趙靜，孫洋，譚永安，肖留斌，姜義平，柏立新

?

甜菜夜蛾卵黃原蛋白多克隆抗體制備及其在不同發(fā)育時(shí)期蛋白表達(dá)

趙靜，孫洋，譚永安，肖留斌，姜義平，柏立新

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，南京 210014）

制備甜菜夜蛾（）卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）多克隆抗體，并檢測(cè)甜菜夜蛾不同發(fā)育時(shí)期血淋巴中的Vg蛋白表達(dá)量變化，為進(jìn)一步研究Vg轉(zhuǎn)運(yùn)與利用機(jī)制以及生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成蟲cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到甜菜夜蛾基因片段，其包含vitellogenin-N結(jié)構(gòu)功能區(qū)。將目的片段連入pMD-19T載體后進(jìn)行測(cè)序，利用DNAMAN軟件分析該基因序列的準(zhǔn)確性及編碼蛋白的特性。將測(cè)序正確的基因片段通過(guò)I和I限制性內(nèi)切酶連接到原核表達(dá)載體pCzn1。將重組表達(dá)載體pCzn1-轉(zhuǎn)入大腸桿菌ArcticExpress，離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，超聲波破碎菌體沉淀，取上清液與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，分析Vg重組蛋白的可溶性。在不同溫度、不同濃度IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)Vg重組蛋白，篩選最優(yōu)表達(dá)條件。經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和層析柱純化得到了Vg重組蛋白，將該蛋白免疫新西蘭白兔，制備兔抗Vg血清抗體。采用間接ELISA方法檢測(cè)血清抗體的效價(jià)，并通過(guò)Western blot法檢測(cè)甜菜夜蛾雌蟲不同發(fā)育階段血淋巴中Vg蛋白的表達(dá)差異。擴(kuò)增所得基因片段為2 091 bp，編碼697個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)蛋白分子量為80.88 kD。通過(guò)大腸桿菌表達(dá)出的Vg重組蛋白相對(duì)分子量為80 kD，其大小與預(yù)期的Vg重組蛋白帶大小相符合。其主要以包涵體形式表達(dá)，而在上清中表達(dá)量不明顯。不同溫度、不同濃度IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)Vg重組蛋白的結(jié)果顯示溫度為25℃，IPTG濃度為0.6 mmol·L-1時(shí)，Vg重組蛋白表達(dá)量最高。繼續(xù)提高溫度和IPTG濃度，對(duì)提高Vg重組蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯作用，且雜蛋白增多。新西蘭白兔經(jīng)4次免疫后，間接ELISA法檢測(cè)表明，制備的兔抗Vg抗體具有較好的靈敏度，效價(jià)達(dá)到 1﹕512 000。Western blot檢測(cè)Vg蛋白在甜菜夜蛾不同發(fā)育階段血淋巴中的表達(dá)，其雜交出的單一條帶在180 kD左右。Vg蛋白在甜菜夜蛾雌蛹末期開始微弱表達(dá)。雌成蟲羽化后血淋巴中Vg蛋白表達(dá)量先升高后降低，呈動(dòng)態(tài)變化，到羽化48 h表達(dá)量最高，隨后降低。純化獲得了Vg重組蛋白，并明確了最優(yōu)表達(dá)條件（溫度為25℃，IPTG濃度為0.6 mmol·L-1）；制備了高效價(jià)的甜菜夜蛾Vg多克隆抗體，明確了甜菜夜蛾Vg蛋白的表達(dá)規(guī)律。

