CO2濃度對嗜堿綠球藻MC—1光合作用和生長的影響

楊熙+向文洲+黃穎華+呂意華+吳鵬

摘要：為了實現微藻的煙氣培養(yǎng)，從而降低培養(yǎng)成本，達到減排目的，以1株嗜堿綠球藻Chlorococcum alkaliphilus MC-1為研究材料，檢測不同濃度CO2（5%、15%、50%、100%）對該藻光合放氧速率和生長的影響。結果顯示，CO2濃度為5% 時，該藻光合放氧速率最大，平均值為117.60 μmol/（h·mg）（以單位時間、單位質量葉綠素的放氧量計），生長狀態(tài)也最好，平均生物量產率、平均比生長速率、平均CO2固定速率均最大，分別為（0.063±0.001）g/（L·d）、（0.201±0.001） d-1、（0.188±0.002）g/（L·d），最高生物量濃度為（0.778±0.006）g/L。當CO2≥15%時，該藻光合作用和生長雖受到一定程度抑制，但當CO2濃度達到100%時，該藻光合放氧和生長狀態(tài)依然保持較高水平，平均光合放氧速率為100.38 μmol/（h·mg），平均生物量產率、平均比生長速率、平均CO2固定速率分別為（0.048±0.002）g/（L·d）、（0.179±0.002） d-1、（0.090±0.004）g/（L·d），最高生物量濃度為（0.613±0.017）g/L。以上結果表明，該藻對高濃度CO2具有較強的耐受性，是1株極具潛力的煙氣減排藻種。

關鍵詞：微藻；煙氣；減排；CO2；光合放氧速率

中圖分類號： Q935 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0158-04

收稿日期：2017-03-04

基金項目：國家海洋局南海分局海洋科學技術局長基金（編號：1514）；廣東省自然科學基金（編號：2014A030310495）。

作者簡介：楊熙（1989—），男，湖北荊州人，碩士，助理工程師，主要從事能源微藻的篩選和培養(yǎng)、海洋浮游生物鑒定方面的研究。E-mail：yang1209xi@163.com。

通信作者：向文洲，博士，博士生導師，主要從事海藻生理生化、海藻天然產物、保健食品及可再生資源的開發(fā)利用研究。Tel：（020）89023223；E-mail：xwz@scsio.ac.cn。 由于溫室氣體的大量排放所引起的溫室效應已經成為全球關注的熱點問題，減排形勢也越來越嚴峻，其中，CO2是主要的溫室氣體[1]。微藻可通過光合作用將CO2固定轉化為有機物，從而達到減排目的，由于微藻具有生長速率快、生長周期短、固碳效率高、產量高等特點，利用微藻進行減排已成為目前研究的熱點[2]。

一些工廠由于燃燒煤炭所排放出的煙氣中含有大量CO2，而微藻培養(yǎng)中碳源成本占總培養(yǎng)成本的41%[3]，如果利用這些煙氣作為碳源來培養(yǎng)微藻，則不但生產所需的碳源成本可忽略不計，而且能達到減排的目的，可謂一舉兩得。煤炭煙氣中CO2濃度（體積分數）一般在15%～20%，而CO2濃度是影響微藻光合作用和生長的一個重要因素[4]。關于微藻對CO2濃度適應性的研究已多見報道，如Kaplan等發(fā)現微藻Anabaena variabilis在低濃度CO2（0.03% CO2）下光合放氧速率很快達到最大值，而在高濃度CO2（5% CO2）下其光合放氧速率受到明顯抑制[5]；郭禎等比較了不同CO2濃度（1%、3%、5%、10%、15%）對亞心形扁藻生長的影響，發(fā)現3% CO2對該藻生長最有利，當CO2濃度大于3%時，該藻光合作用和生長受到抑制[6]；Chiu等利用空氣與2%、5%、10%、15% CO2培養(yǎng)1株小球藻，發(fā)現該藻最適CO2濃度為2%，當CO2濃度為5%時，藻的生長受到明顯抑制，CO2濃度為10%、15%時，藻的生長完全被抑制，甚至出現藻細胞死亡現象[7]。目前所報道的大部分微藻對CO2的耐受度較低，不能適應含有高濃度CO2的煙氣培養(yǎng)條件，因此，尋找適應性強、易于培養(yǎng)且能耐受高濃度CO2的藻種是實現微藻煙氣培養(yǎng)的關鍵。

筆者所在實驗室發(fā)現1株極具潛力的減排藻種——嗜堿綠球藻Chlorococcum alkaliphilus MC-1，該藻種具有適應性強、生長速度快和pH值快速漂移等特性，易于在室外大規(guī)模培養(yǎng)[8-9]。但是CO2濃度對其光合作用和生長的影響尚不明確。因此，本研究以該藻為試驗材料，通過測定不同濃度CO2對該藻光合放氧速率、生長狀態(tài)的影響，以期為實現該藻的煙氣培養(yǎng)和培養(yǎng)條件的優(yōu)化提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 藻種和培養(yǎng)基

