雷帕霉素通過抑制TLR4、IL-6、PGE2表達促進口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡研究*

張齊梅，周 驄，楊 莉，伍寶琴，譚 紅，聶敏?！?/p>

(西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院:1.牙周黏膜科;2.檢驗科，四川瀘州 646000)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.004

雷帕霉素通過抑制TLR4、IL-6、PGE2表達促進口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡研究*

張齊梅1，周 驄1，楊 莉2，伍寶琴1，譚 紅1，聶敏海1△

(西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院:1.牙周黏膜科;2.檢驗科，四川瀘州 646000)

目的探討雷帕霉素促進人口腔鱗狀細胞癌SCC-15細胞凋亡是否與抑制TOLL樣受體-4(TLR4)、白細胞介素(IL)-6、前列腺素E2(PGE2)表達有關。方法培養(yǎng)人口腔鱗狀細胞癌SCC-15細胞株，雷帕霉素干預后，CCK-8法檢測SCC-15細胞活性，Hochest33342/PI雙染檢測SCC-15細胞凋亡，Transwell法檢測細胞侵襲能力，蛋白質印跡法(Western blot)檢測TLR4蛋白表達水平， ELISA法檢測IL-6、PGE2表達。結果雷帕霉素促進細胞凋亡，SCC-15細胞侵襲能力明顯降低。雷帕霉素干預后，IL-6、PGE2水平降低，TLR4蛋白表達減少，與陰性組比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論雷帕霉素促進人口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡可能與抑制TLR4、IL-6、PGE2表達有關。

口腔鱗狀細胞；雷帕霉素；免疫逃逸

慢性炎癥促進腫瘤逃逸是炎癥與腫瘤相關性的重要因素之一[1]。TOLL樣受體-4(Toll like receptor 4,TLR4)是體內重要的免疫因子，通過激活炎癥因子參與體內的炎癥反應。TLR4也參與了腫瘤細胞免疫逃逸，通過誘導腫瘤細胞生成大量免疫抑制性因子抑制免疫細胞啟動免疫應答，同時局部感染細胞大量增殖并抑制細胞凋亡[2-3]。白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)和前列腺素E2(prostaglandin E 2,PGE2)是TLR4下游重要的炎癥因子，參與了細胞增殖、凋亡、遷移和浸潤[4-5]。口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinomas，OSCC)發(fā)病率和病死率均較高，是人類頭頸部常見的惡性腫瘤之一[6-7]，目前OSCC發(fā)病機制不太清楚。雷帕霉素是從吸水鏈霉菌狹霉中分離的藥物，具有很強的免疫抑制特性[8]。TLR4是否參與了OSCC的免疫逃逸，雷帕霉素是否能通過抑制TLR4介導的免疫抑制，從而促進OSCC的凋亡目前尚不清楚。本文檢測雷帕霉素對人口腔鱗狀細胞癌SCC-15細胞株凋亡影響，探討TLR4、IL-6和PGE2在其中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人IL-6、PGE2 ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)，兔抗人β-actin、TLR4抗體，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體(Abcam公司)，雷帕霉素(Sigma公司)，人口腔鱗狀細胞癌SCC-15細胞株(上海拜力生物有限公司)。

1.2方法

1.2.1CCK-8法檢測SCC-15細胞活性 分為陰性組，雷帕霉素采用2.5、5、10、20、40 ng/mL 5個劑量組干預，每個濃度3個復孔，24 h后每孔加入CCK-8 10 μL繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標儀450 nm波長測吸光度值(A值)，其反應細胞活力情況。

1.2.2Hochest33342/PI雙染檢測SCC-15細胞凋亡 根據CCK-8結果，將雷帕霉素干預濃度定為5、10、20 ng/mL，陰性組為對照。SCC-15細胞與雷帕霉素共同培養(yǎng)24 h后Hochest33342/PI雙染檢測細胞凋亡。具體方法為收集細胞懸浮于1 mL培養(yǎng)基中，加入10 μL蒸餾水溶解的Hochest 33342儲存液(100 mg/L)，染色15 min；冰上冷卻，3 000 g×5 min離心，去上清液，細胞重懸1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，加5 μL PI液(1 g/L，蒸餾水溶解)，混勻，熒光顯微鏡觀察。細胞核藍色為正常細胞，亮藍色為凋亡細胞，紅色為死亡細胞。

