王智蘭，杜曉芬，王軍，楊慧卿，王興春，郭二虎，王玉文，袁峰，田崗，劉鑫，王秋蘭，李會(huì)霞，張林義，彭書忠

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谷子的克隆、表達(dá)分析和功能標(biāo)記開發(fā)

王智蘭1，杜曉芬1，王軍1，楊慧卿1，王興春2，郭二虎1，王玉文1，袁峰1，田崗1，劉鑫1，王秋蘭1，李會(huì)霞1，張林義1，彭書忠1

（1山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西長治 046011；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030800）

從谷子中分離受激素誘導(dǎo)表達(dá)、參與器官大小控制的擬南芥（Auxin-regulated gene involved in organ size）基因家族的同源基因，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，明確其在不同組織器官及其受植物激素誘導(dǎo)的表達(dá)模式，分析基因編碼區(qū)及其啟動(dòng)子序列差異，開發(fā)功能標(biāo)記，為谷子產(chǎn)量性狀相關(guān)基因的改良提供依據(jù)。通過對(duì)已有ARGOS蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行BLAST，明確谷子ARGOS家族成員數(shù)目并進(jìn)行蛋白序列分析，采用同源克隆方法獲得谷子ARGOS家族成員之一——編碼區(qū)及其啟動(dòng)子序列，用生物信息學(xué)方法分析啟動(dòng)子的順式作用元件，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析該基因在谷子各器官中以及不同植物激素條件下的誘導(dǎo)表達(dá)模式，利用基因編碼區(qū)及啟動(dòng)子序列的SNP和插入缺失序列開發(fā)分子標(biāo)記，同時(shí)利用85份谷子品種的穗重（panicle weight，PW）、穗粒重（grain weight，GW）和千粒重（thousand-grain weight，TGW）等產(chǎn)量性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行基因型間的差異顯著性分析，挖掘用于檢測該基因與谷子產(chǎn)量性狀相關(guān)優(yōu)異等位變異的功能標(biāo)記。獲得6個(gè)谷子ARGOS家族成員，均具有典型的保守OSR（organ size related）結(jié)構(gòu)域，包含2個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)和1個(gè)高度保守富含亮氨酸區(qū)域，克隆了與擬南芥AtARGOS同源的家族成員之一——編碼區(qū)及其啟動(dòng)子序列，該基因位于谷子第8染色體上，開放閱讀框?yàn)?42 bp，無內(nèi)含子，編碼113個(gè)氨基酸，啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)? 109 bp，含有與生長素、乙烯、茉莉酸和赤霉素等多種植物激素調(diào)控有關(guān)的元件。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在谷子根、莖、葉和穗等器官中均有表達(dá)，在根中表達(dá)量最高，其次為莖和葉，穗中表達(dá)量最低。對(duì)生長素吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）不敏感，但受乙烯利（ethephon，ETH）上調(diào)表達(dá)。不同基因型谷子序列分析發(fā)現(xiàn)，編碼區(qū)151 bp（起始密碼子83 bp）處存在1個(gè)SNP（C/G），導(dǎo)致該基因第28個(gè)氨基酸發(fā)生突變（Ala/Gly），據(jù)此設(shè)計(jì)一個(gè)CAPS-Ⅱ標(biāo)記；另外，啟動(dòng)子區(qū)存在19個(gè)SNP和2個(gè)InDel，根據(jù)-1 652—-1 651處（TA）2/3和-1 165—-1 163處（TCA）1/2的序列差異分別設(shè)計(jì)SSR引物AP-1和AP-2。同時(shí)，用這些標(biāo)記對(duì)85份谷子品種進(jìn)行檢測，CPAS-Ⅱ和AP-1檢測到不同基因型的穗重、穗粒重和千粒重的差異均不顯著，而AP-2檢測的2種基因型間除千粒重差異不顯著外，穗重和穗粒重在2015和2016兩年間差異均達(dá)到顯著水平。在谷子中發(fā)現(xiàn)6個(gè)ARGOS家族成員，均具有保守OSR結(jié)構(gòu)域，其中，谷子開放閱讀框?yàn)?42 bp，無內(nèi)含子，與擬南芥AtARGOS同源，該基因?qū)ιL素不敏感，但受乙烯利上調(diào)表達(dá)。在該基因啟動(dòng)子區(qū)開發(fā)的SSR標(biāo)記AP-2可作為功能標(biāo)記，用于谷子穗重和穗粒重等產(chǎn)量性狀相關(guān)優(yōu)異等位變異的鑒定和篩選。