本研究采用1株嗜堿綠球藻Chlorococcum alkaliphilus MC-1 （暫定名，簡稱MC-1） 作為試驗藻種，該藻種由中國科學院南海海洋研究所微藻項目組于2002年在室外藍藻培養(yǎng)箱中分離并經過固體純化培養(yǎng)后獲得[8]。

本試驗中所用培養(yǎng)基配方在原ZSNT培養(yǎng)基[8]的基礎上加以調整，調整后的配方見表1。M2溶液：1 L蒸餾水中添加0.24 g FeCl3·6H2O、0.19 g Na2-EDTA。A5溶液：1 L蒸餾水中添加2.86 g H3BO3、1.81 g MnCl2·4H2O、0.22 g ZnSO4·7H2O、0.08 g CuSO4·5H2O、0.02 g Na2MoO4、1滴濃H2SO4。B6溶液：1 L蒸餾水中添加22.96 mg NH4VO3、19.90 mg K2CrO4、47.85 mg NiSO4·6H2O、17.91 mg NaWO4·2H2O、40.00 mg Ti（SO4）3、43.98 mg Co（NO3）2·6H2O。

1.2 光合放氧速率的測定

1.2.1 不同濃度CO2補充下光合放氧速率的測定 先將處于生長期的微藻用MC-1培養(yǎng)基配制成濃度約為25 μg/mL（以單位體積的葉綠素質量計）的藻液，并在光照度為 135.14 μmol/（m2·s）、溫度為25 ℃的條件下光照培養(yǎng)至其pH值升至10.50。試驗分4組（CO2含量分別為5%、15%、50%、100%）進行，每組分別通入對應濃度的CO2，將藻液的pH值依次降為9.50、9.00、8.50、8.00、7.50、7.00、6.50。利用Hansatech公司的Oxygraph氧電極測定每個pH值下的光合放氧速率（以單位時間、單位質量葉綠素的放氧量計），測定時的光照度為135.14 μmol/（m2·s），光源為冷白熾光，反應杯的溫度通過恒溫控制儀維持在25 ℃，在反應杯中加入 2 mL 藻液，每次測定8 min。endprint

1.2.2 不同pH值下光合放氧速率的測定 將處于對數生長期的微藻利用MC-1培養(yǎng)基配制成濃度約為 25 μg/mL 的藻液，然后利用HCl、NaOH將藻液pH值分別調為2.0、30、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，每組設3個平行。每次調完pH值后，間隔30 min，然后利用氧電極測定光合放氧速率（以單位時間、單位質量葉綠素的放氧量計）。反應杯中加入2 mL藻液，通過恒溫控制儀維持反應杯溫度在25 ℃，測定時的光照度為135.14 μmol/（m2·s），光源為冷白熾光，每次測定8 min。

1.3 不同濃度CO2培養(yǎng)試驗的培養(yǎng)條件

本試驗于室內進行，培養(yǎng)容器為1 L三角瓶，藻液體積為700 mL，起始D700 nm為0.312，以白熾燈為光源，光照度為13514 μmol/（m2·s），光—暗周期為12 h—12 h，培養(yǎng)溫度為25 ℃。試驗分4組進行（CO2濃度分別為5%、15%、50%、100%），每個試驗組設3個平行。每天搖瓶3～4次，連續(xù)培養(yǎng)11 d，每天10：00測定pH值和干質量。其中pH值用FiveGo基礎型便攜式pH計-FG2-FK（METTLER TOLEDO，美國）直接測定；干質量的測定方法：取15 mL藻液，用 0.22 μm 微孔濾膜過濾并用去離子水清洗2次，于110 ℃下烘干至恒質量后測定。

1.4 氣源和補氣方式

氣源采用CO2、N2以不同濃度比混合的氣罐，CO2體積分數分別設為5%、15%、50%、100%。采用間歇性補氣方式培養(yǎng)，由于該藻在培養(yǎng)時會產生明顯的pH值漂移現象，即藻液pH值會在短時間內快速上升[9]，當pH值升至10.0時，開始補充CO2氣體，通氣速率為150 mL/min，當pH值降到700時停止供氣，如此反復，此補氣過程均采用人工控制，夜間停止補氣。

1.5 生長指標計算

式中：P為生物量產率，g/（L·d）；C為藻體中碳元素質量分數；MCO2、MC分別為CO2、C的相對分子質量。

1.6 統計分析

采用SPSS 10.0對試驗結果進行方差分析，數據以“平均值±標準差”來表示，用Origin 8.0進行數據處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度CO2連續(xù)補充下微藻MC-1光合放氧速率的變化