甜菜夜蛾；卵黃原蛋白基因；原核表達(dá)；抗體制備；表達(dá)模式

0 引言

【研究意義】甜菜夜蛾（）屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），是一種世界性分布的多食性重要害蟲，可嚴(yán)重危害多種重要經(jīng)濟(jì)作物[1-2]。近年來(lái)，由于蔬菜、Bt棉等適生性蟲源寄主種植面積的擴(kuò)大等因素，中國(guó)暴發(fā)頻度呈上升趨勢(shì)。其暴發(fā)的主要原因是繁殖能力強(qiáng)及較高的抗藥性[3-4]。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于甜菜夜蛾的生殖生理研究還很薄弱，僅在生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與發(fā)育分級(jí)方面有部分報(bào)道[5-6]。卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）的合成與卵黃的沉積是卵形成的關(guān)鍵因素，其含量直接影響雌成蟲產(chǎn)卵潛力。通過(guò)開展甜菜夜蛾卵黃發(fā)生的研究，可充分揭示甜菜夜蛾成蟲大量產(chǎn)卵的內(nèi)在規(guī)律，對(duì)該蟲害種群測(cè)報(bào)與防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在大部分昆蟲中，Vg是卵黃蛋白的前體，它由雌性脂肪體在激素的調(diào)控下合成，分泌到血淋巴，被卵母細(xì)胞通過(guò)卵黃原蛋白受體（vitellogenin receptor，VgR）調(diào)節(jié)的內(nèi)吞作用所攝取，經(jīng)修飾、切除、加工后以晶體形式沉積為卵黃磷蛋白（vtellin，Vt）。迄今，有關(guān)昆蟲的分子特性、功能、卵黃發(fā)生的時(shí)間動(dòng)態(tài)以及卵黃發(fā)生的內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)理等已有許多研究，涉及的昆蟲包括11目80余種[7-15]。不同昆蟲類群或同一昆蟲類群不同種類的個(gè)體，Vg合成與攝取的時(shí)間并不相同，這一性質(zhì)決定了昆蟲卵黃發(fā)生的時(shí)間差異。在鱗翅目中，對(duì)于成蟲不取食的蛾類，Vg合成啟動(dòng)在末齡幼蟲、預(yù)蛹或蛹初期，如舞毒蛾（）始于末齡幼蟲[16]；天蠶（）始于結(jié)繭的預(yù)蛹期[17]；而對(duì)于成蟲取食的蛾類，Vg合成和啟動(dòng)在蛹末期或成蟲期，如斜紋夜蛾（）[15]和美洲棉鈴蟲（）[17]。隨著RNA干擾技術(shù)的發(fā)展，已有研究表明Vg不僅為胚胎發(fā)生提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它在生物體內(nèi)還具有氣候適應(yīng)、激活卵巢、生殖競(jìng)爭(zhēng)、行為構(gòu)建、延長(zhǎng)壽命、轉(zhuǎn)化食物、抗氧化、傳播病毒等其他的功能[18-20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】昆蟲Vg的功能為人們利用或抑制昆蟲提供了新思路，在前期研究中甜菜夜蛾序列已克隆得到，但甜菜夜蛾Vg蛋白的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收機(jī)制以及生物學(xué)功能尚不明確。目前，研究Vg含量的動(dòng)態(tài)變化主要采用免疫印跡方法，因此制備Vg抗體是研究的關(guān)鍵?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在前期獲得卵黃原蛋白全長(zhǎng)序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)分離純化特異性肽鏈，制備其多克隆抗體，并通過(guò)Western blot分析甜菜夜蛾不同發(fā)育時(shí)期Vg含量的動(dòng)態(tài)變化，揭示其卵黃發(fā)生規(guī)律，為在蛋白水平上進(jìn)一步研究甜菜夜蛾Vg轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收機(jī)制以及生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 材料

供試甜菜夜蛾蟲源來(lái)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所作物蟲害研究室。甜菜夜蛾飼養(yǎng)條件為溫度（26.5±1）℃，相對(duì)濕度（65±5）%，光周期 L﹕D=14 h﹕10 h，成蟲期補(bǔ)充10%蜂蜜水。

