鄭培，王儒，周敏

(海南省食品藥品檢驗(yàn)所?？诜炙?，海南 ?？?570311)

UPLC-MS/MS 同時(shí)測(cè)定5種南藥中藥材中10種農(nóng)藥殘留

鄭培，王儒，周敏

(海南省食品藥品檢驗(yàn)所海口分所，海南 ?？?570311)

目的建立同時(shí)測(cè)定廣藿香、益智、巴戟天、肉豆蔻、丁香等5種南藥中常見的10種農(nóng)藥殘留的方法。方法采用安捷倫1290-6460超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)。色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)，柱溫40℃，梯度洗脫，流速0.4 mL/min；采用電噴霧離子源(AJS ESI)，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)掃描方式。結(jié)果10種農(nóng)藥檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.5～100 μg/kg(r＞0.998 6)，各被測(cè)物質(zhì)的方法定量限(LOQ)為0.005～0.1 μg/kg，加樣回收率范圍為72.8%～108.8%。結(jié)論所建立的方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度及靈敏度高、專屬性好，可用于5種南藥中藥材中常見的10種農(nóng)藥殘留的測(cè)定。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；農(nóng)藥殘留；廣藿香；益智；巴戟天；肉豆蔻；丁香

廣藿香、益智、巴戟天、肉豆蔻、丁香是主產(chǎn)于海南的5種重要中藥材，但是由于在種植、生產(chǎn)過程中缺乏嚴(yán)密的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)的檢測(cè)手段，農(nóng)殘的污染已成為制約其走向國際草藥市場(chǎng)的主要障礙[1-3]。目前超液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MC/MS)聯(lián)用技術(shù)已成為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的主要檢測(cè)技術(shù)，在食品、環(huán)境等領(lǐng)域的農(nóng)藥殘留分析中已得到廣泛應(yīng)用，然而對(duì)中藥材尤其是南藥中農(nóng)藥殘留的分析報(bào)道卻相對(duì)較少。本研究采用UPLC-MS/MS色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)5種南藥中常見的10種農(nóng)藥殘留進(jìn)行了檢測(cè)，旨在建立一種快速、有效的檢測(cè)方法，以便對(duì)其種植、生產(chǎn)和流通中的質(zhì)量進(jìn)行控制，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，保障公眾用藥安全[4-7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備 安捷倫1290-6460超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)，安捷倫MassHunter工作站。PL-1001L型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，3-18K型高速離心機(jī)(德國西格瑪公司，最高轉(zhuǎn)速18 000 r/min，離心半徑8.30 cm)，KQ-600TDE型超聲波清洗機(jī)(超聲頻率80 KHz，超聲功率700 W)，IKA T25 型均質(zhì)器(速度范圍[1/min]：6 500-24 000)，R-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)，MV5型全自動(dòng)平行氮吹濃縮儀(美國LabTech公司)。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品、試劑與材料 (1)標(biāo)準(zhǔn)品：治螟磷(批號(hào) 201612)、樂果(批號(hào) 201612)、馬拉硫磷(批號(hào)201612)、三唑磷(批號(hào)201612)、啶蟲脒(批號(hào)201612)，均購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所。三唑酮(批號(hào)201612)、辛硫磷(批號(hào)201612)、吡蟲啉(批號(hào)201612)均購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心。滅多威(批號(hào)160551)、克百威(批號(hào)160929)購自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。(2)試劑：甲醇、乙腈、甲苯、環(huán)己烷、異辛烷、(均為色譜純，購自德國Merck公司)、氯化鈉(分析純)、無水硫酸鈉(650℃灼燒4 h，貯于干燥器中，冷卻后備用)，超純水。(3)材料：Cleanert TPH固相萃取柱：10 mL 2.0 g。

