王 政,張大偉,齊長海,黃其田,袁 江

(青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司,山東 青島 266061)

3種中藥提取物對雞盲腸微生物體外發(fā)酵特性的影響

王 政*,張大偉,齊長海,黃其田,袁 江

(青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司,山東 青島 266061)

試驗旨在用體外發(fā)酵技術(shù)評價3種中藥提取物對雞盲腸微生物發(fā)酵特性的影響.以白羽肉雞盲腸食糜為接種物,設(shè)置3個試驗組和1個對照組,3個試驗組分別以大蒜、馬齒莧和黃柏水提物為發(fā)酵底物,中藥水提物的添加水平為0.5 mg/mL,對照組無發(fā)酵底物,每個處理3個重復(fù),37℃體外發(fā)酵24 h,測定微生物數(shù)量、pH、氨態(tài)氮(NH3‐N)和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量.結(jié)果顯示:大蒜組大腸桿菌(E. coli)數(shù)量顯著低于其他各組,而乳酸桿菌數(shù)量顯著高于其他各組(P<0.05).大蒜組乙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)生成水平顯著高于其他各組(P<0.05),但其支鏈VFA/TVFA、pH、NH3‐N含量顯著低于其他各組(P<0.05).以上結(jié)果表明:大蒜水提物具有促進(jìn)乳酸桿菌生長、提高腸道微生物代謝活性的潛在益生作用.

中藥提取物;白羽肉雞;盲腸微生物;體外發(fā)酵

我國擁有豐富的中藥資源,中藥中含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、脂類、纖維素等營養(yǎng)成分,以及萜類、黃酮類、皂甙類和生物堿等活性物質(zhì)[1].動物胃腸道微生物區(qū)系的平衡對維持動物健康起著重要作用,尋找具有改善動物腸道微生物區(qū)系、促進(jìn)動物腸道健康的天然中藥一直是動物營養(yǎng)領(lǐng)域的研究熱點.大蒜為半年生草本植物,百合科蔥屬,以鱗莖入藥,大蒜提取物的主要成分是大蒜素(二烯丙基硫醚)[2],具有抗菌、提高動物免疫力的作用;馬齒莧為一年生草本植物,馬齒莧屬,全草可入藥,馬齒莧含有豐富的植物多糖、黃酮、皂甙和維生素,具有清熱利濕、解毒消腫、去除自由基和抗氧化的功效;黃柏為蕓香科植物黃檗或黃皮樹的干燥樹皮,其主要活性成分為生物堿,其中小檗堿是含量最高的生物堿,具有抗菌消炎的作用.本文通過對大蒜、馬齒莧和黃柏水提物對雞盲腸微生物體外發(fā)酵特性的影響試驗,篩選出具有改善動物腸道微生物區(qū)系、提高微生物代謝活性的中藥提取物,為實際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 底物、培養(yǎng)基及接種物制備 底物為大蒜水提物、馬齒莧水提物和黃柏水提物(西安瑞盈生物科技有限公司生產(chǎn),有效含量均為10%).培養(yǎng)基的配制參考Barry等[3]操作方法:1 000 mL含9.240 g NaHCO3,0.470 g NaCl,0.100 g Na2SO4,7.125 g Na2HPO4.12H2O,0.450 g KCl,0.055 g CaCl2,0.047 g MgC12,3.680 g FeSO4.7H2O,1.900 g MNSO4.7H2O, 0.440 g ZNSO4.7H2O,0.120 g CoCl2.6H2O,98 mg CuSO4.5H2O, 17.4 mg Mo7(NH4)6O24.4H2O, 尿素0.400 g,pH調(diào)為7.0.稱取底物(中藥水提物)于160 mL血清瓶中,底物添加水平為0.5 mg/mL,每瓶加入100 mL培養(yǎng)基,血清瓶加蓋橡膠塞后以鋁蓋密封并抽換氣,充入CO2模擬動物后腸厭氧環(huán)境,115 ℃滅菌20 min后備用.接種物的制備:選取12只體重為2.5 kg左右的白羽肉雞,頸部放血處死后,無菌采集盲腸內(nèi)容物,立即放入充有CO2的無菌容器內(nèi),用滅菌的生理鹽水1:9(質(zhì)量體積比)稀釋,振蕩混勻,經(jīng)4層滅菌紗布過濾,將濾液裝入連續(xù)充入CO2的滅菌燒杯中備用.