1.2 方法

1.2.1 Vg表達(dá)引物設(shè)計(jì)與序列擴(kuò)增 根據(jù)筆者實(shí)驗(yàn)室前期已發(fā)表的甜菜夜蛾的全長(zhǎng)序列[21]（GenBank登錄號(hào)：KT599434），設(shè)計(jì)含有I和I酶切位點(diǎn)的特異性引物。用于擴(kuò)增的特異性片段，包含 Vitellogenin-N 結(jié)構(gòu)區(qū)。引物由上海生工合成。正向引物序列為：5′-GGGTTTCATATGTG GCAAACTGGCAAACT-3′，反向引物序列：5′-CTCTA GAAATTCCACTCTTGATAGC-3′。采用Trizol reagent（Invitrogen）提取羽化24 h的甜菜夜蛾雌成蟲（從破蛹而出開始計(jì)算羽化時(shí)間）總RNA，用M-MLV酶（Promega）反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以此cDNA為模板用特異性引物擴(kuò)增特異性片段。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性 3 min，然后按照 94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 120 s，進(jìn)行 30 次循環(huán)反應(yīng)，最后于 72℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，并通過(guò)膠回收試劑盒（Axygen）純化回收目的DNA片段。目的片段與pMD-19T 載體（TaKaRa）連接，經(jīng)PCR篩選陽(yáng)性克隆后，送上海生工測(cè)序。利用DNAMAN軟件分析該基因序列的準(zhǔn)確性及預(yù)測(cè)編碼蛋白的大小。重組載體命名為 pMD19T-。

1.2.2 Vg原核表達(dá)載體的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶I和I酶（TaKaRa）雙酶切回收的PCR產(chǎn)物和空pCzn1載體（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院昆蟲實(shí)驗(yàn)室保存），回收目的片段及表達(dá)載體，經(jīng)T4 DNA連接酶（TaKaRa）連接，16℃過(guò)夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌ArcticExpress（北京華越洋），在含有氨芐青霉素（Amp）的平板上抗性篩選培養(yǎng)，通過(guò)酶切及PCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性克隆，并將確認(rèn)為陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒送上海生工測(cè)序，分析是否為目的片段序列，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為 pCzn1-。

1.2.3Vg重組蛋白的可溶性分析及表達(dá)條件的優(yōu)化 接種鑒定正確的重組子于含有50 μg·ml-1Amp的 3 ml LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，1﹕100轉(zhuǎn)接于30 ml LB（含Amp）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至 OD600值為0.5時(shí)，加入IPTG分別調(diào)至終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1，于37℃、200 r/min進(jìn)行誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)4 h后收集1 ml菌液，6 000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS重懸菌體沉淀；超聲波破碎菌體沉淀并離心，取上清液與沉淀進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測(cè)分析Vg 重組蛋白的可溶性及最適的 IPTG 濃度。在最適的IPTG終濃度進(jìn)行溫度優(yōu)化，將誘導(dǎo)溫度分別調(diào)整至 20、25、30和 35℃，根據(jù)Vg重組蛋白表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果確定誘導(dǎo)最佳溫度。

1.2.4 Vg包涵體蛋白的制備和純化 在最適 IPTG 濃度和溫度條件下進(jìn)行 Vg目的蛋白大規(guī)模的誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)菌液在低溫4℃條件下，60 000 r/min離心10 min，菌體沉淀與20 ml裂解buffer（包含20 mmol·L-1Tris-HCl、1 mmol·L-1PMSF和細(xì)菌蛋白酶抑制劑cocktail混合液，pH 8.0）重懸，重懸液進(jìn)行超聲破碎（功率 400 W，工作 4 s，間歇8 s，共20 min）；將超聲破碎的細(xì)胞裂解液4℃10 000×離心20 min，收集沉淀；使用包涵體洗滌液（20 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1EDTA，2 mol·L-1尿素，1 mol·L-1NaCl，1% Triton X-100，pH 8.0）洗滌包涵體3次；用溶解緩沖液（20 mmol·L-1Tris，5 mmol·L-1DTT，8 mol·L-1尿素pH 8.0），按一定比例溶解包涵體，4℃放置過(guò)夜。利用低壓層析系統(tǒng)，包涵體溶液以0.5 ml·min-1流速上樣至Ni-IDA親和層析柱（Novagen），用Ni-IDA緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫液。將洗脫液裝入透析袋，于4℃經(jīng)0.01 mol·L-1PBST 溶液（pH 8.0）透析過(guò)夜后獲得 Vg純化蛋白。采用 12% SDS-PAGE檢測(cè)Vg重組蛋白的純度。

