柯勤勤，羅洋洋，何林凌，胡 強(qiáng)，饒承冬，葉浪，李樹紅，李美良

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014）

草魚魚鱗抗氧化肽的酶法制備及其抗氧化穩(wěn)定性研究

柯勤勤，羅洋洋，何林凌，胡 強(qiáng)，饒承冬，葉浪，李樹紅，李美良*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014）

【目的】采用堿性蛋白酶水解草魚魚鱗制備抗氧化肽，并探討其穩(wěn)定性?！痉椒ā窟\(yùn)用單因素及正交試驗(yàn)對酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行體外抗氧化活性的測定，對酶解得到的抗氧化肽進(jìn)行體外模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn)。【結(jié)果】在優(yōu)化工藝條件下，魚鱗酶解液中羥自由基清除率為88.71%；其體外抗氧化能力隨肽質(zhì)量濃度增大而增大，在濃度為0.5 mg/mL時(shí)，魚鱗抗氧化肽清除DPPH自由基能力達(dá)到Vc的81.1%；對超氧陰離子自由基清除率為98.97%。在胃腸消化前4 h內(nèi)抗氧化活性較穩(wěn)定，之后隨時(shí)間延長抗氧化穩(wěn)定性顯著下降?！窘Y(jié)論】在酶解草魚魚鱗的較佳工藝條件：溫度60℃、料液比1∶15、加酶量800 U/g、時(shí)間3 h下，堿性蛋白酶水解草魚魚鱗制備的抗氧化肽具有良好的抗氧化活性及穩(wěn)定性。

草魚魚鱗；酶解；多肽；抗氧化性；胃腸消化

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年我國草魚年產(chǎn)量已達(dá)到全國淡水魚總產(chǎn)量的18.54%，居淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量首位，約為567.62萬t。而魚鱗約占魚體質(zhì)量3.0%～5.0%[1]，在實(shí)際生產(chǎn)中草魚魚鱗大多以磨成魚粉的形式作為飼料處理[2]，產(chǎn)品附加值極低，大部分被丟棄處理，只有少部分加工成魚飼料再次利用。目前對魚鱗的深加工研究主要有提取膠原蛋白、魚銀、明膠和有機(jī)酸鈣[2-4]等，而關(guān)于草魚魚鱗蛋白抗氧化肽及其胃腸消化穩(wěn)定性方面的研究報(bào)道較少。因此將草魚魚鱗制備出抗氧化肽能提高草魚的附加值，有利于充分利用我國的漁業(yè)資源，具有極為廣闊的市場前景。

有研究證明魚鱗中含有豐富的蛋白質(zhì)、各種礦物質(zhì)、鳥嘌呤和卵磷脂，其中蛋白質(zhì)占魚鱗干重的70%[5]。目前國內(nèi)外對于魚鱗蛋白的研究主要集中在提取工藝上，魚鱗蛋白中含大量疏水性氨基酸，經(jīng)過酶解后，小分子量的肽釋放出來，使酶解物具有較強(qiáng)的抗氧化作用。近些年來，從水產(chǎn)品中制取抗氧化活性肽的研究引起了越來越多的學(xué)者的關(guān)注，國內(nèi)外學(xué)者已從秋刀魚、泥鰍、羅非魚、沙丁魚，鰱魚等魚鱗、魚內(nèi)臟、魚皮及魚骨架等下腳料蛋白酶解液中制備出具有顯著抗氧化活性的肽段[7-11]。目前，國外對各種魚類，比如阿拉斯加青鱈骨架、亞洲銀鯉、黃鰭牛舌魚等來酶解魚肉制備膠原蛋白肽的研究相對于魚鱗等下腳料較多[12-14]，國內(nèi)部分學(xué)者對魚鱗酶解有一定的研究[15-17]。但是對于魚鱗抗氧化肽在人體內(nèi)消化吸收及穩(wěn)定性的研究較少，抗氧化肽在消化過程中胃腸穩(wěn)定性是否遭到破壞，其活性是否下降，是需要解決的問題。而用堿性蛋白酶對草魚魚鱗進(jìn)行水解制取低分子量抗氧化肽并研究體外抗氧化活性及其穩(wěn)定性的研究還鮮有報(bào)道[18]。