1.1.3 樣品 廣藿香、益智、巴戟天、肉豆蔻、丁香樣品均購自海南壽南山參業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜條件 色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)；進(jìn)樣量：4 μL；柱溫：柱溫40℃；流速：0.4 mL/min；流動(dòng)相：A：0.1%甲酸+5 mM甲酸銨水溶液；B：0.1%甲酸+5 mM甲酸銨水甲醇溶液，梯度洗脫程序(見表1)。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件 安捷倫1290-6460超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)，電噴霧離子化方式(AJS ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描模式(動(dòng)態(tài)MRM)，Agilent Mass Hunter軟件用于定性和定量分析。干燥氣和霧化器均為氮?dú)猓稍餁鉁囟?00℃，干燥氣流量9 L/min，霧化器壓力35 psi，鞘流氣溫度350℃，鞘流氣流量12 L/min，毛細(xì)管電壓4 000 V(+)，3 500 V(-)，噴嘴電壓 0 V。MRM 參數(shù)見表 2，TIC及MRM色譜圖見圖1和圖2。

表2 10種被測(cè)物質(zhì)的MRM質(zhì)譜分析參數(shù)

圖1 MRM色譜圖

圖2 TIC色譜圖

1.2.3 溶液的制備

1.2.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取治螟磷、樂果、馬拉硫磷、三唑酮、三唑磷、滅多威、克百威、啶蟲脒、辛硫磷、吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇配成濃度均為1.0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，-20℃保存，備用。

1.2.3.2 供試品溶液的制備 (1)提?。悍謩e稱取廣藿香、益智、巴戟天、肉豆蔻、丁香試樣2g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，15 000 r/min勻漿提取1 min，加入2 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，1 0 000 r/min離心5 min，取全部上清液于150 mL雞心瓶中，在離心管中再加入15 mL乙腈，重復(fù)勻漿提取1 min，10 000 r/min離心5 min，取全部上清液與之前的提取液合并，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2 mL。(2)凈化：將溶液轉(zhuǎn)移至Cleanert TPH固相萃取柱(柱上加入約2 cm高無水硫酸鈉，先用10 mL乙腈-甲苯(3+1)溶液預(yù)洗柱)，容器用2 mL乙腈-甲苯溶液(3+1)洗滌2次，合并洗液置于Cleanert TPH固相萃取柱上，用25 mL乙腈-甲苯溶液(3+1)洗脫并用雞心瓶接收洗脫液，洗脫液于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至2 mL，將濃縮液置于全自動(dòng)平行氮吹濃縮儀上吹干，加入1 mL的乙腈-水溶液，混勻，0.2μm濾膜過濾。

2 結(jié) 果

2.1 線性關(guān)系與定量限 精密量取1.2.3項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，逐倍稀釋，依次得到0.5 ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL等6個(gè)系列濃度的混合對(duì)照溶液，按2.1項(xiàng)下的條件測(cè)定，得到各被測(cè)物質(zhì)的線性范圍及回歸方程相關(guān)系數(shù)，同時(shí)將0.5 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液不斷稀釋后測(cè)定，以信噪比為10確定各被測(cè)物質(zhì)的定量限(LOQ)，見表3。結(jié)果表明，10種被測(cè)物質(zhì)的線性范圍為0.5～100 ng/mL，相關(guān)系數(shù)r值為0.998 6～0.999 9，定量限為 0.005～0.1 μg/mL，各成分在線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，線性范圍和定量限滿足檢測(cè)的要求。

表3 10個(gè)化合物的線性回歸方程、線性范圍及定量限(LOQ)

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取濃度為10 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h進(jìn)樣，測(cè)得治螟磷、樂果、馬拉硫磷、三唑酮、三唑磷、滅多威、克百威、啶蟲脒、辛硫磷、吡蟲啉面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD值)分別為1.3%、1.9%、1.6%、1.1%、1.4%、0.8%、1.2%、0.9%、1.5%、2.0%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn) 取5種中藥材各6份，分別精密加入低、高兩個(gè)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品(4.0 μg/kg、40.0 μg/kg)，按 1.2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定。計(jì)算各成分的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，見表4。結(jié)果表明：10種被測(cè)物質(zhì)的平均回收率為72.8%～108.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～4.8%，符合試驗(yàn)要求。

