青島煙草番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定與全基因組序列分析

張俊+李偉+張靜+申莉莉+王鳳龍+章松柏+楊金廣

摘要：2016年6月從青島即墨市中國農業(yè)科學院煙草研究所試驗基地采集疑似感染番茄黃化曲葉病毒的煙葉樣品。提取病葉總DNA，使用雙生病毒（Geminivirus）通用引物PA/PB對樣品進行PCR擴增和測序，感病葉片DNA僅檢測出番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，簡稱TYLCV）；根據測定的部分序列片段，設計了1對全長序列背向引物，對其基因組全長進行克隆測定。結果顯示，該病毒核酸為單鏈環(huán)狀 DNA，基因組為單一組分 DNA-A，經過分子比對和系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現，TYLCV-SDQDJM（GenBank：KY640456）與山東省濰坊市番茄分離物TYLCV、山東省泰安市番茄分離物TYLCV同源性最高為99%，與已經報道的其他地區(qū)TYLCV分離物同源性均在97%以上，因此確定從青島即墨市采集的煙草矮化病毒癥狀煙株是由TYLCV侵染所致；同時采集了發(fā)病植株以及周邊蔬菜保護地部分蔬菜上的煙粉虱成蟲進行檢測，其中15.0%的煙粉虱樣品檢出番茄黃化曲葉病毒，因此明確了侵染該地區(qū)煙草的番茄黃化曲葉病毒是由帶毒煙粉虱傳播的。

關鍵詞：番茄黃化曲葉病毒；煙草；煙粉虱；分子鑒定；全基因組序列分析

中圖分類號： S435.72 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0050-04

收稿日期：2016-03-13

基金項目：中國煙草總公司重大專項[編號：110201601024（LS-04）]；山東省自然科學基金（編號：ZR2015YL065、ZR2014CQ025）；紅云紅河煙草（集團）有限責任公司科技項目（編號：HYHH2016YL02）。

作者簡介：張 ?。?993—），男，湖北松滋人，碩士研究生，研究方向為植物病毒監(jiān)測。E-mail：191172885@qq.com。

通信作者：章松柏，博士，副教授，研究方向為病毒監(jiān)測與分子病毒學，E-mail：yangtze2008@126.com；楊金廣，博士，副研究員，研究方向為煙草病毒病綜合防治與分子病毒學，E-mail：yangjinguang@caas.cn。 煙草是我國重要的經濟作物之一，其病毒病的危害是最為嚴重的。煙草病毒病曾相繼在世界各主產煙區(qū)暴發(fā)流行，每年給煙草生產帶來重大損失，嚴重影響煙葉的品質，給煙農造成嚴重的經濟損失[1]。2016年6月，青島即墨市煙田發(fā)現了部分煙株表現矮小，葉片黃化上卷，呈現皺縮癥狀，推測該煙株疑似感染雙生病毒（Geminivirus）。該病毒病在我國西南煙區(qū)發(fā)生尤為普遍，特別是在部分煙區(qū)的冬春煙墑危害嚴重，例如在廣西省百色煙區(qū)冬春煙上發(fā)病率超過60%，給當地煙葉生產造成極大損失，直接導致百色煙區(qū)冬春煙的絕產，促使了百色煙區(qū)煙葉種植模式的調整[2]。

作為菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）的典型代表，番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，簡稱TYLCV）是由煙粉虱（Bemisia tabaci） 傳播的一種雙生病毒，其病原是具有孿生顆粒形態(tài)的植物病毒，核酸為單鏈環(huán)狀 DNA，基因組為單一組分 DNA-A[3]，在實際生產中，主要通過煙粉虱在番茄和辣椒等蔬菜作物上傳播危害，每年給蔬菜等經濟作物帶來嚴重的經濟損失[4]。近年來，該病毒傳播介體煙粉虱在山東省煙區(qū)危害較為嚴重，在濰坊、臨沂、日照、青島等市煙區(qū)均存在不同程度的發(fā)生，而該病毒侵染引起的病毒病田間癥狀鮮見發(fā)生。本研究首次明確了山東省青島即墨市中國農業(yè)科學院煙草研究所試驗基地煙田中疑似矮化煙株是受TYLCV侵染所致。筆者對采集的病樣進行了病原分子鑒定，對分離物全基因組進行克隆和序列分析，同時采集發(fā)病煙田及周邊保護地內的煙粉虱，利用雙生病毒通用引物對采集到的煙粉虱樣品進行檢測，明確了該病毒在青島煙區(qū)的傳播途徑，為該病毒病的精準測報和防控提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病樣品采集 待測樣品于2016年6月采自山東省青島即墨市中國農業(yè)科學院煙草研究所試驗基地煙田，煙粉虱成蟲樣品采自試驗基地煙田、周邊保護地蔬菜及雜草上，成蟲數量約600頭，每組10頭，分為60組，置于-80 ℃保存待用。本試驗中以采自山東省壽光市的TYLCY侵染的番茄植株作為陽性對照，以健康煙草植株為陰性對照。