本研究旨在探討堿性蛋白酶酶解制備魚鱗抗氧化肽的工藝研究，確定魚鱗抗氧化肽酶法制備的最佳工藝條件。并進(jìn)行體外抗氧化活性的測定及其胃腸消化實(shí)驗(yàn)對其穩(wěn)定性的影響。為其在今后的研究和實(shí)際應(yīng)用中提供理論依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及試劑

草魚魚鱗：采購于四川省雅安市雨城區(qū)農(nóng)貿(mào)市場，清水洗凈，烘干并搗碎備用；堿性蛋白酶（酶活力≥200 U/mg）上海瑞永生物科技有限公司。

福林酚、氫氧化鈉、三氯乙酸、水楊酸、無水乙酸、過氧化氫、鹽酸、脫氧膽酸鈉、酒石酸鉀、抗壞血酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器

可見分光光度計(jì)：V-1100D型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；電子天平：FA1204B型，上海越平科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-8型，天津泰斯特儀器有限公司；pH計(jì)：PHS-3E型，上海佑科儀器儀表有限公司；優(yōu)普系列超純水機(jī)：ULUP-IV-10T型，成都超純科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)：SORVALL Legend MICRO17型），德國ThermoFisher公司；離心機(jī)：SORVALLST16R型，德國ThermoFisher公司。

1.2 方法

1.2.1 草魚魚鱗抗氧化肽的制備

草魚魚鱗→清洗、烘干、搗碎→用超純水溶解，并調(diào)pH值→堿性蛋白酶酶解，在酶解過程中維持pH的穩(wěn)定，酶解結(jié)束后調(diào)至pH=7→滅酶→離心→取上清液備用。

1.2.2 酶解液中的多肽含量的測定

以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用Lowry 法測定[19]。

1.2.3 堿性蛋白酶酶解條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 不同料液比對酶解液的羥自由基清除率和多肽含量的影響

料液比即質(zhì)量體積比（g/mL）可分別設(shè)為1∶10、1∶15、1∶20、1∶30，在加酶量為 800 U/g，pH 值為 9.0，酶解溫度為55℃的條件下恒溫反應(yīng)3 h，滅酶后離心取上清液測多肽含量和羥自由基清除率。

1.2.3.2 不同加酶量對酶解液的羥自由基清除率和多肽含量的影響

加酶量分別設(shè)為 200 U/g、400 U/g、800 U/g、1600 U/g、3200 U/g，在料液比為 1∶30 g/mL，pH 值為 9.0，酶解溫度為55℃的條件下恒溫反應(yīng)3 h，滅酶后離心取上清液測多肽含量和羥自由基清除率。

1.2.3.3 不同酶解時(shí)間對酶解液的羥自由基清除率和多肽含量的影響

酶解時(shí)間分別設(shè)為 2、3、4、5、6 h，在料液比為1∶30 g/mL，pH 值為 9.0，加酶量為 400 U/g，酶解溫度為55℃的條件下恒溫反應(yīng)，滅酶后離心取上清液測多肽含量和羥自由基清除率。

1.2.3.4 不同酶解溫度對酶解液的羥自由基清除率和多肽含量的影響

酶解溫度分別設(shè)為 30、40、50、55、60 ℃，在料液比為1∶30 g/mL，pH值為9.0，加酶量為 400 U/g的條件下恒溫反應(yīng)3 h，滅酶后離心取上清液測多肽含量和羥自由基清除率。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響酶解反應(yīng)的重要因素有加酶量、料液比、溫度、時(shí)間及pH值等。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取料液之比（A）、酶解時(shí)間（B）、酶解溫度（C）、加酶量（D）各因素的3個(gè)水平，以魚鱗酶解液的羥自由基清除率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)確定各因素的較佳條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 堿性蛋白酶制備魚鱗抗氧化肽的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Scales antioxidant peptides prepared by alkaline proteasein the orthogonal array design

1.2.5 羥自由基清除能力的測定

參考徐懷德等[19]方法并適當(dāng)改進(jìn)。在試管中分別加入0.3mL 1.8mmol/L水楊酸-乙酸溶液、0.2mL已知濃度的酶解液、0.4mL 1.8mmol/L FeSO4溶液，最后加入0.02mL含量為0.03%的H2O2，振蕩混合均勻，37℃水浴反應(yīng)30min，于510 nm處測定吸光值A(chǔ)s；取0.2mL超純水代替酶解液，測得的吸光度為A0。羥自由基的清除率D表示為：。