谷子；；啟動(dòng)子；表達(dá)分析；功能標(biāo)記

0 引言

【研究意義】作物產(chǎn)量性狀與植株器官大小存在密切關(guān)系[1]，植物器官大小除受光照、溫度、營養(yǎng)和激素等外界環(huán)境條件影響外，主要受基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等遺傳因子調(diào)控。谷子具有耐旱耐瘠性強(qiáng)、基因組小、二倍體、生育期短等特點(diǎn)，以谷子為模式作物開展功能基因研究，能為解決多年來難以解析的抗旱和C4光合作用遺傳分子機(jī)理提供嶄新的機(jī)遇[2-3]。因此，發(fā)掘控制谷子器官大小的重要功能基因并用于遺傳改良，對(duì)于加快谷子育種進(jìn)程和提高谷子單產(chǎn)具有重要作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究認(rèn)為，細(xì)胞總數(shù)目的增加[4]和單細(xì)胞體積增大[5]2個(gè)連續(xù)并相關(guān)的過程控制植物器官的大小，而植物器官大小在不同物種中差異顯著但在物種內(nèi)個(gè)體之間卻相對(duì)一致，說明器官發(fā)育過程中，細(xì)胞分裂受到遺傳物質(zhì)的嚴(yán)格控制[6]。許多控制植物器官大小的相關(guān)基因已被研究，如、、、、、和等[7]，其中，擬南芥ARGOS基因家族包括、、和等4個(gè)基因。2003年，在擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)了，該基因受生長素上調(diào)表達(dá)并通過“auxin→→→”信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖和器官生長的調(diào)節(jié)[9]；由油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)，這種誘導(dǎo)依賴于油菜素內(nèi)酯受體BRI1[10]；此外，[11]和[12]通過乙烯誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但受ABA和油菜素內(nèi)酯抑制。該基因家族的共同特點(diǎn)是含有一個(gè)保守的ORS結(jié)構(gòu)域，包含2個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，在不同植物激素誘導(dǎo)表達(dá)下，最終通過調(diào)控細(xì)胞數(shù)目或細(xì)胞體積來調(diào)節(jié)植物器官大小，對(duì)植株生長起到促進(jìn)作用[8]。玉米ARGOS基因家族目前發(fā)現(xiàn)8個(gè)基因，其中受乙烯下調(diào)表達(dá)并參與器官大小的調(diào)控，擬南芥轉(zhuǎn)基因植株抗旱性提高；超表達(dá)可使轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)量大幅提高[13]。水稻也受生長素誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株側(cè)生器官的花和葉片變大，角果數(shù)目和種子數(shù)量增多[14]；受干旱、鹽以及外源ABA、MeJA、NAA、ACC、GA3、BR等多種激素上調(diào)表達(dá)，但不同小麥基因組、和的表達(dá)模式存在差異，轉(zhuǎn)擬南芥植株發(fā)芽率增加，葉和花環(huán)直徑增大、單株角果數(shù)目增多[15]；另外，ARGOS基因在大白菜[16-18]、蘿卜[19]、紫花苜蓿[20]中也有報(bào)道，均參與植物器官大小的調(diào)節(jié)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】谷子ARGOS基因家族成員的特性和受植物激素誘導(dǎo)后的表達(dá)模式以及其與產(chǎn)量性狀的關(guān)系尚無報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過生物信息學(xué)方法獲得谷子中所有ARGOS家族成員并分析其蛋白序列，采用同源克隆方法獲得該基因家族的一個(gè)成員的編碼區(qū)及其啟動(dòng)子序列，用生物信息學(xué)方法分析啟動(dòng)子的順式作用元件，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析在谷子各組織器官以及不同植物激素誘導(dǎo)后的表達(dá)模式，通過基因編碼區(qū)及其啟動(dòng)子序列進(jìn)行SNP分析及標(biāo)記開發(fā)，同時(shí)利用85份谷子品種的產(chǎn)量性狀進(jìn)行驗(yàn)證，開發(fā)用于檢測該基因與谷子產(chǎn)量性狀相關(guān)優(yōu)異等位變異的功能標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 植物材料與性狀測定