1.2 試驗設(shè)計 試驗分為試驗組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+底物+接種物)和對照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+接種物),3個試驗組分別以大蒜、馬齒莧和黃柏水提物為發(fā)酵底物,每個處理3個重復(fù),每瓶接種經(jīng)過稀釋的盲腸內(nèi)容物10 mL,再將血清瓶置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 定量Real‐time PCR分析微生物數(shù)量 發(fā)酵結(jié)束后,取1 mL發(fā)酵液采用糞便基因組快速提取試劑盒(博邁德)提取樣品DNA,然后采用杭州博日LiNe-GeNe.K實時定量PCR儀及其配套軟件進(jìn)行定量分析.總反應(yīng)體系為20 μL:10 μL SYBR GreeN Premix(TakaRa),0.8 μL上下游引物和2 μL樣品DNA.利用大腸桿菌、乳酸桿菌和芽孢桿菌的16S rRNA基因作為模板分別制作大腸桿菌、乳酸桿菌和總菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線,樣品DNA的檢測采用3個重復(fù),取平均值.用于測定樣品中大腸桿菌和總細(xì)菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)的PCR反應(yīng)程序:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min,而后 95 ℃ 15 s,60 ℃1 min 40個循環(huán).測定樣品中乳酸桿菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)的PCR反應(yīng)程序:50 ℃ 2 min,95 ℃10 min,而后95 ℃ 15 s,62 ℃ 1 min 40個循環(huán).以上微生物的特異性引物序列見表1.

表1 定量PCR引物序列

1.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物的測定 發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵液4 000 r/min離心5 min取上清液,用PHS-3C型pH計(上海精科)測定上清液pH.揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量的測定參照秦為琳[7]的方法,氨態(tài)氮(NH3-N)含量測定參照梁劍光等[8]的方法.

1.4 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步處理后,利用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析,如果方差分析結(jié)果顯著,則采用LSD法進(jìn)行多重比較,以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn).

2 試驗結(jié)果

2.1 中藥提取物對體外發(fā)酵微生物數(shù)量的影響 由表2可知,各處理組之間總菌數(shù)量無顯著性差異(P>0.05).大蒜組乳酸桿菌數(shù)量顯著高于其他各組(P<0.05),而其大腸桿菌數(shù)量顯著低于其他各組(P<0.05),表明大蒜水提物有助于促進(jìn)體外發(fā)酵體系乳酸桿菌的生長.

表2 中藥提取物對體外發(fā)酵微生物數(shù)量的影響 lg

2.2 中藥提取物對體外發(fā)酵VFA生成的影響 由表3可知,大蒜組乙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)生成水平顯著高于其他各組(P<0.05),表明大蒜水提物提高了體外發(fā)酵體系中微生物代謝活性;而大蒜組支鏈VFA/TVFA顯著低于其他各組(P<0.05),表明體外發(fā)酵體系中蛋白質(zhì)降解程度降低.

2.3 中藥提取物對體外發(fā)酵pH和NH3-N含量的影響 由表4可知,大蒜組pH和NH3-N含量顯著低于其他各組(P<0.05).

3 討 論

3.1 中藥提取物對體外發(fā)酵微生物數(shù)量的影響 本試驗結(jié)果表明,大蒜組中大腸桿菌的數(shù)量顯著低于其他組,乳酸桿菌數(shù)量顯著高于其他組,而總菌數(shù)量與其他各組無顯著差異,說明大蒜水提物可能有助于促進(jìn)乳酸桿菌的生長.有研究表明,大蒜的主要抗菌成分為大蒜素,大蒜素及其代謝產(chǎn)物阿霍烯、二硫醚、三硫醚等多種成分能穿過細(xì)菌細(xì)胞膜,與半胱氨酸發(fā)生反應(yīng),使細(xì)菌缺乏半胱氨酸而不能發(fā)生生物氧化作用,從而干擾細(xì)菌正常新陳代謝[9].除大蒜素外,大蒜多糖也是大蒜重要的活性成分[10].JeNNifer等[11]研究表明,大蒜多糖屬菊糖類的果聚糖,含果糖約85%,且具有類菊糖作用.曾艷華等[12]通過體外發(fā)酵證明大蒜多糖對擬桿菌、腸球菌和大腸桿菌具有抑制作用,而對雙歧桿菌具有增殖作用.有研究表明大蒜水提物可緩解由大腸桿菌誘導(dǎo)的小鼠腹瀉,減少腹瀉次數(shù),便質(zhì)由稀轉(zhuǎn)干,精神狀態(tài)轉(zhuǎn)好[13].本研究中大腸桿菌數(shù)量受到明顯抑制,可能與大蒜素和大蒜多糖的抑菌作用有關(guān),而乳酸桿菌數(shù)量顯著升高可能與大蒜多糖的類菊糖作用有關(guān).