1.2.6 超氧陰離子自由基清除能力的測定

參照PanX.[20]等方法并適當(dāng)改進(jìn)。取0.0252mol/L NBT（氯化硝基四氮唑藍(lán)）溶液1mL，6.24 mol/L NADH（還原型輔酶）溶液1mL與1mL不同濃度樣品溶液混合均勻，并加入1mL濃度為0.12mmol/L的PMS（吩嗉硫酸甲酯）溶液啟動反應(yīng)，混合均勻后于25℃恒溫水浴準(zhǔn)確反應(yīng)5min，用超純水作參比，同時(shí)以相同濃度的Vc代替酶解液作為對照，于560 nm處測定吸光值。超氧陰離子清除率按下式計(jì)算：

式（1）中：A0為不含酶解液的吸光值；A1為含有酶解液的吸光值。

1.2.7 DPPH·自由基清除能力的測定

參考張尊聽等[21]方法并適當(dāng)改進(jìn)。將已知濃度的酶解液0.5mL及0.5mL 1×10-4mol/L DPPH·溶液（用無水乙醇配制）加入同一具塞試管中搖勻，室溫下避光靜置20min，然后4000 r/min離心10min，用95%乙醇調(diào)零于517 nm波長下測定吸光度。同時(shí)以相同濃度的Vc代替酶解液，作為對照。

式（2）中：A1為含有酶解液和DPPH·溶液的吸光值；A2為含有酶解液和95%乙醇溶液的吸光值；A0為含有DPPH·溶液和超純水的吸光值。

1.2.8 體外模擬胃腸連續(xù)消化實(shí)驗(yàn)

參照劉珊珊等方法[22-23]并適當(dāng)改進(jìn)。取250mL（mg/mL）魚鱗抗氧化肽凍干物溶于0.01 mol/L鹽酸溶液中（pH=2.0），取0.005 g胃蛋白酶加入0.01 mol/L鹽酸溶液中，配置胃蛋白酶溶液1mL（pH=2.0）。將9mL的魚鱗小肽溶液與1mL的胃蛋白酶溶液分別置于37℃保溫10min后，將其混合均勻，置于37℃恒溫水浴振蕩器中模擬胃消化2 h。待胃消化結(jié)束后，將消化液pH值調(diào)至7.5。添加0.4 g的胰蛋白酶和糜蛋白酶并混合均勻，于37℃恒溫水浴振蕩器中模擬腸消化4 h。在胃腸消化反應(yīng)階段每隔1 h（即0、1、2、3、4、5、6 h）取 1 次消化液。每次取出的消化液樣品，置于沸水浴中滅酶10min，冷卻至室溫，并將其pH值調(diào)至7.0，冷凍保存于-20℃，備用。

1.2.9 抗氧化性測定

取上一步中的消化液用Lorry法測蛋白濃度，并配成相同濃度的消化液，測定其羥基自由基清除率、超氧陰離子清除率，方法同1.2.5、1.2.6。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

采用Excel 2010對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行最小顯著極差（LSR）分析，結(jié)果取3次試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對魚鱗蛋白酶解液清除羥基自由基效果的影響

如圖1所示，隨著料液比的增大，酶解液中的多肽含量及羥自由基清除率呈先下降再上升，多肽含量最后又呈上升趨勢，其含量最高時(shí)，羥自由基清除率卻非最高。當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，酶解液對羥自由基清除能力最強(qiáng)，清除率達(dá)到91.71%。實(shí)驗(yàn)表明，料液比并非越小越好，料液比過小，單位體積內(nèi)分子過大，難以與酶充分接觸，因此從經(jīng)濟(jì)角度考慮，取料液比為 1∶15、1∶20、1∶30 作為正交試驗(yàn)考察水平。

2.2 加酶量對魚鱗蛋白酶解效果的影響

圖1 料液比對酶解液清除羥基自由基的影響Figure 1 The effect of ratio of solid to liquid onelimination ratio of hydroxyl radicals by enzymatic hydrolysate