1.2.5 Vg多克隆抗體的制備 取純化的Vg重組蛋白進(jìn)行BCA蛋白濃度測(cè)定，免疫2只新西蘭白兔（2—2.5 kg）（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供），進(jìn)行皮下注射，每次免疫量為 400 μg，2—3周免疫一次，共免疫 4 次。第4次免疫后在大白兔頸動(dòng)脈采血，8 000 r/min 離心8 min所得上清制備抗血清并準(zhǔn)備純化抗體。將Vg蛋白與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)制備成抗原親和純化層析柱，將PBS與所得抗血清等量混合后緩慢上樣，待抗體抗原結(jié)合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫得到所需純化抗體，并在PBS緩沖液中進(jìn)行4℃透析過(guò)夜，隔日進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。

1.2.6 效價(jià)測(cè)定 用間接ELISA法對(duì)抗體進(jìn)行最終的效價(jià)測(cè)定。以純化的Vg蛋白（5 μg·mL-1）包被ELISA 板，混勻后加入板條中，每孔加入100 μL，4℃過(guò)夜。用PBST（0.2 g KCl，0.2 g KH2PO4，2.9 g Na HPO4·12H2O，8 g NaCl，0.05% Tween-20，pH 7.4）洗滌3次，每次5 min后，加入封閉液（含5%牛血清白蛋白的PBST）于37℃封閉2 h。取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi)液，用PBST洗板3次，加入用PBST連續(xù)倍比稀釋（500×20—500×210）的Vg多克隆抗體和陰性血清（免疫前健康兔血清）每孔100 μl，37℃恒溫箱1 h。同上洗滌后，加入100 μl的用PBST以1﹕5 000稀釋的二抗HRP-IgG，37℃放置 1 h。用PBST洗板3次，每次5 min，最后加 100 μl TMB 底物液顯色，37℃顯色15 min，待終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀測(cè)定 A450值。

1.2.7 多克隆抗體檢測(cè)甜菜夜蛾不同發(fā)育階段血淋巴Vg含量 采用背血管取血淋巴法[15,22]，用定量玻璃毛細(xì)管直接插入甜菜夜蛾胸部背血管，收集甜菜夜蛾不同發(fā)育時(shí)期（化蛹1—7 d的雌蛹，羽化0、12、24、48、60、72 h的雌成蟲）血淋巴樣品。甜菜夜蛾不同發(fā)育時(shí)期的血淋巴樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取自5頭試蟲，每頭試蟲定量吸取1 μl血淋巴，共5 μl。每個(gè)樣品用PBS溶液稀釋100 倍，上樣 10 μl，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上。轉(zhuǎn)印 PVDF 膜后，取下膜先用 PBST 洗滌 4 次，每次5 min，然后將膜用含5%脫脂奶粉的PBST封閉液置于37℃封閉 1 h，加入用 PBST 以1﹕5 000稀釋比例的一抗（上述制備的Vg多克隆抗體），膜在一抗稀釋液中4℃過(guò)夜。次日將膜取出后，用PBST洗膜4次，每次5 min。用PBST以1﹕5 000的比例稀釋二抗HRP-IgG（上海生工），膜在二抗中37℃反應(yīng) 1 h。反應(yīng)完畢后，把膜取出置于干凈的盒子中用PBST洗膜 4次，ECL顯影，曝光。

2 結(jié)果

2.1 甜菜夜蛾Vg片段的擴(kuò)增和克隆

以羽化24 h的甜菜夜蛾成蟲cDNA為模板，用加酶切位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，呈現(xiàn)一條大小與預(yù)期相吻合的目的DNA條帶，約為2 091 bp（圖 1）。將此特異性條帶切膠回收，連接到pMD-19T載體，并挑斑鑒定。同時(shí)，測(cè)序克隆載體也驗(yàn)證了序列的正確性。序列長(zhǎng)度 2 091 bp，編碼 697 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為 80.88 kD。

1：PCR 產(chǎn)物PCR product；M：DL2000 DNA Marker

2.2 Vg原核表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)I和I雙酶切的基因片段，亞克隆到pCzn1載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ArcticExpress，挑選平板上單一的菌落抽提質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。如圖2所示，正確的重組質(zhì)粒酶切后呈現(xiàn)兩條清晰的條帶，一條帶為 2 091 bp的片段，另一條帶為約4 400 bp的pCzn1載體。此外采用DNAMAN軟件分析該重組質(zhì)粒測(cè)序所得序列，結(jié)果顯示基因序列無(wú)突變?nèi)笔В砻鱬Czn1-載體構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白表達(dá)的鑒定