表3 中藥提取物對體外發(fā)酵VFA生成的影響 mg/g

表4 中藥提取物對體外發(fā)酵pH和NH3‐N含量的影響

3.2 中藥提取物對體外發(fā)酵VFA生成的影響 單胃動物后腸微生物發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生VFA,但同時微生物分解食糜中的蛋白質(zhì)也會產(chǎn)生部分支鏈脂肪酸[14],大部分VFA可以被腸道組織迅速吸收,為上皮細(xì)胞和其他組織提供能量.本試驗中大蒜組乙酸、丁酸和TVFA生成水平顯著高于其他各組,表明大蒜水提物提高了體外發(fā)酵體系中微生物的代謝活性,其中乙酸可作為脂肪合成的前體物質(zhì),并且能夠為肌肉組織提供能量.而丁酸可以向宿主后腸腸道上皮細(xì)胞直接提供能量,促進(jìn)腸長皮細(xì)胞的生長,加速受損腸粘膜的修復(fù)[15],丁酸是由動物后腸中 Roseburia iNtestiNalis、 Eubacterium rectale和Faecalibacterium PrausNitzii等微生物通過乳酸和乙酸轉(zhuǎn)化生成.本試驗中,大蒜組乙酸和丁酸在發(fā)酵后呈現(xiàn)升高的趨勢,推測大蒜水提物促進(jìn)了乙酸生成菌的增殖,乙酸含量的增加為乙酸利用菌提供底物,進(jìn)一步促進(jìn)了乙酸向丁酸的轉(zhuǎn)化;微生物降解支鏈氨基酸會生成標(biāo)志性產(chǎn)物支鏈VFA[16],支鏈VFA/TVFA反映出動物后腸蛋白質(zhì)被微生物降解的情況,在本試驗中大蒜組支鏈VFA/TVFA顯著低于其他各組,表明體外發(fā)酵體系中大蒜水提物使蛋白質(zhì)的降解程度降低.

3.3 中藥提取物對體外發(fā)酵pH和NH3-N含量的影響 NH3-N含量反映了微生物對蛋白質(zhì)降解和對NH3-N利用的綜合能力.有研究顯示,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的攝入量增加時,腸道食糜和糞樣中NH3-N含量也隨之升高[17].一般認(rèn)為NH3-N含量降低和VFA產(chǎn)量升高對動物健康有利,同時發(fā)酵產(chǎn)生的酸性物質(zhì)可降低腸道pH.本試驗大蒜組NH3-N含量和pH顯著低于其他各組,表明大蒜水提物降低了體外發(fā)酵體系中蛋白質(zhì)降解水平,可以減少有害代謝產(chǎn)物如NH3和H2S的生成,同時大蒜水提物促進(jìn)了碳水化合物的發(fā)酵,生成大量的VFA如乙酸和丁酸,降低了發(fā)酵體系pH,從而抑制致病菌的生長,因此在動物飼料中添加大蒜水提物將有利于促進(jìn)動物腸道健康.

4 結(jié) 論

在本試驗條件下,大蒜水提物可降低體外發(fā)酵中大腸桿菌數(shù)量、促進(jìn)乳酸桿菌生長,同時增加乙酸、丁酸和TVFA的生成水平,降低pH和NH3-N含量,有助于提高腸道微生物代謝活性.

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S816.32

A

10.19556/j.0258-7033.2017-11-149

2017-09-19;

2017-10-26

王政(1977-),男,河南人,博士,主要從事動物消化道微生物研究,E‐mail:wangzheng1977@126.com

*通訊作者