用于克隆的谷子品種：晉29A和K186，種植方式：每材料種植1行，行長2.5 m，行距33 cm，取樣時(shí)期：拔節(jié)期幼葉；用于基因器官表達(dá)的谷子品種：豫谷1號(hào)，種植方式同上，取樣時(shí)期：抽穗后第7天，分別取其根、莖、葉及穗；用于植物激素IAA和ETH響應(yīng)表達(dá)的谷子品種：豫谷1號(hào)，種植方式：將種子種植于混合等量營養(yǎng)土和適量水的缽中，放在25℃左右的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。然后，用5 μmol·L-1IAA和0.05% ETH分別處理幼苗，在處理后1、3、6和12 h分別取其葉片；用于的SNP分析和標(biāo)記開發(fā)的谷子品種共19份（電子附表1，用下劃線標(biāo)注的品種）：種植方式與取樣時(shí)期同晉29A和K186；用于標(biāo)記驗(yàn)證的谷子品種：85份谷子品種（電子附表1），其中63份分別來源于中國東北、華北和西北地區(qū)，6份來源于美國，4份來源于日本，另外12份來源于印度。于2015和2016年種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所試驗(yàn)田，行長3 m，行距0.33 m，取拔節(jié)期葉片用于DNA提取，并于植株籽粒成熟時(shí)隨機(jī)選取10穗，稱量其穗重和穗粒重，并隨機(jī)取1 000粒種子稱重，測定千粒重，利用SPSS軟件IBM SPSS Statistics 19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2 SiARGOS家族成員的生物信息學(xué)分析

在NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genome/?term=foxtail+millet）對(duì)已有植物ARGOS蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行BLAST，獲得谷子中所有ARGOS家族成員，采用DNAMAN軟件，結(jié)合擬南芥、水稻、玉米、小麥、短柄草和高粱的ARGOS家族成員進(jìn)行蛋白比對(duì)，并采用MEGA5生成無根進(jìn)化樹，用鄰接法進(jìn)行同源進(jìn)化分析。

1.3 SiARGOS1全長cDNA克隆

通過擬南芥ARGOS基因家族中4個(gè)基因的mRNA序列，在phtozome（http://www.phytozome.net/ search.php）網(wǎng)站進(jìn)行BLAST，獲得一種谷子ARGOS基因家族序列，編號(hào)Seita.8G077300，根據(jù)此序列，采用軟件Primer Premier5.0設(shè)計(jì)包含該基因ORF的引物SiARGOS1（SiARGOS1-1F：5′-ACAAATCCCCAC CCTTGTCA-3′，SiARGOS1-1R：5′-ACTCCTGAAAA GATGCTTCACA-3′），以晉29A和K186的cDNA為模板，擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，經(jīng)克隆測序后得到目標(biāo)序列。PCR擴(kuò)增體系為模板2 μL、2×GC Buffer 10 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL、2 μmol·L-1特異引物4 μL、rTaq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃3 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。取PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.4 SiARGOS1啟動(dòng)子克隆

根據(jù)phtozome（http://www.phytozome.net/search. php）網(wǎng)站序號(hào)Seita.8G077300，將該基因向上游延伸約2 kb，用軟件Primer Premier5.0設(shè)計(jì)啟動(dòng)子區(qū)PCR引物Argos-Pro，（Argos-Pro-F：5′-CTCTGTCGTCTG CAAGCAA-3′和Argos-Pro-R：5′-ACTGACAAGGG TGGGGATTT-3′），以晉29A和K186基因組DNA為模板，擴(kuò)增體系和條件（除退火溫度和延伸時(shí)間改為60℃ 30 s，72℃ 2 min）同上，經(jīng)克隆測序獲得該基因啟動(dòng)子區(qū)序列。將獲得的啟動(dòng)子序列提交到PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/），進(jìn)行順式作用元件的預(yù)測。

1.5 RT-PCR和qRT-PCR分析

取豫谷1號(hào)抽穗后第7天的根、莖、葉和幼穗，分別提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，另外，用5 μmol·L-1IAA和0.05% ETH分別處理豫谷1號(hào)生長10 d的幼苗，在處理后1、3、6和12 h分別取樣，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物為SiARGOS1-RT-F：5′-TTGCGTCGA CTTACTTCAGC-3′，SiARGOS1-RT-R：5′-CATGCTC CTCACATCGGTTG-3′。以谷子作為對(duì)照（SiActin-F：5′-TTCCCTGGTATTGCTGACCG-3′，SiActin-R：5′-CTCACCCTTCGAGATCCACA-3′）。半定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃30 s，72℃30 s，28個(gè)循環(huán)；72℃5 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離；采用Bio-Rad C1000 cycler real time PCR system進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，反應(yīng)體系為1/10 cDNA template（反轉(zhuǎn)錄第一鏈）1 μL、SYBR Premix Ex Taq （DRR041D）5 μL、2 μmol·L-1特異引物1 μL，補(bǔ)充ddH2O至10 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min。65℃—98℃繪制溶解曲線。采用比較閾值法進(jìn)行定量分析，手工設(shè)定熒光閾值，確定循環(huán)數(shù)Ct值，根據(jù)Ct值，計(jì)算各樣本的C值，C=2-ΔCt，ΔCt=Ct目標(biāo)基因－Ct內(nèi)標(biāo)基因。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)并采用雙尾等方差檢驗(yàn)的方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（＜0.05）。