1.1.2 相關試劑材料 DNA提取試劑盒（Plant Genomic DNA Kit），昆蟲基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit），膠回收試劑盒，克隆載體（pEASY-Blunt Simple Cloning Kit）以及感受態(tài)細胞均購自北京全式金生物有限公司；Prime STAR Max Premix（2×）以及DL2000 DNA Maker購自TaKaRa公司。其他常規(guī)生化試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取，PCR擴增及目的基因的連接、克隆、測序 使用植物DNA提取試劑盒（Plant Genomic DNA Kit）提取病樣總DNA。使用昆蟲基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）提取煙粉虱樣品總DNA。使用檢測雙生病毒的通用引物PA/PB進行擴增，擴增得到的序列經Blast程序與GenBank中已經上傳的TYLCV的DNA-A序列進行比對，確定病樣感染番茄黃化曲葉病毒后，根據已經報道的TYLCV全序列，利用Primer 5.0設計1對全長序列背向引物擴增病毒DNA-A全序列，所用引物詳見表1。擴增程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃保存。擴增的產物進行凝膠電泳檢測，將目的條帶進行膠回收純化，回收產物克隆到pEASY-Blunt載體上。待克隆檢測為陽性重組質粒后，委托上海生工青島測序部進行測序。endprint

1.2.2 序列分析 將測序后得到的序列通過Blast程序進行比對，在NCBI上選取同源性最高的TYLCV分離物全基因組，利用DNAMAN軟件進行一致率分析，使用SnapGene軟件對樣品基因組結構進行分析。選取山東省TYLCV分離物和部分有代表性分離物的全基因組序列為對照，利用MEGA 51中的鄰接法，對青島即墨市的TYLCV分離物全基因組序列進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析[5-7]。

2 結果與分析

2.1 雙生病毒通用引物PCR檢測結果

以提取煙草病株葉片DNA為模板，利用雙生病毒通用引物PA/PB進行PCR擴增。PCR產物為約500 bp大小的特異性條帶（圖1），經克隆、測序、Blast程序比對，發(fā)現青島即墨市感病煙葉樣品擴增出的基因片段與GenBank已經登錄的部分地區(qū)TYLCV分離物的同源性達到98.0%以上。因此，筆者初步確定該樣品感染了TYLCV。

2.2 病毒分離物DNA-A全序列的克隆與序列分析

2.2.1 病毒分離物DNA-A全序列的克隆 利用設計的全長序列背向引物對感病樣品的DNA-A全序列進行擴增，PCR產物為約2 800 bp大小的特異性條帶（圖2）。經克隆、測序后結果表明，青島即墨市煙草分離物TYLCV-SDQDJM序列全長為2 781個核苷酸。該序列為閉合環(huán)狀單鏈DNA，

共6個ORF，具有菜豆金色花葉病毒屬病毒基因組典型特征。圖4顯示，這6個開放閱讀框分別是AV1基因（308～1 084 nt，編碼外殼蛋白）、AV2基因（148～498 nt，編碼和病毒移動相關蛋白）以及位于互補鏈上的AV1基因（1 542～2 615 nt，編碼復制酶）、AV2基因（1 226～1 633 nt，編碼轉錄激活蛋白）、AV3基因（1 081～1 485 nt，編碼增強復制的蛋白）和AV4基因（2 171～2 464 nt）。通過Blast比對發(fā)現山東省青島即墨市煙草上的分離物TYLCC-QDJM與山東省濰坊市番茄上的分離物TYLCV-SDWF-L7（GenBank：KC999850.1）、云南省 TYLCV-YN4392（GenBank：KU934104.1）、海南省 TYLCV-HNJZ19（GenBank：KX034543.1）的同源性最高為99%。與來自中國不同地區(qū)的TYLCV分離物的同源性均在98%以上。

2.2.2 序列分析與系統(tǒng)進化樹的構建 利用DNAMAN軟件，將擴增測序得到的TYLCV-SDQDJM分離物的DNA-A全序列與國內外已經報道的具有代表性的TYLCV分離物全序列進行比對，得出核苷酸的一致率。同時，將其與GenBank中已經登錄的侵染煙草的其他DNA病毒全序列進行比對。結果顯示，TYLCV-QDJM DNA-A與來自中國不同地區(qū)的TYLCV分離物的一致率均在97%以上，其中與山東省濰坊市和山東省泰安市的分離物一致率最高，為99%，與山東省其他地區(qū)以及國內其他省份還有國外部分地區(qū)報道的番茄黃化曲葉病毒一致率都在97%以上。而與侵染煙草的其他DNA病毒序列比對發(fā)現，該煙草病毒樣品與中國番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl China virus，簡稱TYLCCNV）、番茄曲葉病毒（tomato leaf curl China virus，簡稱ToLCCNV）、煙草曲葉病毒（tobacco leaf curl virus，簡稱TbLCV）、煙草曲莖病毒（tobacco curl shoot virus，簡稱TbCSV）、番茄黃化曲葉撒丁尼亞病毒（tomato yellow leaf curl Sardinia virus，簡稱TYLCSV）[8]的一致率都在76%以下。因此，該病毒分離物為番茄黃化曲葉病毒的一個分離物（TYLCV-SDQDJM）。

