葛芪顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

呂玲玲 鄭 嵐 謝 松

(1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院中醫(yī)科，上海，200025； 2 上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院，上海，201203)

葛芪顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

呂玲玲1鄭 嵐1謝 松2

(1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院中醫(yī)科，上海，200025； 2 上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院，上海，201203)

目的：建立葛芪顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：使用薄層色譜法對(duì)黃芩和川芎進(jìn)行鑒別。采用高效液相色譜法(HPLC)分離并測(cè)定了黃芪甲苷的含量。色譜條件：Diamnosil C18柱(460 mm×250 mm,5 μm)，以乙腈：水(體積比34∶66)為流動(dòng)相；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。結(jié)果：此方法線性為0.35～7.02 μg，平均加樣回收率為99.1%。結(jié)論：該方法操作較為簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，可作為葛芪顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

葛芪顆粒；黃芪甲苷；川芎；黃芩；薄層色譜法；高效液相色譜

胰島素抵抗(IR)在中醫(yī)理論體系中尚無相對(duì)應(yīng)的中醫(yī)病名，在辨證分型上，亦無標(biāo)準(zhǔn)可循。中心性肥胖患者存在IR已被大量臨床研究和流行病學(xué)調(diào)查所證實(shí)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，2型糖尿病患者早、中期當(dāng)屬于中醫(yī)“脾癉”范疇，核心病機(jī)為中滿內(nèi)熱，治療應(yīng)清熱瀉火、化濁降脂為主[1]。動(dòng)脈粥樣硬化(As)是一種慢性的、進(jìn)展性的、系統(tǒng)性的疾病，中醫(yī)認(rèn)為其病機(jī)主要為氣血津液的紊亂，臟腑功能失調(diào)而形成的，屬痰證、瘀證等，故屬本虛標(biāo)實(shí)之證[2]?，F(xiàn)代醫(yī)家對(duì)As的治療主要是從兩大方面著手：一是清源，即清除體內(nèi)之痰瘀等有形實(shí)邪；二是固本，即通過健脾、補(bǔ)腎、調(diào)肝等從而達(dá)到瀉濁、降脂的主要目的[3]。這與糖尿病IR的中醫(yī)病因病機(jī)方面有著相通之處，因而治法相似。

葛芪顆粒是上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院研制,由黃芪、黃芩，川芎、麥冬和葛根五味藥材制成的中藥復(fù)方制劑，具有益氣養(yǎng)陰，活血清熱的功效，臨床主要用于治療IR和As，體現(xiàn)了中醫(yī)異病同治的特點(diǎn)，療效確切。方中黃芪是葛芪顆粒的君藥，其藥用有效成分主要是黃芪甲苷。為了控制藥品的質(zhì)量，本試驗(yàn)選擇黃芪甲苷作為含量測(cè)定指標(biāo)，建立HPLC-ELSD法分離測(cè)定葛芪顆粒中黃芪甲苷含量的方法；且采用TLC法對(duì)處方中黃芩，川芎進(jìn)行鑒別，從而建立葛芪顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-10AT高效液相色譜儀；Alltech蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；賽多利斯CP-225D型電子天平；KQ-100B型超聲波清洗儀。

1.2 試劑 蒸餾水、乙腈為色譜純，其余試劑分析純。

1.3 試藥 黃芪甲苷(含量測(cè)定用)，黃芩對(duì)照藥材，川芎對(duì)照藥材，均來源于中國(guó)藥品生物制品檢定所；葛芪顆粒，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院研制，批號(hào)為：20150401。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩薄層色譜鑒別 稱取本品3 g，研細(xì)，加乙酸乙酯-乙醇(3∶1)混合溶液30 mL,加熱回流30 min，放冷濾過，濾液減壓蒸干，加乙醇5 mL溶解，作為供試品溶液；取空黃芩樣品3 g，同法制備，得空白空黃芩樣品溶液；另取黃芩對(duì)照藥材1 g，同法制備，得對(duì)照藥材溶液。吸取上述樣品溶液、對(duì)照藥材溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄層板上，以二甲苯-乙酸乙酯-乙醇-甲酸(10∶3∶0.8∶1)為展開劑，展開，取出晾干，紫外365 nm下檢視。結(jié)果：供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；空白樣品無干擾(圖1)[3]。

圖1 黃芩薄層鑒別圖

注：從左到右依次為空白溶液、供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、供試品溶液和空白溶液

2.2 川芎薄層色譜鑒別 稱取本品3 g，研細(xì)，加二氯甲烷20 mL,加熱回流30 min，濾過，濾液水浴蒸干，用乙醇2 mL溶解，作為供試品溶液；取空川芎樣品3 g，同法制備，得空白空川芎樣品溶液；另取川芎對(duì)照藥材1 g，同法制成為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述樣品溶液、對(duì)照藥材溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(8.5∶0.5)為展開劑，展開，取出晾干，紫外365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)；空白樣品無干擾(圖2)。