1.6 SNP和單倍型分析及功能標(biāo)記開發(fā)

對(duì)19份谷子材料進(jìn)行基因編碼區(qū)及啟動(dòng)子全長測序，用引物SiARGOS1和Argos-Pro分別進(jìn)行編碼區(qū)和啟動(dòng)子擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，利用DNAstar軟件系統(tǒng)的Sequman、Editseq和MegAlign軟件包進(jìn)行DNA序列的分析，包括拼接、整理與SNP和單倍型分析。引物SiARGOS1的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ⅱ（CGˇCG）酶切后的片段差異，用于檢測151 bp位點(diǎn)的堿基差異；根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)兩處插入和缺失設(shè)計(jì)SSR引物AP-1和AP-2，用于啟動(dòng)子區(qū)的單倍型分型，其中AP-1-F：5′-AGATGAC TCTAAAGGGCATCG-3′，AP-1-R：5′-CAAGGGCAG CAGTGTTTTC-3′；AP-2-F：5′-GTCTTTTGGGATTGT GTCATC-3′，AP-2-R：5′-TGACTAATGTGGTACGGG TC-3′，同時(shí)，開發(fā)的3處標(biāo)記分別用85份谷子品種進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 SiARGOS家族成員的生物信息學(xué)分析

在NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genome/?term=foxtail+millet）對(duì)已有ARGOS蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行BLAST，共找到6個(gè)谷子ARGOS成員，將其分別命名為SiARGOS1、SiARGOS2、SiARGOS3、SiARGOS4、SiARGOS5和SiARGOS6。將得到的谷子ARGOS蛋白與擬南芥、玉米、水稻、小麥、高粱和短柄草的ARGOS蛋白進(jìn)行了蛋白比對(duì)（圖1-A）和進(jìn)化樹分析（圖1-B），結(jié)果表明，與其他已知ARGOS一樣，谷子ARGOS家族具有保守的OSR結(jié)構(gòu)域，包含2個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)（圖1-A）。SiARGOS1、SiARGOS3、SiARGOS5和SiARGOS6與擬南芥AtARGOS以及AtARL聚為一類，其中，SiARGOS1和SiARGOS3與小麥、短柄草和高粱的ARGOS同源性最高，SiARGOS5和SiARGOS6與玉米ZmARGOS1和水稻OsARGOS同源性最高，SiARGOS2和SiARGOS4與擬南芥AtOSR1聚為一類，與玉米ZmARGOS8同源性最高。

2.2 SiARGOS1編碼區(qū)的克隆

獲取擬南芥ARGOS基因家族中4個(gè)基因的mRNA序列，在phtozome（http://www.phytozome.net/ search.php）網(wǎng)站進(jìn)行BLAST，獲得該基因家族的一種谷子序列，編號(hào)Seita.8G077300，經(jīng)比對(duì)分析為而該基因蛋白與擬南芥ARGOS基因家族中的AtARGOS歸為一類，與已有小麥TaARGOSs、高粱SbARGOS和短柄草BdARGOS同源性最高。以晉29A和K186的cDNA為模板，用引物SiARGOS1進(jìn)行擴(kuò)增，獲得兩條特異性條帶，長度為491 bp（圖2-A），經(jīng)克隆測序后發(fā)現(xiàn)的ORF為342 bp，基因編碼113個(gè)氨基酸，位于谷子第8染色體上，核苷酸序列比對(duì)結(jié)果顯示該基因編碼區(qū)序列在晉29A和K186中沒有差異，同時(shí)，用相同引物在基因組DNA中的擴(kuò)增產(chǎn)物也為491 bp，序列一致，說明該基因沒有內(nèi)含子，這與擬南芥，水稻和玉米中報(bào)道的結(jié)果一致[9,13-14]。

A：谷子SiARGOSs和其他植物ARGOS家族的OSR保守結(jié)構(gòu)域，加框的部分為2個(gè)跨膜螺旋，中間部分為一個(gè)由8個(gè)氨基酸（LPPLPPPP）組成的高度保守的富含亮氨酸區(qū)域；Si：谷子；At：擬南芥；Ta：小麥；Zm：玉米；Os：水稻；Bd：短柄草；Sb：高粱。B：ARGOS的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 SiARGOS1啟動(dòng)子的克隆和分析