為進一步分析青島即墨市煙草TYLCV-QDJM分離物與已經報道的各TYLCV分離物及侵染煙草的其他DNA病毒的親緣關系，本研究選取了來自國外12個國家以及國內12個地區(qū)的TYLCV代表分離物，同時選取了國內外不同地區(qū)已經報道的侵染煙草的其他5類DNA病毒作為外組利用MEGA 5.1軟件構建系統(tǒng)進化樹[9]。從該系統(tǒng)進化樹（圖5）可以看出，SDQDJM與來自中國的12個分離物以及國外的8個分離物親緣關系較近，并聚在一個大的分支。其中 TYLCV-SDQDJM與TYLCV-SDWF78親緣關系最近，位于一個小分支上，而與科威特分離物（TYLCV-KISR4）、阿曼分離物（TYLCV-BidBid）、伊朗分離物（TYLCV-Ir2）以及沙特阿拉伯分離物（TYLCV-Jeddah）親緣關系相對較遠。同時，由圖5還可以看出，侵染煙草的其他雙生病毒分離物位于外族分支上，其中番茄黃化曲葉撒丁尼亞病毒意大利分離物（TYLCSV-Sar-[IT：Sic：04]）與番茄黃化曲葉病毒沙特阿拉伯分離物（TYLCV-Jeddah）位于一個小分支上。

2.3 煙粉虱體內TYLCV檢測鑒定

將試驗基地煙田及周邊蔬菜保護地部分蔬菜上捕獲的煙粉虱樣品以每組10頭，共分為60組，提取煙粉虱樣品DNA作為模板，使用雙生病毒通用引物PA/PB進行擴增。結果發(fā)現，共計9組樣品擴增得到大小約為500 bp的特異性條帶（圖3），經測序后使用Blast程序比對，最終確定15.0%的煙粉虱樣品攜帶TYLCV。值得注意的是，利用雙生病毒通用引物PA/PB，只檢測到了TYLCV，并沒有檢測到其他雙生病毒種類，說明青島地區(qū)可能僅有一種雙生病毒危害。

此次危害當地煙草的煙粉虱主要是B型煙粉虱[10]，而山東省當地廣泛種植的大棚蔬菜給煙粉虱提供了很好的越冬場所，5—11月進入煙粉虱危害嚴重時期，而隨著山東省近年來保護地蔬菜種植規(guī)模的擴大，栽培方式多樣，種類增多，給煙粉虱提供了豐富的寄主范圍和適宜的生長環(huán)境，有利于煙粉虱越冬，為來年雙生病毒的傳播提供了良好的生境。先前報道表明，近幾年TYLCV在山東省本地番茄上危害十分嚴重，各地均有報道，而煙粉虱寄主范圍十分廣泛，可危害74科600種植物[11]。因此筆者推測，本次采集到的煙粉虱在取食本地TYLCV侵染的蔬菜時，成功獲取并攜帶TYLCV，隨著正常的遷飛過程進入青島即墨市煙田，開始取食煙草幼嫩煙葉，隨著口針穿過煙葉表皮細胞和薄壁細胞，其攜帶的TYLCV成功通過煙粉虱的傳播侵染了當地煙草。endprint

3 結論與討論

山東省煙區(qū)是我國老煙區(qū)之一。近年來，隨著農業(yè)耕作結構的調整，特別是保護地栽培的廣泛發(fā)展，使山東省煙區(qū)病毒病種類發(fā)生了較大變化。通過近5年煙草病蟲害預測預報網絡數據分析，煙粉虱作為煙草上的主要害蟲在山東省煙區(qū)發(fā)生越來越重，已經上升為僅次于蚜蟲的刺吸式害蟲，但煙粉虱傳播的雙生病毒在山東省煙草上鮮見發(fā)生，主要報道集中在保護地栽培的番茄上[9]。本研究首次報道了山東省青島市煙草上發(fā)現的植株矮化和葉片皺縮的煙株是由煙粉虱傳播的TYLCV侵染所致。通過對山東省青島即墨市煙草病毒分離物DNA-A的全序列分析，明確了該分離物為番茄黃化曲葉病毒的一個分離物。該分離物與山東?。▔酃猓㏕YLCV同源性達到了99%，而與山東省以外的其他TYLCV分離物同源性較小，表明TYLCV在遺傳進化上表現出一定的地理隔離。通過檢測即墨市周邊保護地部分蔬菜上的煙粉虱，發(fā)現采集到的15.0%煙粉虱樣品攜帶TYLCV，表現TYLCV具備潛在大發(fā)生的危險，應引起當地植物保護從業(yè)者的警惕，提前做好治蟲防病措施，以防該病毒病暴發(fā)成災。

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