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，重組克隆菌的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析表明在80 kD處出現(xiàn)了一條新蛋白帶，其大小與預(yù)期的Vg重組蛋白帶大小相符合，其在沉淀中表達(dá)量較高而在上清中表達(dá)量不明顯（圖3）。

2.4 表達(dá)條件的優(yōu)化

2.4.1 IPTG濃度 以未誘導(dǎo)的菌體作為對(duì)照，用0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol·L-1的IPTG濃度誘導(dǎo)，隨著 IPTG 加入量的增加，Vg蛋白表達(dá)量也明顯增加（圖4）。當(dāng)IPTG 濃度為0.6 mmol·L-1時(shí)，Vg蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)最大化，而繼續(xù)提高 IPTG 的濃度對(duì)提高蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯作用。

M：DL5000 DNA Marker；1：pCzn1-Vg質(zhì)粒雙酶切pCzn1-Vg ingested by Nde I/Xba I

M：蛋白marker Protein marker；1：未經(jīng)誘導(dǎo) pCzn1-Vg表達(dá)產(chǎn)物The expression product of pCzn1-Vg without inducing；2：pCzn1-Vg 誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物induced expression product of pCzn1-Vg；3：誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物上清液the precipitate induced by IPTG；4：誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物沉淀The supernatant induced by IPTG

2.4.2 誘導(dǎo)溫度 在0.6 mmol·L-1的最適IPTG 濃度下，隨著誘導(dǎo)溫度的升高，沉淀蛋白的表達(dá)量在25℃時(shí)有明顯提高（圖5）。25℃以后，隨著溫度升高，蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化，且雜蛋白量增多。

M：蛋白Marker Protein Marker；1—6：IPTG 濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mmol·L-1時(shí)，pCzn1-Vg 轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)后破菌沉淀Precipitates of pCzn1-Vg induced by IPTG at the concentration of 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 and 1.0 mmol·L-1, respectively

M：蛋白Marker Protein Marker；1—4：加入 0.6 mmol·L-1 IPTG分別在20、25、30和35℃時(shí)誘導(dǎo)，pCzn1-Vg轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)后破菌沉淀Precipitate of pCzn1-Vg by induction with 0.6 mmol·L-1 IPTG at 20, 25, 30, and 35℃

2.5 Vg重組蛋白的純化檢測(cè)

Vg包涵體蛋白經(jīng)過(guò)變復(fù)性的方式，重溶目標(biāo)蛋白，通過(guò)Ni柱樹脂親和純化獲得目標(biāo)蛋白，進(jìn)行12% SDS-PAGE 分析，用Ni-IDA緩沖液洗脫，可獲得一條約為 80 kD 的清晰的特異性蛋白條帶（圖6）。

M：蛋白Marker Protein Marker；1：Vg包涵體蛋白Precipitate from pCzn1-Vg；2：純化后的 Vg 重組蛋白Purified Vg recombinant protein

2.6 Vg多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

新西蘭白兔經(jīng)4次免疫后，用間接ELISA法檢測(cè)Vg多克隆抗體的效價(jià)。Vg多克隆抗體和陰性血清（免疫前健康兔血清）按 500×20（500）至 500×210（512 000）連續(xù)倍比稀釋，結(jié)果表明，當(dāng)Vg抗體稀釋512 000 倍時(shí)，OD陽(yáng)性/OD陰性＞2.0，其終效價(jià)可達(dá) 1﹕512 000。

2.7 多克隆抗體檢測(cè)甜菜夜蛾不同發(fā)育階段血淋巴中Vg的含量

分別取化蛹 1—6 d的雌蛹以及剛羽化，羽化 12、24、48、60、72 h的甜菜夜蛾成蟲血淋巴樣品，用Western blot檢測(cè)Vg蛋白在甜菜夜蛾不同發(fā)育階段血淋巴中的表達(dá)差異（圖7）。其雜交出的單一條帶在180 kD左右。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示Vg僅在甜菜夜蛾雌蟲中表達(dá)，從蛹末期開始微弱表達(dá)。成蟲羽化后血淋巴中Vg表達(dá)量先升高后降低，呈動(dòng)態(tài)變化，到羽化 48 h表達(dá)量最高，隨后降低。