1.2.3細胞侵襲實驗 采用BD公司的基質膠包被的侵襲小室觀察雷帕霉素對SCC-15細胞侵襲能力的影響。Matrigel chambers加入500 μL不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基中室溫放置1 h，使基質膠水化，棄多余培養(yǎng)基。下室孔板內加入750 μL含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。離心收集細胞，用含0.1% BSA的RPMI1640重懸細胞至4×105/mL，取200 μL加入上室。干預時間為24 h。24 h后，用棉簽抹去上室未能穿膜的細胞，用100%甲醇固定10 min。用0.1%結晶紫染色細胞并在顯微鏡下計數。

1.2.4蛋白質印跡法(Western blot)檢測TLR4蛋白表達 將細胞分為陰性組和雷帕霉素5、10、20 ng/mL組。雷帕霉素與細胞共培養(yǎng)24 h后胰酶消化，收集細胞，加入預冷的RIPA裂解液500 μL，冰上裂解60 min，4 ℃，12 000 g/min×15 min。上樣后100 V恒壓電泳90 min轉至PVDF膜，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入適當濃度一抗(TLR4 1∶1 000，β-actin 1∶1 000)，冰箱4 ℃孵育過夜，PBST漂洗15 min×3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(羊抗兔1∶1 000)，室溫孵育1 h，PBST漂洗15 min×3次?；瘜W試劑發(fā)光，曝光并采集圖像，image lab軟件3.0版分析目的蛋白條帶的灰度值與內參條帶的灰度值。

1.2.5ELISA法檢測IL-6、PGE2表達 雷帕霉素5、10、20 ng/mL與細胞共培養(yǎng)24 h后收集上清液。按說明書操作，酶標儀A450 nm讀取IL-6和PGE2值。

2 結 果

2.1雷帕霉素對SCC-15細胞活性影響 結果顯示，雷帕霉素5個劑量組干預后，細胞活性逐漸降低，與陰性組比較，雷帕霉素5、10、20、40 ng/mL能抑制細胞活性(P<0.05)。見圖1。

圖1 雷帕霉素對SCC-15細胞活性影響

2.2雷帕霉素對SCC-15細胞凋亡的影響 結果顯示，陰性組細胞形態(tài)呈圓形，淡藍色，幾乎無凋亡細胞。雷帕霉素干預后多數細胞細胞核呈亮藍色染色，呈凋亡特征性改變，凋亡細胞較多，還可見紅色的死亡細胞。見圖2。

圖2 雷帕霉素對SCC-15細胞凋亡的影響

2.3雷帕霉素對SCC-15細胞侵襲影響 陰性組SCC-15細胞穿膜細胞數為(112.20±24.36)個，雷帕霉素5、10、20 ng/mL干預后穿膜細胞數分別為(78.87±6.47)、(62.14±7.31)、(58.24±7.71)個，與陰性組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 雷帕霉素對SCC-15細胞侵襲、TLR4表達及IL-6和PGE2水平的影響

a：P<0.05，與陰性組比較

圖3 雷帕霉素對SCC-15細胞TLR4蛋白的表達影響

2.4雷帕霉素對SCC-15細胞TLR4蛋白的表達影響 SCC-15細胞中TLR4蛋白表達增加，TLR4/β-actin灰度值比值為1.33±0.11。雷帕霉素5、10、20 ng/mL干預后TLR4蛋白表達減少，與陰性組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖3。

2.5雷帕霉素對SCC-15細胞IL-6和PGE2水平的影響 雷帕霉素5、10、20 ng/mL干預后IL-6和PGE2水平降低，與陰性組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

3 討 論

TLR4信號與腫瘤免疫逃逸如凋亡抵抗有關，TLR4通路通過誘導免疫抑制性因子和趨化因子促進腫瘤轉移，比如結腸癌細胞[9-10]。因此，抑制TLR4信號及相關炎癥因子的表達、阻斷免疫逃逸可能會成為防治腫瘤的有效策略。