為進(jìn)一步了解的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，克隆得到起始密碼子前2 109 bp啟動(dòng)子序列（圖2-B），采用PlantCARE對(duì)起始密碼子（ATG）上游的2 109 bp片段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列含有真核生物啟動(dòng)子的典型元件CAAT-box（19個(gè)）和TATA-box（6個(gè)），能夠與起始轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合；該區(qū)域存在AE-box、Box II、G-box、GTGGC-motif和Sp1等5個(gè)與光反應(yīng)有關(guān)的元件；AP-2-like、CGTCA-motif（3個(gè)）、GARE-motif和TGA-element是與乙烯、茉莉酸、赤霉素和生長素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)；GCN4-motif和Skn-1-motif（4個(gè)）是與胚乳表達(dá)相關(guān)的順式作用元件；另外還存在其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的位點(diǎn)（見電子附表2）。

A：SiARGOS1的擴(kuò)增，M：100 bp DNA marker；1：晉29A；2：K186；B：SiARGOS1啟動(dòng)子的擴(kuò)增，M：200 bp DNA marker；1：晉29A；2：K186

2.4 不同組織器官和不同激素條件下SiARGOS1的表達(dá)

在豫谷1號(hào)抽穗后7 d分別取其根、莖、葉和穗，提取總RNA、合成的cNDA經(jīng)均一化、RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR后，檢測在谷子抽穗期不同組織器官中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，的RT-PCR（圖3-A）和實(shí)時(shí)定量PCR（圖3-B）結(jié)果基本一致，該基因在谷子抽穗期的根、莖、葉和穗中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最大，莖和葉次之，而穗中的表達(dá)量最?。▓D3-A）。

A：通過半定量PCR檢測SiARGOS1在不同組織中的表達(dá)；B：通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測SiARGOS1在不同組織中的表達(dá)

通過熒光定量PCR檢測對(duì)不同激素響應(yīng)表達(dá)。結(jié)果顯示，對(duì)IAA不敏感，但受ETH上調(diào)表達(dá)，在ETH處理1和3 h后表達(dá)有所上升，且上升水平基本沒有變化，隨著處理時(shí)間的推移，表達(dá)量進(jìn)一步升高，在12 h表達(dá)量最高（圖4），說明該基因?qū)ιL素響應(yīng)不敏感但受乙烯上調(diào)表達(dá)。

2.5 SiARGOS1的序列分析及標(biāo)記開發(fā)

通過對(duì)19份谷子材料進(jìn)行編碼區(qū)及其啟動(dòng)子測序，發(fā)現(xiàn)有2份材料在該基因編碼區(qū)151 bp（起始密碼子83 bp）處存在一個(gè)SNP（C/G），導(dǎo)致該基因第28個(gè)氨基酸發(fā)生突變（Ala/Gly），該堿基差異導(dǎo)致酶切位點(diǎn)Ⅱ（CGˇCG）發(fā)生變化（CGCG/CGGG，后者序列Ⅱ不能識(shí)別），據(jù)此設(shè)計(jì)了一個(gè)CAPS標(biāo)記（圖5）。用引物SiARGOS1對(duì)材料進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增長度為491 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Ⅱ酶切后，獲得2種基因型，一種為（CGCG）基因型，將其命名為Hap-Ag-C，酶切不能被切開，酶切產(chǎn)物片段大小仍為491 bp，另一種為（CGGG）基因型，將其命名為Hap-Ag-G，經(jīng)酶切產(chǎn)生340和151 bp片段（圖6-A）。

圖4 SiARGOS1對(duì)IAA和ETH的響應(yīng)表達(dá)

序列分析表明啟動(dòng)子區(qū)共存在19處SNP和2處插入和缺失（見電子附表3），根據(jù)-1 652—-1 651處（TA）2/3和-1 165—-1 163處（TCA）1/2的序列差異分別設(shè)計(jì)SSR引物AP-1和AP-2（圖5），用于啟動(dòng)子區(qū)的分型檢測。AP-1（圖6-B）在不同品種的擴(kuò)增條帶分別為206和208 bp，AP-2（圖6-C）在不同品種的擴(kuò)增條帶分別為259和262 bp。

圖5 SiARGOS1的標(biāo)記開發(fā)

A：SiARGOS1 SNP(C/G)位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶AccⅡ酶切位點(diǎn)的CAPS標(biāo)記；M：DNA marker；1—6分別為：蒙選5084、長農(nóng)35號(hào)、沙灣谷子、山東-5、晉29A、K186；B和C分別為SSR標(biāo)記AP-1和AP-2，M：DNA marker；1—19分別為：矮寧黃、沙灣谷子、米優(yōu)、河北十里香、張8311-13、ISE-4、冷生-1、品資15、錢串子、長農(nóng)35號(hào)、山東-5、蒙選5084、PI614817、黑粘谷、茶淀谷、鐵8503、朝108，鵪鶉尾