表4 回收率考察結(jié)果(n=6)

3 討 論

近年來，由于缺乏嚴(yán)密的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)檢測(cè)手段，在中藥材種植過程中超范圍超劑量使用農(nóng)藥的現(xiàn)象呈上升的趨勢(shì)，隨著更加嚴(yán)格的國際農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)，我國出口的中藥產(chǎn)品農(nóng)殘超標(biāo)的事件時(shí)有發(fā)生，甚至被檢測(cè)出了克百威、三唑磷等劇毒、高毒的農(nóng)藥，不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重影響了我國中藥產(chǎn)品的聲譽(yù)，中藥材中農(nóng)藥殘留的問題已經(jīng)引起了國內(nèi)外的普遍關(guān)注[8-10]。

本實(shí)驗(yàn)建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)方法，可在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)5種南藥中藥材中的10種農(nóng)藥殘留量。研究結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便，靈敏度夠高，分析速度快，精密度、穩(wěn)定性好，適用于中藥材中的多種農(nóng)藥殘留檢測(cè)，為南藥的種植和生產(chǎn)提供了質(zhì)量控制的技術(shù)方法和科學(xué)研究的依據(jù)，也為其農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了參考。

[1]符乃光,張俊清,賴偉勇,等.海南廣藿香等四種南藥的有機(jī)氯農(nóng)藥殘留含量現(xiàn)狀研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2005,16(8):730-731.

[2]張俊清,符乃光,賴偉勇,等.海南檳榔等4種南藥農(nóng)殘含量現(xiàn)狀研究[J].中國藥學(xué)雜志,2005,40(6):460-462.

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[6]郭興杰,安芳,林麗娜.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)與中藥現(xiàn)代化[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2009,11(1):142-146.

[7]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì),國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB 23200.11-2016桑枝、金銀花、枸杞子和荷葉中413種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016.

[8]綠色和平組織.藥中藥——中藥材農(nóng)藥污染調(diào)查報(bào)告[R/OL].[2015-08-18].

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[10]錢韻旭.國外新農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)對(duì)中藥出口的影響及對(duì)策研究[D].沈陽:沈陽藥科大學(xué),2014.

Simultaneous determination of ten pesticide residues in five Chinese medicinal materials by UPLC-MS/MS.

ZHENG Pei,WANG Ru,ZHOU Min.Haikou Branch of Hainan Provincial Institute for Drug and Food Control,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo establish a method for simultaneous determination of 10 pesticide residues in five Chinese medicinal materials(Pogostemon cablin,Alpinia oxyphylla,Morinda officinalis,Myristica fragrans,Syzygium aromaticum).MethodsThe Agilent 1 290-6 460 ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry analysis of enzymatic assays(UPLC-MS/MS),Agilent Jet Stream electrospray ionization(AJS ESI),multiple reaction monitoring(MRM),Agilent MassHunter software were used to peform qualitative and quantitative analysis.ResultsThe linear ranges of 10 pesticide residues was 0.5-100 μg/kg(r＞0.9986),and the limit of quantity(LOQ)was 0.005-0.1 μg/kg,while the recovery rate was 72.8%-108.8%.ConclusionUPLC-MS/MS method is simple,sensitive,and accurate,which can be used for the determination of 10 pesticide residues in Pogostemon cablin,Alpinia oxyphylla,Morinda officinalis,Myristica fragrans,Syzygium aromaticum.

Ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry analysis of enzymatic assays(UPLC-MS/MS);Pesticide residues;Pogostemon cablin;Alpinia oxyphylla;Morinda officinalis;Myristica fragrans;Syzygium aromaticum

R28

A

1003—6350（2017）20—3352—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.20.028

鄭培。E-mail：12123089@qq.com

2017-07-18)