2.3 黃芪甲苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Dianmonsil C18(規(guī)格4.6 mm×200 mm;5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(34∶66)；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件：霧化器溫度48 ℃；漂移管溫度為106 ℃；載氣：氮?dú)?；氣體流量為2.50/min。理論塔板數(shù)為2 500。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 供試品溶液的制備 取本品12 g,研細(xì)，混勻，精密稱取9 g,放置索氏提取器中，用100 mL甲醇加熱提取2 h，減壓蒸干甲醇，殘?jiān)铀?5溶解，用30 mL水飽和正丁醇萃取5次，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，20 mL/次，氨試液棄去，正丁醇液減壓蒸干，用乙腈溶解并定容至5 mL量瓶，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.3.2.2 空白樣品溶液的制備 取空黃芪樣品9 g，放置索氏提取器中，用100 mL甲醇加熱提取2 h，同法制備。

2.3.2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷的對(duì)照品適量，加乙腈制成每1 mL含黃芪甲苷約0.35 mg的對(duì)照品溶液。

2.3.3 專屬性試驗(yàn) 分別取上述3種溶液,按照2.3.1色譜條件進(jìn)樣10 μL，結(jié)果對(duì)照品溶液的保留時(shí)間分別約為16 min左右(見圖I)，樣品圖譜在此保留時(shí)間16 min左右同樣發(fā)現(xiàn)有峰(見圖II)，空白樣品在此保留時(shí)間16 min左右沒有相同的峰(見圖III)，陰性樣品無干擾。

圖2 川芎薄層鑒別圖

注：從左到右依次為供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、供試品溶液、空白溶液和供試品溶液

圖3 黃芪甲苷HPLC圖譜

注：對(duì)照品(Ⅰ)、供試品(Ⅱ)和陰性樣(Ⅲ)

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密量取同一對(duì)照品溶液10 μL，按2.3.1分離色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，結(jié)果：黃芪甲苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.12%。

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加乙腈制成每毫升含黃芪甲苷0.702 4 mg的對(duì)照品母液。分別精密移取對(duì)照品母液適量，加乙腈制成每毫升含黃芪甲苷0.035 mg、0.140 5 mg、0.351 2 mg、0.561 9 mg的對(duì)照品溶液。取上述不同濃度黃芪甲苷對(duì)照品溶液按2.3.1分離色譜條件進(jìn)樣10μL，以峰面積自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)樣量自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)X，做回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果：黃芪甲苷：Y=6.309 7+0.792 2X r=0.999 9。表明黃芪甲苷在0.35～7.02 μg的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

2.3.6 穩(wěn)定性考察 取本品，按2.3.2溶液制備項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按2.3.1色譜條件分別在0、2、4、6、8 h內(nèi)測(cè)定黃芪甲苷峰面積，結(jié)果峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.77%。表明供試品溶液在0～8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加乙腈制成每1 mL含黃芪甲苷0.860 4 mg的對(duì)照品母液。取本品顆粒適量(批號(hào)為20150401，黃芪甲苷含量為0.191 5 mg/g)，研細(xì)，分別精密稱取約4.5 g，精密加入對(duì)照品溶液適量，按2.3.2供試品溶液制備項(xiàng)下的方法制備，按2.3.1分離色譜條件測(cè)定，結(jié)果回收率良好。見表1。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品顆粒(批號(hào)為20150401),平行5份，按2.3.2供試品溶液制備項(xiàng)下的方法制備，按2.3.1分離色譜條件測(cè)定，結(jié)果平均含量為每克顆粒含黃芪甲苷0.191 5 mg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.16%。

2.3.9 樣品測(cè)定 取3批不同批號(hào)樣品顆粒(批號(hào)分別為20150401，20150501和20150502)，按2.3.2供試品溶液制備項(xiàng)下的方法制備，按2.3.1分離色譜條件測(cè)定。見表2。

表2 3批樣品黃芪甲苷含量

3 討論

本試驗(yàn)曾經(jīng)采用索氏提取、水浴加熱回流提取、超聲提取等不同提取方法和不同提取時(shí)間以及不同正丁醇提取次數(shù)來提取黃芪甲苷進(jìn)行測(cè)定，含量有高低不同，最后選擇本文章的索氏提取加熱回流的方法，加樣回收率和重復(fù)性符合要求。

黃芪甲苷的含量測(cè)定法有薄層掃描法(TLC)[4-7]，高效液相色譜紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)[8-11]及高效液相色譜蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)[12-17]，由于薄層掃描法(TLC)測(cè)定黃芪甲苷的含量重復(fù)性比較差，紫外檢測(cè)的高效液相法則需要近200 nm的末端吸收波長(zhǎng)測(cè)定，空白干擾大，故本試驗(yàn)采用及高效液相色譜蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)測(cè)定，此方法減少了誤差，重復(fù)性較好，專屬性較強(qiáng)，加樣回收率滿足了含量測(cè)定的要求。