由圖2可知，隨著加酶量的增大，多肽含量與羥自由基清除率均呈先上升再下降再上升再下降的趨勢，當(dāng)加酶量為400 U/g時(shí)，酶解液對羥自由基清除能力最強(qiáng)，達(dá)到94.51%。在加酶量為800 U/g時(shí)多肽含量較低，而在1600 U/g時(shí)多肽含量達(dá)到了最高值，但隨著加酶量的增加多肽含量呈下降趨勢，可能是部分肽段被水解成氨基酸所致。因此，隨著加酶量的增加，酶解液中的多肽含量和羥自由基清除率的變化趨勢基本相同，說明對羥自由基的清除作用主要來源于魚鱗酶解液中的多肽。根據(jù)結(jié)果分析，取加酶量為 200 U/g、400 U/g、800 U/g作為正交試驗(yàn)考察水平。

圖2 加酶量對酶解液清除羥基自由基的影響Figure 2 The effect of enzyme additionon elimination ratio of hydroxyl radicals by enzymatic hydrolysate

2.3 酶解時(shí)間對魚鱗蛋白酶解效果的影響

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長，多肽含量呈先下降再上升再下降的趨勢，羥自由基清除率呈先上升再下降的趨勢。當(dāng)酶解時(shí)間為2 h時(shí)，酶解液對羥自由基清除能力最強(qiáng)，達(dá)到99.18%。實(shí)驗(yàn)表明，在前4 h，羥自由基清除率、酶解液中多肽含量都隨著酶解的進(jìn)行變化幅度較大，但酶解時(shí)間超過4 h后，酶解液中多肽含量隨著酶解時(shí)間延長而逐漸下降，對羥自由基的清除作用也隨之下降。可能是因?yàn)樵诜磻?yīng)的開始階段，酶活力高，酶切位點(diǎn)多，水解效率高，水解度顯著增大，隨著酶解時(shí)間的延長，反應(yīng)產(chǎn)物濃度增加，底物濃度減少，反應(yīng)速率降低，水解趨于平緩，多肽被繼續(xù)水解成氨基酸，此時(shí)羥基自由基的清除率逐漸降低，說明魚鱗抗氧化活性主要來源于小分子肽，與前面的結(jié)論一致。因此，取酶解時(shí)間為2、3、4 h作為正交試驗(yàn)考察水平。

圖3 酶解時(shí)間對酶解液清除羥基自由基的影響Figure 3 The effect of enzymolysis timeon elimination ratio of hydroxyl radicals by enzymatic hydrolysate

2.4 酶解溫度對魚鱗蛋白酶解效果的影響

酶解溫度對魚鱗蛋白酶解效果見圖4，隨著溫度的升高，酶解液中的多肽含量呈先下降再上升再下降的趨勢，羥自由基清除率呈先下降再上升再下降的趨勢。當(dāng)酶解溫度為55℃時(shí)，酶解液對羥自由基清除能力最強(qiáng)，達(dá)到97.19%。由于本實(shí)驗(yàn)中所選用的堿性蛋白酶，其最適酶解溫度范圍為50～60℃。因此在一定的溫度范圍內(nèi)，酶的活性會隨著溫度升高而增加，多肽含量也會隨之增加，但超過酶的最適溫度范圍時(shí)，酶將逐漸失去活性，多肽含量也會隨之降低，對羥基自由基的清除率也會下降。說明溫度間接影響著酶解液對羥基自由的清除能力。根據(jù)如上結(jié)果，取溫度為50、55、60℃作為正交試驗(yàn)考察水平。

圖4 酶解溫度對酶解液清除羥基自由基的影響Figure 4 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on elimination ratio of hydroxyl radicals by enzymatic hydrolysate

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳工藝

在初步單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量以及料液比為主要影響因素，pH設(shè)定為9.0。通過L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，確定魚鱗蛋白酶解最佳工藝條件。具體影響因素和實(shí)驗(yàn)水平見表2。

表2 工藝條件確定正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental results

由表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，對酶解效果的影響程度大小順序?yàn)椋篋＞B＞A＞C，即：加酶量＞酶解時(shí)間＞料液比＞酶解溫度。故根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，在pH值一定條件下，最終確定堿性蛋白酶水解草魚魚鱗制取抗氧化肽的最佳酶解工藝條件為A1B2C3D3，即溫度60℃、加酶量800 U/g、時(shí)間3 h、料液比1∶15。在此酶解條件下測得魚鱗抗氧化肽的濃度為0.1 mg/mL，此時(shí)羥自由基的清除率最高為88.71%。