3 討論

昆蟲Vg是由 6—7 kb的mRNA編碼，首先形成分子量約為200 kD的前體蛋白，然后卵裂位點(diǎn)將其分裂成 40—60和140—190 kD大小兩種亞基，亞基經(jīng)聚合、修飾后形成Vg[23]。在前期研究中，通過(guò)對(duì)甜菜夜蛾序列的分析，總長(zhǎng)5 694 bp，編碼1 761個(gè)氨基酸，總分子量為200 kD左右，預(yù)測(cè)蛋白水解酶在卵裂位點(diǎn)RTLR將其分解成大小兩個(gè)亞基（141和58 kD）。本研究用于原核表達(dá)的肽鏈vitellogenin-N區(qū)是一個(gè)脂蛋白結(jié)構(gòu)域，主要用于運(yùn)輸脂質(zhì)[24]，表達(dá)的Vg重組蛋白為80 kD左右，其包含卵裂位點(diǎn)RTLR。理論上用Vg重組蛋白免疫家兔制備的多克隆抗體對(duì)Vg大小亞基都有免疫反應(yīng)，但Western blot結(jié)果顯示在雌蟲血淋巴中，只檢測(cè)出Vg的一個(gè)大亞基（180 kD左右）。有研究表明，在同屬夜蛾科的斜紋夜蛾中，通過(guò)分離卵提取物卵黃蛋白制備Vg多克隆抗體對(duì)卵與雌性血淋巴進(jìn)行Western blot分析，也只能檢測(cè)出Vg的一個(gè)大亞基[14]。因此筆者推測(cè)，像一些高等膜翅目昆蟲如日本瘤姬蜂（）[25]一樣，甜菜夜蛾中只有編碼大亞基的部分才有轉(zhuǎn)錄活性，而編碼小亞基單位的部分缺失或不表達(dá)。

M：蛋白marker Protein Marker；1—6：化蛹1-6 d的雌蛹Female pupae from 1st to 6th day；7—12：剛羽化雌成蟲、羽化12、24、48、60、72 h雌成蟲0-, 12-, 24-, 48-, 60-, 72-h-old adults

昆蟲Vg在體內(nèi)合成具有性別、發(fā)育時(shí)期和組織的特異性。在大多數(shù)昆蟲中，脂肪體是Vg合成的唯一場(chǎng)所，然后分泌到血淋巴，被卵母細(xì)胞通過(guò)卵黃原蛋白受體吸收[7]。在前期的研究中，筆者克隆得到甜菜夜蛾序列，同時(shí)明確了僅在雌蟲脂肪體表達(dá)，而在中腸、馬氏管、卵巢等組織中不表達(dá)。鱗翅目昆蟲Vg合成啟動(dòng)時(shí)間根據(jù)成蟲是否取食的特性在不同類群中存在差異性。本研究測(cè)定的甜菜夜蛾Vg蛋白表達(dá)動(dòng)態(tài)結(jié)果顯示 Vg在甜菜夜蛾雌蟲蛹末期開始微弱表達(dá)，成蟲羽化后Vg表達(dá)量先升高后降低，呈動(dòng)態(tài)變化，到羽化48 h表達(dá)量最高，隨后降低。甜菜夜蛾Vg合成和啟動(dòng)在蛹末期，這與大多數(shù)屬于成蟲補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)型的蛾類Vg合成和啟動(dòng)時(shí)間一致，如煙草天蛾（）[17]和斜紋夜蛾[15]。而對(duì)于成蟲不取食型的蛾類，如同屬于鱗翅目的舞毒蛾[16]，Vg在末齡幼蟲就開始表達(dá)。不同蛾類Vg合成啟動(dòng)時(shí)間不同，這可能是由個(gè)體內(nèi)在特有的內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控決定的。