2.6 功能標(biāo)記驗(yàn)證

用標(biāo)記CPAs-Ⅱ、AP-1和AP-2對(duì)85份品種穗重（panicle weight，PW）、穗粒重（grain weight，GW）和千粒重（thousand-grain weight，TGW）等產(chǎn)量性狀進(jìn)行檢測（表1）。用限制性酶Ⅱ開發(fā)的CPAS標(biāo)記檢測編碼區(qū)151 bp（起始密碼子83 bp）SNP（C/G）位點(diǎn)，Hap-Ag-G基因型有9份，75份為Hap-Ag-C基因型，2種基因型間穗重、穗粒重和千粒重的差異均不顯著；用SSR標(biāo)記AP-1檢測啟動(dòng)子區(qū)-1 652—-1 651處（TA）2/32 bp的缺失，～基因型有42份，43份為TA基因型，2種基因型間穗重、穗粒重和千粒重的差異均不顯著；用SSR標(biāo)記AP-2檢測啟動(dòng)子區(qū)-1 165—-1 163處（TCA）1/23 bp的缺失，～基因型有58份，27份為TCA基因型，2種基因型間千粒重的差異均不顯著，但其穗重和穗粒重在2015和2016年兩年間的差異均達(dá)到了顯著水平。說明根據(jù)該處開發(fā)的SSR標(biāo)記AP-2可作為功能標(biāo)記用于優(yōu)異等位變異的檢測，而位于該基因啟動(dòng)子區(qū)-1 165—-1 163處（TCA）1/23 bp缺失的等位變異可能對(duì)谷子產(chǎn)量性狀有著重要的影響。

表1 85份谷子品種中不同分子標(biāo)記檢測基因型與產(chǎn)量性狀相關(guān)性

*表示基因型間差異達(dá)到5%顯著水平

*indicates significant differences among genotypes at 0.05 probability level

3 討論

本研究通過對(duì)已有ARGOS蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行BLAST，共獲得6個(gè)谷子ARGOS成員，均具有ARGOS家族典型的保守OSR結(jié)構(gòu)域，包含2個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。用擬南芥ARGOS基因家族中4個(gè)基因的mRNA序列在phtozome進(jìn)行BLAST，獲得谷子ARGOS基因家族的一種序列，經(jīng)比對(duì)分析為，該基因蛋白與擬南芥ARGOS基因家族中的AtARGOS歸為一類，而的研究較該基因家族中另外3個(gè)成員最早也更為廣泛和深入，與其歸為一類的水稻[14]、玉米[13]和小麥[15]等均已報(bào)道，它們均參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并對(duì)器官生長有促進(jìn)作用[11]，故對(duì)進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果顯示，該基因位于谷子第8染色體上，在基因組中僅有一個(gè)拷貝，并且編碼區(qū)內(nèi)不含有內(nèi)含子。擬南芥[9]、玉米[13]、水稻[14]、小麥[15]和大白菜[16]ARGOS基因也僅有一個(gè)拷貝并且不含有內(nèi)含子，說明該類基因在植物中保守性。

在豫谷1號(hào)抽穗后7 d的根、莖、葉和穗中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最大，莖和葉次之，而穗中的表達(dá)量最小，這與谷子功能基因網(wǎng)站中（http://structuralbiology.cau.edu.cn/SIFGD/gene_detail. php?gene=Si027037m）查詢的該基因組織表達(dá)特征基本一致，都是在根中表達(dá)量最高，穗部表達(dá)略有不同，這可能與不同生育期取樣有關(guān)；另外，該基因在不同植物組織器官的表達(dá)也不盡相同，擬南芥在根、莖、花、幼嫩的花環(huán)葉和果莢呈現(xiàn)低水平表達(dá)，但在成熟的葉中基本檢測不到[9]；水稻在幼嫩的根、葉和授粉5 d的種子中表達(dá)量較高，而在莖、成熟葉和小穗中表達(dá)量較低[14]。小麥主要在莖部表達(dá)[15]。