2.5.1 超氧陰離子自由基清除能力

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳提取條件，酶解得到草魚魚鱗抗氧化肽?？疾祠~鱗抗氧化肽在不同質(zhì)量濃度時(shí)對鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除能力，并與陽性對照Vc進(jìn)行比較，結(jié)果如圖5所示。

超氧陰離子在生物體系中是細(xì)胞氧化反應(yīng)的第一步產(chǎn)物，隨后被分解為羥基自由基、過氧化氫及氧分子。而且超氧陰離子自由基是引起脂肪過氧化反應(yīng)的重要因素，因此從生物體系中或者脂質(zhì)含量豐富的食品中清除超氧陰離子自由基是非常重要的。由圖5可知，當(dāng)質(zhì)量濃度小于0.2 mg/mL時(shí)，魚鱗抗氧化肽對超氧陰離子自由基的清除能力與質(zhì)量濃度呈一定的量效關(guān)系，清除率隨著魚鱗抗氧化肽的質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大。當(dāng)魚鱗抗氧化肽的質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到98%以上，接近于同質(zhì)量濃度的Vc的清除率。與Vc相比，魚鱗抗氧化肽呈現(xiàn)出較好的抗氧化活性。說明草魚魚鱗抗氧化肽在清除超氧陰離子自由基方面有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖5 魚鱗抗氧化肽的超氧陰離子自由基清除能力Figure 5 The superoxide anion radical scavenging capacity of antioxidant peptides from fish scale

2.5.2 DPPH·自由基清除能力

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳提取條件，酶解得到草魚魚鱗抗氧化肽?？疾祠~鱗抗氧化肽在不同質(zhì)量濃度時(shí)對DPPH·自由基的清除能力，并與陽性對照Vc進(jìn)行比較，結(jié)果如圖6所示。

圖6 魚鱗抗氧化肽的DPPH·自由基清除能力Figure 6 The DPPH radical scavenging capacity of antioxidant peptides from fish scale

在評價(jià)化合物抗氧化性指標(biāo)中，DPPH·自由基清除實(shí)驗(yàn)是一種傳統(tǒng)、受歡迎的方法，其溶液呈現(xiàn)紫紅色，在波長517 nm處有特征吸收峰。當(dāng)在DPPH·溶液中加入抗氧化劑時(shí)，其顏色會變成淡黃色或者無色，在517 nm處的吸收峰就會減弱。由圖6可知，對DPPH·自由基的清除率隨魚鱗抗氧化肽的濃度的增加而增大，說明魚鱗抗氧化肽對DPPH·自由基的清除能力與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。當(dāng)濃度從0.05 mg/mL增加到0.5 mg/mL時(shí)，魚鱗抗氧化肽對DPPH·自由基的清除率迅速上升到78.34%，而在相同濃度范圍內(nèi)，Vc對DPPH·自由基的清除率則基本保持在96%以上。在相同濃度水平下，魚鱗抗氧化肽有一定的DPPH·自由基清除能力，但相對于Vc來說還有一定的差距。說明魚鱗抗氧化肽的抗氧化活性小于Vc。有研究表明DPPH·清除能力與蛋白質(zhì)水解程度和具有高疏水性氨基酸的小肽有關(guān)[24]，因此，草魚魚鱗酶解液中所含的小肽物質(zhì)能作為很好的質(zhì)子供體，與自由基發(fā)生反應(yīng)，使其生成穩(wěn)定的物質(zhì)；同時(shí)可以終止自由基連鎖反應(yīng)，達(dá)到抗氧化的作用。

2.6 抗氧化肽的活性在胃腸連續(xù)消化過程中的變化

由圖7可知，經(jīng)胃蛋白酶消化后，超氧陰離子清除率在前2 h內(nèi)，隨著消化時(shí)間延長而增大，加入糜蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行腸消化后，清除率先增大后緩慢下降，消化6 h后超氧陰離子清除率急劇下降；產(chǎn)生這種結(jié)果可能是因?yàn)樵谇? h內(nèi)，經(jīng)胃腸消化，部分多肽降解為小分子肽，暴露出較多的活性基團(tuán)，與自由基發(fā)生反應(yīng)的機(jī)會增多，有利于其抗氧化活性的提高，同時(shí)小肽的進(jìn)一步釋放也有利于人體的吸收，在這個(gè)過程中，胃腸消化是對超氧陰離子清除能力是有益的，此時(shí)超氧陰離子清除率達(dá)到100%，增加了1.29%。消化4 h后，超氧陰離子清除率顯著下降，可能是因?yàn)樵诘鞍酌傅淖饔孟?，小肽繼續(xù)分解為氨基酸，導(dǎo)致其抗氧化活性減弱。

