絨毛腫脹、減少，排列紊亂，微絨毛末端呈桿狀膨大，細(xì)胞核形不規(guī)則，部分足突融合，胞核內(nèi)可見(jiàn)染色質(zhì)核膜分離現(xiàn)象，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮、邊積呈環(huán)狀，有的核固縮、碎裂、呈不規(guī)則塊狀，胞質(zhì)內(nèi)線粒體凝集和腫脹，嵴排列紊亂、斷裂，甚至可見(jiàn)空泡樣變(圖2)。

四、各組大鼠腎臟組織GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達(dá)的變化

對(duì)照組及ANP組3、6、12、24 h組大鼠腎組織GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.702±0.044、0.876±0.017、0.872±0.034、0.855±0.035、0.852±0.032；p-GSK-3β表達(dá)量為0.626±0.029、0.790±0.029、0.616±0.021、0.448±0.028、0.439±0.017(圖3)；p-GSK-3β/GSK-3β比值為0.933±0.041、0.868±0.031、0.712±0.054、0.528±0.051、0.516±0.015。ANP各時(shí)點(diǎn)組腎組織GSK-3β蛋白表達(dá)均較對(duì)照組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，但ANP各時(shí)點(diǎn)組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p-GSK-3β表達(dá)在造模后3 h升高，以后逐漸下降，其中ANP 3 h組顯著高于對(duì)照組及ANP其他時(shí)點(diǎn)組，ANP 12、24 h組顯著低于對(duì)照組及ANP 3、6 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而ANP 6 h組與對(duì)照組，ANP 12 h組與24 h組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ANP 3 h組的p-GSK-3β/GSK-3β比值與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ANP 6、12、24 h組均較對(duì)照組顯著降低，ANP 12、24 h組又較6 h組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

表1 對(duì)照組及ANP組大鼠血清學(xué)指標(biāo)的變化

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與ANP 3 h組比較，bP<0.05；與ANP 6 h組比較，cP<0.05

圖1 對(duì)照組(1A)及ANP 3、6、12、24 h組(1B、1C、1D、1E)大鼠胰腺(上)及腎臟(下)組織病理學(xué)改變(HE ×200)

組別只數(shù)胰腺組織腎臟組織對(duì)照組120．6±0．233．9±1．6ANP3h組126．5±0．3a109．0±4．6a 6h組129．9±0．5ab236．8±10．9ab 12h組1212．6±0．4abc320．9±10．1abc 24h組1214．7±0．3abcd350．4±13．3abc

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與ANP 3 h組比較，bP<0.05；與ANP 6 h組比較，cP<0.05；與ANP 12 h組比較，dP<0.05

圖2 對(duì)照組(2A)及ANP組(2B)大鼠腎臟組織的超微結(jié)構(gòu)變化

圖3 對(duì)照組(1)及ANP 3、6、12、24 h組(2、3、4、5)大鼠腎組織GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達(dá)

討 論

研究表明，GSK-3β在炎癥相關(guān)疾病的細(xì)胞壞死和器官衰竭中起著極其重要的作用[4]。Hoeflich等[7]報(bào)道在GSK-3β基因敲除小鼠肝再生模型中，其炎癥因子表達(dá)情況與NF-κB基因敲除小鼠表達(dá)相似，但血清TNF-α、IL-6水平明顯低于對(duì)照組。Cuzzocrea等[8]報(bào)道，抑制AP小鼠GSK-3β表達(dá)可降低血清淀粉酶和脂肪酶活性，下調(diào)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，并減輕胰腺的病理?yè)p傷，對(duì)AP時(shí)多器官損傷和功能障礙起到保護(hù)作用，并有效降低死亡率。

已有研究表明，GSK-3β在靜止的細(xì)胞中處于活性狀態(tài)，在受到外界刺激后，其活性可增強(qiáng)，但是GSK-3β位于N末端的絲氨酸殘基(GSK-3β Ser9)被磷酸化后，其活性可被抑制。GSK-3β的磷酸化可被各種因素，如缺氧、特異性抑制劑TDZD-8、非特異性抑制劑丙戊酸鈉等調(diào)控而抑制活性。GSK-3β也可被上游信號(hào)如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、AP-1、蛋白激酶C (PKC)、蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶B(PKB/AKT)等轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控。目前研究顯示，由胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為GSK-3β的主要調(diào)節(jié)因素，可導(dǎo)致GSK-3β的絲氨酸殘基磷酸化而失去活性[9-10]。