通過啟動(dòng)子預(yù)測發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)子除了核心啟動(dòng)元件CAAT-box和TATA-box以外，還包括與乙烯、茉莉酸、赤霉素和生長素等多種植物激素相關(guān)的順式作用元件調(diào)控元件AP-2-like[21]、CGTCA-motif[22]、GARE-motif[23]和TGA-element[24]。在擬南芥ARGOS基因家族中，ARGOS基因受生長素上調(diào)表達(dá)[9]；由油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)，這種誘導(dǎo)依賴于油菜素內(nèi)酯受體BRI1[10]；和通過乙烯誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[11-12]。另外，在水稻[14]中受生長素上調(diào)表達(dá)，在玉米中卻受乙烯下調(diào)表達(dá)[25-26]，而在小麥中又受生長素、乙烯、茉莉酸和赤霉素等多種植物激素誘導(dǎo)表達(dá)[15]，因此，分別選用生長素和乙烯利處理生長10 d谷子幼苗，結(jié)果顯示對(duì)生長素不敏感，但受乙烯利上調(diào)表達(dá)。表明該基因家族中的不同基因受不同植物激素誘導(dǎo)表達(dá)，而且在不同物種中同一基因?qū)Σ煌に氐恼T導(dǎo)表達(dá)也不同，或者在不同的物種中對(duì)植物激素存在一定的特異性，但最終都影響了植物器官大小的調(diào)控。另外，啟動(dòng)子區(qū)還存在與光反應(yīng)和胚乳表達(dá)相關(guān)的元件，但目前還未見與之相關(guān)的研究報(bào)道，有待于進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

功能標(biāo)記（functional marker，F(xiàn)M）是根據(jù)基因內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的，是一種區(qū)分和預(yù)測等位基因及相對(duì)性狀的分子標(biāo)記[27]。水稻的5′調(diào)控區(qū)的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性T/G與其落粒性高度相關(guān)[28]，玉米控制株高和開花期的[29]和[30]、小麥中關(guān)于粒寬和光周期的[31]和[32]、控制番茄果實(shí)大小的[33]等基因都成功用于功能標(biāo)記的研究。目前，谷子中定位了多個(gè)與千粒重、穗長等產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL[3, 34]，但對(duì)于產(chǎn)量性狀相關(guān)的特定基因克隆和功能標(biāo)記開發(fā)目前尚未報(bào)道。根據(jù)及其啟動(dòng)子區(qū)的位點(diǎn)差異開發(fā)了1個(gè)CAPS標(biāo)記和2個(gè)SSR標(biāo)記，都具有位點(diǎn)特異性、共顯性、操作簡便等特點(diǎn)。其中，CPAS-AccⅡ標(biāo)記是根據(jù)基因起始密碼子83 bp處存在一個(gè)SNP（C/G）設(shè)計(jì)的，該處變異導(dǎo)致該基因第28個(gè)氨基酸發(fā)生突變（Ala/Gly），但該位點(diǎn)不在的保守ORS結(jié)構(gòu)域內(nèi)，2種基因型間穗重、穗粒重和千粒重的差異均不顯著；而根據(jù)啟動(dòng)子-1 165—-1 163處（TCA）1/2的序列差異設(shè)計(jì)的SSR標(biāo)記AP-2在2種基因型（～/TCA）間穗重和穗粒重差異均達(dá)到顯著水平，說明AP-2可作為功能標(biāo)記，用于該基因與谷子產(chǎn)量性狀相關(guān)優(yōu)異等位變異的鑒定。這也進(jìn)一步證實(shí)谷子參與器官大小調(diào)控，最終影響谷子產(chǎn)量。

另外，用AP-2檢測基因啟動(dòng)子區(qū)-1 165—-1 163處（TCA）1/23 bp的缺失，我們選取的85份谷子材料，～基因型有58份，27份為TCA基因型，其中攜帶有TCA基因型材料的穗重和穗粒重均顯著高于～基因型的材料，說明-1 165—-1 163處（TCA）1/23 bp的插入為優(yōu)異等位變異。在中國的63份材料中，該變異在育成品種中出現(xiàn)的頻率高于地方種，主要分布在河北（61.54%）、山西（44.44%）、遼寧（57.14%）和山東（44.44%）等4個(gè)省份；在來源于美國和印度的材料中均沒有檢測到，而在來源于日本的材料中該變異出現(xiàn)的頻率為75%，說明在谷子選育過程中受到了一定的選擇，TCA基因型具有較高的谷子育種價(jià)值。

4 結(jié)論

獲得6個(gè)谷子ARGOS成員，均具有ARGOS家族典型的保守OSR結(jié)構(gòu)域，并克隆了與擬南芥AtARGOS歸為一類的家族成員的編碼區(qū)及其啟動(dòng)子序列。其啟動(dòng)子區(qū)含有與植物激素、光周期及胚乳表達(dá)有關(guān)的元件，且在其編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)分別開發(fā)了1個(gè)CAPS-Ⅱ標(biāo)記和2個(gè)SSR標(biāo)記，其中SSR標(biāo)記AP-2可作為功能標(biāo)記，用于該基因與谷子穗重和穗粒重等產(chǎn)量性狀相關(guān)優(yōu)異等位變異的鑒定。該基因在谷子根、莖、葉和穗等器官中均有表達(dá)，對(duì)生長素不敏感，但受乙烯利上調(diào)表達(dá)，與小麥、短柄草和高粱ARGOS蛋白同源性最高。