圖7 魚鱗抗氧化肽超氧陰離子自由基清除能力隨胃腸消化時(shí)間變化的曲線Figure 7 Changes of scavenging reactiveoxygen radical scavenging activity of grass carp fish scales peptide during gastrointestinal digestion

在圖8中，魚鱗抗氧化肽經(jīng)過胃腸消化后，羥基自由基清除率隨著消化時(shí)間延長顯著降低，此時(shí)羥基自由基清除率降低了13.57%，說明胃腸消化對羥基自由基清除能力是不利的。在這個(gè)過程中腸消化作用比胃消化作用更強(qiáng)，對分子的降解作用更顯著，且對抗氧化活性影響更顯著，這與顧敏[25]等研究結(jié)果相符。

圖8 魚鱗抗氧化肽羥基自由基清除能力隨胃腸消化時(shí)間變化的曲線Figure 8 Changes of hydroxyl radical scavenging activity of grass carp fish scales peptide during gastrointestinal digestion

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化魚鱗多肽含量及羥基自由基清除率，得出草魚魚鱗酶解最佳工藝條件為溫度60℃、加酶量800 U/g、時(shí)間3 h、料液比1∶15。此時(shí)草魚魚鱗抗氧化肽的濃度為0.1 mg/mL，羥基自由基的清除率效果最好，達(dá)到88.71%。

隨著抗氧化肽濃度的增加其DPPH自由基清除能力和超氧陰離子清除能力增大，在濃度為0.5 mg/mL時(shí)，魚鱗抗氧化肽清除DPPH自由基能力達(dá)到Vc的81.1%；對超氧陰離子自由基清除率為98.97%。在體外模擬胃腸連續(xù)消化前4 h過程中，胃腸消化是對超氧陰離子清除能力是有益的，其抗氧化穩(wěn)定性較好；消化4 h后，隨時(shí)間延長活性顯著下降，而在整個(gè)消化過程中胃腸消化對羥基自由基清除能力是不利的。

［1］農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局.中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒［Z］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2014.

［2］杜云建，趙玉巧，李念念.酶解法制備草魚魚鱗多肽及其清除羥自由基的研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（7）：168-172.

［3］王希搏.魚鱗有機(jī)酸鈣、膠原蛋白及膠原多肽聯(lián)產(chǎn)工藝與工廠設(shè)計(jì)［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［4］盧昭.草魚魚鱗膠原蛋白提取分離工藝的研究［D］.合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［5］張俊杰，曾慶孝.魚鱗的開發(fā)利用前景［J］.中國水產(chǎn)，2004（5）：74-75.

［6］劉丹.秋刀魚蛋白抗氧化肽的分離純化及其抗疲勞功效研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2015.

［7］游麗君.泥鰍蛋白抗氧化肽的分離純化及抗疲勞、抗癌功效研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2010.

［8］郭瑤.羅非魚皮膠原肽的制備及其抗氧化活性的研究［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2006.

［9］MORALES-MEDINA R，TAMM F，GUADIX A M，et al.Functional and antioxidant properties of hydrolysates of sardine（S.pilchardus） and horse mackerel（T.mediterraneus） for the microencapsulation of fish oil by spray-drying［J］.Food Chemistry，2016，194：1208-1216.

［10］何娟，程曉鳳，羅永康，等.鰱魚皮抗氧化肽水解用酶的篩選研究［J］.食品科技，2017（3）：135-140.

［11］JE J Y，PARK P J，KIM S K.Antioxidant activity of a peptide isolated from Alaska pollack （Theragra chalcogramma）frame protein hydrolysat［eJ］.BmjClinicalResearch，1993，307（6909）：45-50.

［12］MENDIS E，RAJAPAKSE N，KIM S K.Antioxidant properties of a radical-scavenging peptide purified from enzymatically prepared fish skin gelatin hydrolysate.［J］.Journal of Agricultural&Food Chemistry，2005，53（3）：581-587.

［13］GIMéNEZ B，ALEMáN A，MONTERO P，et al.Antioxidant and functional properties of gelatin hydrolysates obtained from skin of sole and squid［J］.Food Chemistry，2009，114（3）：976-983.