通過連續(xù)補充不同濃度CO2氣體，將各試驗組藻液pH值從起始的10.50依次降為9.50、9.00、8.50、8.00、7.50、700、6.50，并測定各pH值下微藻的光合放氧速率。由圖1可見，開始補充CO2氣體后，各試驗組光合放氧速率均開始回升，pH值從10.50降至8.50這一過程中光合放氧速率上升幅度最大；pH值從8.50減至7.00時，各試驗組的光合放氧速率增幅變緩，處于相對平穩(wěn)的狀態(tài)；當pH值從7.00降至6.50時，5%、15%、50% CO2組的光合放氧速率都有所增加，而100% CO2組則表現出下降趨勢。在整個過程中，雖然各試驗組光合放氧速率的變化趨勢大體相似，但各試驗組的平均光合放氧速率的大小有顯著差異

2.2 不同濃度CO2培養(yǎng)試驗

2.2.1 微藻MC-1光合作用的pH值適應特性 通過測定不同pH值下微藻MC-1的光合放氧速率來檢測該藻的pH值適應特性，以便為后面進行不同濃度CO2培養(yǎng)試驗中pH值條件的確定提供參考。由圖2可見，藻液pH值在6.0～90之間時，該藻的光合放氧速率處于相對較高值，當pH值為7.0時光合放氧速率達最大值，為138.42 μmol/（h·mg）。雖然pH值﹤5.0或pH值﹥10.0時微藻MC-1的光合放氧作用受到一定抑制，但即使pH值低至2.0或高達110時，該藻依然保持著一定的光合作用效率，而沒有完全被抑制。上述結果表明，該藻的最佳生長pH值區(qū)間為6.0～9.0，最適生長pH值為7.0，且對強酸性、強堿性條件有較強的耐受能力。

2.2.2 不同濃度CO2培養(yǎng)下微藻MC-1生長狀態(tài)的變化 為了驗證微藻MC-1對CO2濃度的耐受性，本試驗測定了不同濃度CO2培養(yǎng)下微藻MC-1生長狀況的變化。通過參考微藻MC-1的pH值特性，培養(yǎng)過程中采用間歇性補氣方式，藻液pH值控制在7.00附近。經過11 d的連續(xù)培養(yǎng)發(fā)現，不同濃度CO2對微藻MC-1生長有顯著影響（P

3 討論

3.1 不同濃度CO2連續(xù)補充對微藻MC-1光合作用的影響

本研究通過分別導入不同濃度CO2氣體，使藻液pH值從初始的10.50降至6.50，并測定這一過程中微藻光合放氧速率的變化，以此來模擬平常試驗中利用CO2氣體對微藻進行間歇性補氣以補充碳源的過程。微藻在不同濃度CO2培養(yǎng)下可表現出不同的光合作用特性，Kaplan等研究不同濃度CO2對微藻Anabaena variabilis光合放氧速率的影響發(fā)現，003% CO2濃度下光合放氧速率很快達到最大值，而在5%CO2濃度下其光合放氧速率隨著培養(yǎng)時間增加緩慢上升，但總體上受到明顯抑制[5]。Satoh等將空氣條件下培養(yǎng)的微藻Chlorococcum littorale轉入高濃度CO2條件下（40% CO2），發(fā)現其光合作用受到強烈抑制[10]，其原因與高濃度CO2導致細胞內酸化，從而造成光合作用相關酶失活有關。

CO2濃度是影響微藻光合作用的重要因素，當向藻液中補充CO2氣體時，藻液中分子態(tài)CO2開始增加，分子態(tài)CO2可被微藻直接吸收利用而不需要消耗過多能量，適當增加所補充的CO2濃度可以使藻液中可被直接利用的分子態(tài)CO2濃度增加，從而使光合效率提高。而當所補充的CO2濃度過高時（CO2≥15%），會造成CO2向細胞質內擴散增加，并水解產生HCO3-、H+，造成細胞內pH值下降，這種酸化會抑制細胞內碳酸酐酶的活性，并對細胞質造成毒性作用，阻礙微藻對CO2的進一步吸收和利用[11]，從而降低光合作用水平。本研究顯示，不同濃度CO2對MC-1光合放氧速率有顯著影響，5% CO2組的光合放氧速率最大，CO2濃度為15%～100%時光合作用會受到一定程度抑制，但抑制作用并不大，其光合放氧速率仍處于較高水平，說明該藻對高濃度CO2具有較強的耐受性。endprint