致謝：感謝美國North Central Regional Plant Introduction Station(NCRPIS)為本研究提供谷子種質(zhì)資源。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Molecular Cloning, Expression Analysis and Development of Functional Markers forGene in Foxtail millet

Wang ZhiLan1, Du XiaoFen1,Wang Jun1, Yang HuiQing1, Wang XingChun2, Guo ErHu1, Wang YuWen1, YuAN Feng1, Tian Gang1, Liu Xin1, Wang QiuLan1, Li HuiXia1, Zhang LinYi1, Peng ShuZhong1

(1Millet Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences/Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Breeding in Minor Crops, Changzhi 046011, Shanxi;2College of Life Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030800, Shanxi)

The homologous genes of(auxin-regulated gene involved in organ size) family were isolated from foxtail millet, which were induced expression by hormone and participate in the regulation of plant organ size. Bioinformatics, including alignment of amino acid sequences and promoter cis acting elements, and the expression pattern in different tissues and plant hormones were analyzed. Functional markers were developed from sequences analysis of gene encoding region and promoter, which will play an important role in genetic improvement of yield traits, accelerate breeding process and increase yield of foxtail millet.The number of ARGOS family members and the sequence of the ARGOS family in foxtail millet were analyzed through BLAST of conserved domain with the existing ARGOS in other plants. The encoding region and promoter sequences ofgene, one of the family members ofin foxtail millet, were obtained with homologous cloning method. The promoter cis acting elements ofwas analyzed by the bioinformatics analysis. Expression patterns in different tissues and plant hormone ofwere analyzed using real-time PCR. Functional markers were developed from sequence analysis of SNP and insertion/deletion in gene encoding region and promoter. Functional markers of elite alleles of yield related traits were tested using data analysis of significant differences between genotypes associated with the yield traits such as panicle weight, grain weight and thousand-grain weight in 85 cultivars.A total of six ARGOS family members were found to have a conserved OSR (Organ Size Related) domain consisting of two transmembrane helical structures and a highly conserved proline-rich motif in foxtail millet. the open reading frame (ORF) and the promoter of, one of the family members homologous towere cloned. Sequence analysis showed that the ORF ofon chromosome 8 encoding a putative protein composed of 113 amino acids was 342 bp in length, without intron. The promoter contains a variety of regulation related components including auxin, ethylene and other plant hormone with 2 109 bp in length.is expressed in all organs of foxtail millet, at high levels in root, whereas at lowest level in panicle. The gene was insensitive to indole-3-acetic acid (IAA), but was up-regulated by ethephon (ETH). On the basis of the alignment of genegenomic DNA sequence, CAPS-Ⅱmarker was developed on the missense polymorphism site (C/G→Ala/Gly) at the 150 bp of the encoding region, two SSR markers, AP-1 and AP-2, were developed at -1652--1651(TA)2/3and -1165--1163(TCA)1/2of promoter, respectively. No significant association was found among the yield associated traits such as panicle weight, grain weight and thousand-grain weight with CAPS-Ⅱ and AP-1 in 85 cultivars. However, AP-2 proved to be highly correlated with panicle weight and grain weight in 85 cultivars, in addition to thousand-grain weight. The average values of panicle weight for two genotypes were 15.52 g and 20.61 g, respectively, while the ones of grain weight for two genotypes were 12.24 g and 16.74 g, respectively.Six ARGOS family members were found in foxtail millet , all of which had conserved OSR domain. The open reading frame (ORF) ofhomologous to, is 342 bp in length without intron. The SSR marker AP-2, which was developed in the promoter region of thegene, could be used as functional marker for the selection of superior allelic variation in yield traits such as panicle weight and panicle weight of foxtail millet varieties.

foxtail millet;;promoter; expression analysis; functional marker

2017-04-17；

山西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2015013001-09）、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（2015ZYZX-04）、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技自主創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目（2016ZZCX-09）、山西省青年基金（2015021143）、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新研究課題（ZDSYS1504）

接受日期：2017-05-03

聯(lián)系方式：王智蘭，Tel：15234582699；E-mail：wangyan11111ai@163.com。杜曉芬，Tel：18636509393；E-mail：dxf6285210@126.com。王智蘭和杜曉芬為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者王軍，Tel：13333550810；E-mail：128wan@163.com。通信作者郭二虎，Tel：13994673899；E-mail：guoerhu2003@163.com