［14］劉慶慧，王采理，張培新，等.魚鱗酶解工藝的研究［J］.漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，1998（2）：76-80.

［15］陳季旺，夏文水，黃愛妮，等.魚降壓肽的酶法制備工藝及其理化性質(zhì)［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2007，31（4）：512-517.

［16］涂宗財(cái)，鄭明，陳鋼，等.酶解魚鱗蛋白制備抗氧化肽的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009（7）：202-203.

［17］楊立，鄒波，李玓瓅，等.魚鱗抗氧化肽的酶法制備工藝及特性［J］.食品科學(xué)，2011，32（12）：115-119.

［18］付玉梅，許錦珍，廖群，等.Lowry法測定寡肽的研究［J］.藥物分析雜志，2011，31（4）：739-741.

［19］徐懷德，殷金蓮，陳沁.甲魚酶解產(chǎn)物抗氧化功能的研究［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2007，7（4）：25-32.

［20］PAN X，ZHAO Y，HU F，et al.Preparation and identification of antioxidant peptides from protein hydrolysate of skate（Raja porosa） cartilage［J］.Journal of Functional Foods，2016，25：220-230.

［21］張尊聽，楊伯倫，劉謙光，等.野葛根異黃酮成分的超聲萃取及抗氧化作用［J］.食品科學(xué)，2002，23（5）：31-33.

［22］劉珊珊，敖靜，謝寧寧，等.酪蛋白抗氧化肽的胃腸消化穩(wěn)定性研究［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2014，14（2）：47-54.

［23］劉萍.休閑魚肉粒的體外消化模擬及其產(chǎn)物抗氧化效果評價(jià)［J］.食品與機(jī)械，2014，30（6）：135-138.

［24］KTARI N，JRIDI M，BKHAIRIA I，et al.Functionalities and antioxidant properties of protein hydrolysates from muscle of zebra blenny（Salaria basilisca）obtained with different crude protease extract［sJ］.Food Research International，2012，49（2）：747-756.

［25］顧敏.青養(yǎng)蛋白抗氧化肽的分離純化及胃腸道消化特性研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2014.

Enzymatic Preparation and Antioxidant Stability of the Peptide Extracted from Scales of Grass Carp

KE Qin-qin，LUO Yang-yang，HU Qiang，RAO Cheng-dong，YE Lang，LI Shu-hong，LI Mei-liang*
（College of Food Science,Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，Sichuan，China）

【Objective】In this paper，antioxidant peptides was hydrolyzed from grass carp fish scale by the alkaline protease，and its stability was discussed.【Methods】Optimum hydrolysis condition of alcalase enzyme was investigated with single factor experiment and orthogonal experiment and antioxidant peptides obtained by enzymatic hydrolysis were tested in vitro antioxidant and gastrointestinal digestion experiment.【Results】The polypeptide content's scavenging rates against hydroxyl free radicals was 88.71%under the optimal conditions.The antioxidant capacity decreased with the increasing of peptide mass concentration.When the concentration was 0.5 mg/mL，scale antioxidant peptide on DPPH radical scavenging capacity reached 81.1%of Vc and its clearance rates against superoxideanion free radicals was 98.97%.In the gastrointestinal digestion process，the antioxidant activity was stable in the first 4 hours；after 4 hours，anti oxidative stability declined significantly with the time increasing.【Conclusion】The results showed that the optimum values of temperature，enzyme dosage，solidto-water ratio and reaction time were 60 ℃，1∶15（g/mL），800 U/g and 3 hours；under these conditions,antioxidant peptides preparaed by alkaline protease hydrolysis of grass carp fish scales have good antioxidant activity and stability.

grass carp fish scales；hydrolysis；polypeptide；antioxidant activity；gastrointestinal digestion

TS254.9

A

1000-2650（2017）03-0433-06

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.03.023

2017-05-18

四川省教育廳項(xiàng)目“鰱、草下腳料中活性肽的純化及其鐵螯合物的制備研究”（項(xiàng)目編號：14ZB0010）。

柯勤勤，在讀研究生。*責(zé)任作者：李美良，博士，副教授，主要從事水產(chǎn)品加工理論與技術(shù)研究，E-mail：liml@sicau.edu.cn。

（本文審稿：張?jiān)扑?；?zé)任編輯：秦碧雯；英文編輯：劉益平）