在害蟲預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)中，通過(guò)剖解昆蟲的卵巢發(fā)育進(jìn)度可以預(yù)測(cè)其田間產(chǎn)卵量。而昆蟲Vg蛋白表達(dá)量的變化與卵巢發(fā)育進(jìn)度緊密相關(guān)，這在很多昆蟲如美洲蜚蠊（）[11]、猛蟻（）[26]、草地貪夜蛾（）[27]、斜紋夜蛾[14]中已得到證實(shí)。根據(jù)甜菜夜蛾雌蛾的卵巢形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，將其卵巢發(fā)育進(jìn)度分為5級(jí)，即乳白透明期、卵黃沉積期、成熟待產(chǎn)期、產(chǎn)卵盛期、產(chǎn)卵末期[6]。通過(guò)對(duì)室內(nèi)甜菜夜蛾種群不同日齡的卵巢組織進(jìn)行解剖，結(jié)果顯示在甜菜夜蛾蛹末期（羽化前2 d）是乳白透明期，卵巢處于萌芽階段，脂肪體量多而飽滿。這一階段本研究測(cè)定的Vg蛋白表達(dá)動(dòng)態(tài)結(jié)果顯示Vg表達(dá)開始啟動(dòng)，但表達(dá)量較弱，與觀察到的卵黃沉積較少，卵巢管基本處于透明狀的現(xiàn)象基本相符。從蛹體發(fā)黑即將要羽化至羽化48 h是卵黃沉積期，這一時(shí)期卵巢管伸長(zhǎng)，管內(nèi)卵量急速增加，未成熟的卵粒較多，卵巢發(fā)育所需求的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)急劇增加。因此，Vg表達(dá)量在蛋白水平上進(jìn)入快速增長(zhǎng)期。羽化48 h之后甜菜夜蛾卵巢進(jìn)入成熟待產(chǎn)期，進(jìn)入待產(chǎn)期后，脂肪體明顯變少，卵巢管內(nèi)有大量成熟的卵存在，而此刻未成熟的卵粒較少，所需求的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，Vg蛋白表達(dá)量也開始降低。本研究血淋巴中Vg蛋白表達(dá)量的趨勢(shì)變化與筆者前期對(duì)甜菜夜蛾脂肪體組織中表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果[21]基本一致。因此，綜合Vg表達(dá)動(dòng)態(tài)及卵巢發(fā)育進(jìn)度的結(jié)果，筆者認(rèn)為在甜菜夜蛾進(jìn)入產(chǎn)卵盛期（羽化3—4 d）前，已基本完成了卵黃沉積的主要過(guò)程。

甜菜夜蛾寄主范圍廣，食性雜，并具有繁殖能力強(qiáng)、易產(chǎn)生抗藥性、遷飛擴(kuò)散能力強(qiáng)等特點(diǎn)[28-30]，因而極易猖獗發(fā)生、暴發(fā)成災(zāi)，現(xiàn)已列入世界性極難治理的重大害蟲范圍。Vg是胚胎發(fā)育營(yíng)養(yǎng)的主要來(lái)源，在昆蟲生殖過(guò)程中起重要作用，也是害蟲種群增殖的關(guān)鍵因子。用于制備甜菜夜蛾Vg多克隆抗體的抗原有兩種，一種是表達(dá)蛋白，另一種為甜菜夜蛾卵提取物即卵黃蛋白。Moon等[14]曾利用甜菜夜蛾的卵提取物制備了Vg抗體，但其特異性效果不好，在目標(biāo)蛋白附近220 kD的位置有交互免疫性，不利于對(duì)Vg的表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。本研究通過(guò)原核表達(dá)的vitellogenin-N結(jié)構(gòu)區(qū)，制備了高效價(jià)，高純度，特異性強(qiáng)的多克隆抗體，并測(cè)定了血淋巴中Vg的動(dòng)態(tài)變化。研究結(jié)果一方面可揭示甜菜夜蛾卵黃發(fā)生規(guī)律與卵巢發(fā)育進(jìn)度及產(chǎn)卵動(dòng)態(tài)的內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)于甜菜夜蛾的監(jiān)測(cè)防治具有重要意義；另一方面也可為進(jìn)一步研究甜菜夜蛾Vg吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