雷帕霉素是P13K/Akt通路活化的強有力的抑制劑，選擇性抑制LPS誘導Akt和NF-κB活化是抑制免疫逃逸和逆轉TLR4凋亡抵抗的主要通路[11-12]。雷帕霉素是一種具有很強免疫抑制作用的藥物，對過敏性腦炎、淋巴組織增生病等自身免疫性疾病和移植排斥有一定作用[13]。近來雷帕霉素被引入治療肺及結腸癌，主要通過下調mTOR介導的cyclins D1、E和A，抑制相應激酶活性阻滯G1～S期細胞周期從而使細胞發(fā)生凋亡[14]。雷帕霉素也具有抑制腫瘤的浸潤和遷移[15]。

本研究結果顯示，雷帕霉素5個劑量組可以降低細胞活性，與陰性組比較差異有統計學意義(P<0.05)，提示雷帕霉素能夠抑制SCC-15細胞活性。實驗結果還顯示，雷帕霉素還具有促進SCC-15細胞凋亡的作用。雷帕霉素對SCC-15細胞侵襲能力結果顯示，陰性組SCC-15細胞穿膜細胞數為(112.20±24.36)個，雷帕霉素5、10、20 ng/mL干預后穿膜細胞數分別為(78.87±6.47)、(62.14±7.31)、(58.24±7.71)個，與陰性組比較差異有統計學意義(P<0.05)。提示雷帕霉素能夠抑制SCC-15細胞運動力，抑制其侵襲能力。

進一步分析雷帕霉素對TLR4表達及下游炎癥因子IL-6和PGE2水平影響，SCC-15細胞中TLR4蛋白表達增加，雷帕霉素5、10、20 ng/mL干預后TLR4蛋白表達減少(P<0.05)。干預后IL-6和PGE2水平降低(P<0.05)，提示雷帕霉素在促進細胞凋亡的同時，也抑制了TLR4和下游因子IL-6和PGE2的表達。

綜上所述，本研究顯示雷帕霉素通過促進OSCC細胞凋亡，抑制細胞活性和侵襲能力，其機制可能與抑制TLR4和下游因子IL-6和PGE2表達，阻斷了腫瘤免疫逃逸有關。其是否還可以通過其他機制干預OSCC尚需進一步研究。

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EffectsofrapamycinonpromotingoralsquamouscancercellapoptosisbyinhibitingTLR4,IL-6andPGE2expression*

ZhangQimei1，ZhouCong1,YangLi2,WuBaoqin1,TanHong1,NieMinhai1△

(1.DepartmentofPeriodontalMucosalMembrane;2.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedStomatologicalHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Scihuan646000,China)

ObjectiveTo investigate whether the effects of rapamycin on promoting oral squamous cancer cell apoptosis is related with inhibiting TLR4 expression and inflammatory factor IL-6 and PGE2 expression.MethodsHuman oral squamous carcinoma SCC-15 cell line was cultured and interfered by rapamycin.Then the activity of SCC-15 cells was detected by CCK 8,the SCC-15 cells apoptosis was detected by the Hochest33342/PI double staining,the invasion ability was determined by the transwell method.The TLR4 protein expression level was detected by Western blot and IL-6 and PGE2 expressions were detected by ELISA.ResultsRapamycin could promote cell apoptosis,the invasion ability of SCC-15 cells was significantly decreased.After rapamycin intervention,the TLR4 protein expression was decreased and expression levels of IL-6 and PGE2 were reduced,showing statistical difference as compared with the negative group (P<0.05).ConclusionRapamycin promotes oral squamous cancer SCC-15 cell apoptosis,which may be related with inhibiting TLR4,IL-6 and PGE2 expression.

oral squamous cell；rapamycin；immune escape

四川省應用基礎研究計劃基金資助項目(2013JY0126)；四川省科技廳-瀘州市科技局-西南醫(yī)科大學聯合科研基金資助項目(LY-62)。

張齊梅(1977-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事口腔黏膜病的病因及防治研究。△

，E-mail：nieminhai@126.com。

R780.1

A

1671-8348(2017)28-3900-03

2017-04-18

2017-06-21)

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.005