此外，在補充CO2降pH值這一過程中，各試驗組光合放氧速率會隨pH值的變化而呈現出具有一定規(guī)律的變化趨勢，產生此現象的原因與該藻對無機碳的利用機制有關[12-13]。碳源是微藻生長所必需的大量元素，它在溶液中以CO2、HCO3-、CO32-等無機碳形態(tài)存在，這3種形式無機碳的比例隨著溶液中pH值的變化而改變，因此，微藻在不同pH值下所能利用的無機碳形態(tài)也不同。當pH值≤6.0時，溶液中的無機碳主要以CO2的形式存在，水體中分子態(tài)CO2可被微藻直接吸收利用而不需要消耗過多能量；當6.010.0時，溶液中無機碳主要以CO32-的形式存在，目前認為CO32-不能是被藻直接利用[15]。本試驗中，當pH值從10.50降至8.50時，藻液中可被微藻利用的HCO3-濃度開始增加，從而使光合放氧速率快速升高；當pH值從8.50降至7.00時，藻液中的HCO3-濃度基本為飽和狀態(tài)，因此各試驗組光合放氧速率基本維持不變；當pH值從7.00降至650時，藻液中可利用碳源由HCO3-向分子態(tài)CO2轉變，分子態(tài)CO2是一種比HCO3-更容易被微藻吸收利用的碳源，其濃度適當增加會促進微藻的光合作用，但濃度太高（100%）時會導致細胞內酸化，造成光合作用相關酶失活而抑制光合作用，出現光合放氧速率下降的現象。

3.2 不同濃度CO2連續(xù)補充對微藻MC-1生長的影響

關于不同濃度CO2對微藻生長影響的研究報道已非常多見，如Mudimu等分別利用空氣、5% CO2、15% CO2氣體來培養(yǎng)3種微藻Coccomyxa sp.、Desmodesmus sp.、Muriella terrestris[16]，發(fā)現用空氣、15% CO2培養(yǎng)的條件下，藻的生長狀態(tài)非常相似，但5% CO2培養(yǎng)下3種微藻的生長狀態(tài)均明顯好于空氣、15% CO2組；Razzak等設置2%、4%、6%、8%、10%、12%的CO2濃度梯度來培養(yǎng)微藻Nannochloropsis oculata，結果顯示8% CO2濃度下微藻的生長狀態(tài)最好，最高產量達0.088 g/（L·d）[17]；郭禎等在鼓泡式光生物反應器中比較了不同CO2濃度（1%、3%、5%、10%、15%）對亞心形扁藻生長的影響，發(fā)現3% CO2對該藻生長最有利[6]。本試驗利用不同濃度CO2培養(yǎng)微藻MC-1，發(fā)現5% CO2組藻的生長狀況最好，雖然高濃度CO2（15%～100%）下藻的生長受到了一定程度的抑制，但依然保持較好的生長狀態(tài)，這種結果與不同濃度CO2對微藻MC-1光合放氧作用影響的結果形成了很好的對應關系。這是由于不同濃度CO2對微藻生長的影響首先體現在對藻光合作用的影響上，當光合作用增強，則微藻生長受到促進，反之，當光合作用減弱，則微藻生長受到抑制。該試驗結果進一步證明微藻MC-1在5% CO2下具有較好的生長狀態(tài)，同時也能適應高濃度CO2（15%～100%）的培養(yǎng)條件，對高濃度CO2的耐受性較強。

3.3 微藻MC-1煙氣培養(yǎng)方法的優(yōu)化

筆者所在實驗室此前的研究已驗證微藻 MC-1能適應真實煙氣的培養(yǎng)條件[18]，但培養(yǎng)方法較粗略，需要進行優(yōu)化。本試驗檢測了不同濃度CO2對微藻MC-1生長和光合作用的影響，發(fā)現該藻對高濃度CO2（15%～100%）的耐受性較強，但在5% CO2培養(yǎng)下生長狀態(tài)最佳。而煤炭煙氣中CO2濃度一般為15%～20%，因此在實施該藻的煙氣培養(yǎng)時可以利用混入空氣的方法將煙氣中CO2濃度稀釋為5%，這樣既有利于微藻的生長，又不影響煙氣的吸收處理。通過對該藻pH值特性的檢測，發(fā)現該藻在pH值為70時光合放氧速率最大，其最佳生長pH值區(qū)間為6.0～90，較嗜好中性偏堿性環(huán)境，且該藻具有pH值快速漂移特性，即藻液pH值可在短時間內快速上升，因此可以采用間歇性補氣的方式來培養(yǎng)該藻，即當藻液pH值升至10.0時，開始補充CO2氣體，當pH值降到7.0時停止供氣，如此反復，這樣可以避免連續(xù)通氣造成的藻液pH值過低，以及煙氣的過多逃逸，有利于煙氣更充分有效地被吸收利用。

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