在色譜條件的優(yōu)化過程中，曾分別對(duì)不同流速：0.8～1.2 mL/min，不同流動(dòng)相體系：乙腈-水(32∶68)、乙腈-水(37∶63)等做了系列比較考察，結(jié)果采用乙腈-水(34∶66)作為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，主峰與其他峰能夠達(dá)到基線分離，保留時(shí)間在16 min左右，空白無干擾。因此，本研究采用乙腈-水(34∶66)作為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min。

本試驗(yàn)曾對(duì)麥冬和葛根進(jìn)行薄層鑒別TLC試驗(yàn)，結(jié)果空白樣品均有干擾。

本文以高效液相色譜蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)測(cè)定葛芪顆粒中主要成分黃芪甲苷的含量，以薄層色譜法(TLC)對(duì)黃芩和川芎進(jìn)行鑒別，方法分析條件易于操作，控制精確，3種待測(cè)成分分離度良好，空白均無干擾，重現(xiàn)性較好，為中藥葛芪顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了依據(jù)。

[1]劉桂芳，劉文科，姬航宇,等.2型糖尿病中醫(yī)診療思路[C]//中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院首席研究員學(xué)術(shù)論文集萃，2012.

[2]李潔，安佰海，韓晶.中藥治療動(dòng)脈粥樣硬化的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2014，21(2):227-228.

[3]黃建民.頸動(dòng)脈粥樣硬化的中醫(yī)治療研究進(jìn)展[J].廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，13(3):58-60.

[4]楊榮兵，莫?jiǎng)俚ぃ瑓锹?柴葛洗劑的制備工藝及臨床應(yīng)用研究[J].河北醫(yī)學(xué)，2012，18(6):782-784.

[5]李曉蒙,李曉瑩,徐位良,等.糖康安顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2002,18(3)：169-171.

[6]韓建偉，蘆喜珍，熊麗.薄層掃描法測(cè)定通脈活絡(luò)丸中黃芪甲苷的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，1999，19(11):667-668.

[7]劉金旗,時(shí)文霞,劉勁松,等.薄層掃描法測(cè)定健腦精噴霧劑中黃芪甲甙的含量[J].中藥材,1996,19(10)：529-530.

[8]閻汝南,王靜竹,劉舒平,等.HPLC法測(cè)定黃芪中黃芪甲甙的含量[J].中國(guó)中藥雜志,1998,23(7)：398-399.

[9]孫聰，韓業(yè)超，吳強(qiáng).高效液相色譜法測(cè)定保元清血顆粒中黃芪甲苷含量方法的建立及評(píng)價(jià)[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，38(4):805-808.

[10]趙群濤，楊俊杰，方永凱,等.HPLC-UV測(cè)定歸脾丸(濃縮丸)中酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量[J].中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師，2015，12(9):36-39.

[11]郝新才，趙萌，李澍韜.RP-HPLC法測(cè)定丹桂香顆粒中黃芪甲苷的含量[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，29(1):61-62.

[12]吳永平，徐永梅，曹園,等.HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪提取物中黃芪甲苷的含量[J].中成藥,2001,23(9):673-674.

[13]林雅，施紅.HPLC-ELSD法測(cè)定石斛合劑中黃芪甲苷的含量[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，18(1):31-32.

[14]韓淑萍，孫建宇.HPLC-ELSD測(cè)定補(bǔ)氣口服液中黃芪甲苷含量的方法研究[J].中成藥，2006，28(12):1858-1859.

[15]田景奎，吳麗敏，劉建建,等.HPLC-ELSD測(cè)定芪休顆粒中黃芪甲苷的含量[J].中成藥，2004，26(10):812-814.

[16]趙靈芝，朱丹妮，嚴(yán)永清.HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪中黃芪甲苷的含量[J].藥物分析雜志，1999，19(6):403-406.

StudyonQualityStandardofGeqiGranules

Lyu Lingling1，Zheng Lan1，Xie Song2

(1TCMDepartment，RuijinHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200025，China; 2CentralResearchInstitute，ShanghaiPharmaceuticalsHoldingCo.，Ltd.Shanghai201203，China)

Objective:To develop the quality standard of Geqi granules.MethodsThe identification of Radix Scutellariae and Rhizoma Chuanxiong was used by TLC.Astragaloside IV was analyzed on an HPLC Diamnosil C18column (4.6 mm×250 mm，5 μm) using acetonitrile with water (34:66) as mobile phase，evaporative light-scattering detector.ResultsThe calibration curve was linear in the range of 0.35-7.02 μg，and the average recovery was 99.1%.ConclusionThis method is simple，reliable with good specificity and reproducible，which can be used for the quality control of Geqi granule.

Geqi granules; Astragaloside IV; Radix Scutellariae; Rhizoma Chuanxiong; TLC; HPLC

呂玲玲(1986.04—)，女，碩士研究生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤研究

鄭嵐(1969.07—)，主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療老年病及腫瘤臨床研究，E-mail:windy9453@126.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.051

(2017-09-25收稿 責(zé)任編輯：徐穎)