本研究結(jié)果顯示，ANP3h組大鼠腎組織GSK-3β蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增高，且未隨著病程進(jìn)展進(jìn)一步升高，而是維持在較高水平；而p-GSK-3β ser9在造模后一過(guò)性表達(dá)增高，隨著病程進(jìn)展逐漸下降，推測(cè)可能與ANP時(shí)同時(shí)啟動(dòng)機(jī)體保護(hù)機(jī)制有關(guān)。ANP時(shí)PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，導(dǎo)致GSK-3β的絲氨酸殘基磷酸化，p-GSK-3β表達(dá)增高，但是隨著病情進(jìn)展，導(dǎo)致GSK-3β磷酸化的保護(hù)機(jī)制可能受到抑制，從而使p-GSK-3β表達(dá)降低。本研究結(jié)果提示，GSK-3β不僅參與ANP時(shí)全身炎癥進(jìn)展，也參與ANP并發(fā)的急性腎損傷的發(fā)病過(guò)程，而p-GSK-3β表達(dá)變化可能在ANP并發(fā)的腎損傷病情進(jìn)展中發(fā)揮更重要的作用。但其更為確切的分子機(jī)制還需做更深入的研究。

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(本文編輯：屠振興)

Expressionofglycogensynthasekinase-3βinrenaldamageofacutenecrotizingpancreatitisanditsmechanism

ZhaoKailiang,Chenchen,ShiQiao,Zhaoliang,MeiFangchao,Wangping,WangWeixing.

DepartmentofHepatobiliaryandLaparoscopicSurgery,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:WangWeixing,Email:sate.llite@163.com

ObjectiveTo observe the changes of tissue morphology and ultrastructure of kidney in the rat model of acute necrotizing pancreatitis (ANP), and to investigate the protein expression of glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β) and phosphorylated GSK-3βin renal tissue.MethodsSixty SPF male SD rats were randomly divided into 5 groups (n=12 for each group) according to random number method, including control group, ANP 3 h, 6 h, 12 h, 24 h groups. ANP model was established by retrograde infusion of 5% sodium taurocholate solution into the biliopancreatic duct. Rats were sacrificed at corresponding time points to collect pancreatic and left renal tissue. Serum amylase (AMY), lipase (LIPA), creatinine (Cr) and urea nitrogen (BUN) levels were detected. Pancreatic and renal tissues were routinely pathologically examined.

Rephrocytes′ ultrastructure changes were observed by projection electron microscope. GSK-3β protein expression and phosphorylated GSK-3β(p-GSK-3β) in kidney tissue were quantified by Western-blot.ResultsSerum AMY, LIPA, Cr, Bun and pathological scores for pancreatic and renal tissues in ANP groups were obviously higher than those in control group, which increased gradually with the progress of pancreatitis. In ANP rats, it was observed that the microvilli on the surface of the epithelial cells of renal tubules were swelling and irregularly arranged, the nucleus was condensed and broken, the nuclear chromatin was condensed and separated from the nuclear membrane, the mitochondria was condensed, swelling and vacuolated. The expression levels of GSK-3β protein in the renal tissue of the control group and ANP 3 h, 6 h, 12 h, 24 h groups were 0.702±0.044, 0.876±0.017, 0.872±0.034, 0.855±0.035 and 0.852±0.032, respectively. The expression levels of p-GSK-3β were 0.626±0.029, 0.790±0.029, 0.616±0.021, 0.448±0.028 and 0.439±0.017. GSK-3β protein expression was higher in ANP group than in control group, and the difference was statistically significant (allP<0.05). But there was no statistically significant difference at different time points in ANP group. p-GSK-3β protein expression increased at 3 h after modeling, and then gradually decreased. p-GSK-3β protein expression was higher in ANP 3 h group than control group and other ANP groups, which in ANP 12 h, 24 h group was obviously lower than control group and ANP 3 h, 6 h group, and the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionsGSK-3β expression in the kidney of ANP rats began to increase at 3 h after modeling and maintain a high level. p-GSK-3β was transiently increased at 3 h after modeling and then gradually decreased to a level obviously lower than control group. It indicated that these changes may play a crucial role in ANP associated kidney injury.

Pancreatitis, acute necrotizing; Acute kidney injury; Glycogen synthase kinase-3β

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.05.004

430060 武漢，武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽腔鏡外科

王衛(wèi)星，Email: sate.llite@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81370562)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助(青年教師資助項(xiàng)目，2042015kf0086)

2017-01-04)