克隆了甜菜夜蛾的功能區(qū)片段，該基因片段序列長(zhǎng)度 2 091 bp，編碼697個(gè)氨基酸。同時(shí)獲得了原核表達(dá)的Vg純化蛋白，明確了蛋白最優(yōu)表達(dá)條件（溫度為25℃，IPTG濃度為0.6 mmol·L-1）；制備了甜菜夜蛾Vg多克隆抗體，通過(guò)Western blot明確了甜菜夜蛾 Vg 蛋白的表達(dá)規(guī)律。

[1] FARAHANI S, NASERI B, TALEBI A A. Comparative life table parameters of the beet armyworm,(Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) on five host plants., 2011, 13(1): 91-101.

[2] AZIDAH A A, SOFIAN-AZIRUN M. Life history of(Lepidoptera: Noctuidae) on various host plants., 2006, 96: 613-618.

[3] 戴瀚洋, 孫洋, 柏立新, 趙靜, 肖留斌, 譚永安. 亞致死濃度甲維鹽脅迫對(duì)甜菜夜蛾幼蟲解毒酶系活力及其相關(guān)基因表達(dá)量的影響. 棉花學(xué)報(bào), 2015, 27(2): 149-158.

DAI H Y, SUN Y, BAI L X, ZHAO J, XIAO L B, TAN Y A. Activities of detoxification enzymes and expressions of related genes inlarvae treated with sublethal concentrations of emamectin benzoate., 2015, 27(2): 149-158. (in Chinese)

[4] 文禮章, 張友軍. 我國(guó)甜菜夜蛾大尺度暴發(fā)頻度與廣域溫度和廣域降雨量關(guān)系的預(yù)測(cè)模型. 昆蟲學(xué)報(bào), 2010, 53(12): 1367-1381.

WEN L Z, ZHANG Y J. Modelling of the relationship between the frequency of large-scale outbreak of the beet armyworm,(Lepidoptera: Noctuidae) and the wide-area temperature and rainfall trends in China., 2010, 53(12): 1367-1381. (in Chinese)

[5] 王憲輝, 徐洪富, 許永玉, 劉勇, 周真. 甜菜夜蛾雌性生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、發(fā)育分級(jí)及在測(cè)報(bào)上的應(yīng)用. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2003, 30(3): 261-266.

WANG X H, XU H F, XU Y Y, LIU Y, ZHOU Z. The structures and developmental progress of reproductive system of beet armyworm,(Hübner), and their use in forecast., 2003, 30(3): 261-266. (in Chinese)

[6] 韓蘭芝, 翟保平, 戴率善, 張孝羲, 劉培磊. 江蘇豐縣甜菜夜蛾田間種群蟲源性質(zhì)分析. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2004, 24(7): 1388-1398.

HAN L Z, ZHAI B P, DAI S S, ZHANG X Y, LIU P L. Analysis on the population status of the beet armyworm,(Hübner) in Fengxian, Jiangsu Province, China., 2004, 24(7): 1388-1398. (in Chinese)

[7] 戈林泉, 吳進(jìn)才. 昆蟲卵黃蛋白及其激素調(diào)控的研究進(jìn)展. 昆蟲知識(shí), 2010, 47(2): 236-246.

GE L Q, WU J C. Research progress in insect vitellin and its hormone regulation., 2010, 47(2): 236-246. (in Chinese)

[8] 葉恭銀, 呂慧平, 蔣彩英. 昆蟲卵黃蛋白分子的多樣性與進(jìn)化關(guān)系//李典謨. 走向二十一世紀(jì)的中國(guó)昆蟲學(xué). 北京: 中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社, 2001: 178-189.

YE G Y, Lü H P, JIANG C Y. Diversity and phylogeny of yolk proteins in insects//Li D M.. Beijing: Chinese Science and Technology Press, 2001: 178-189. (in Chinese)

[9] 董勝?gòu)? 高秀云, 程正賢, 胡萃, 葉恭銀. 蝶蛹金小蜂卵黃蛋白單克隆抗體的制備及其應(yīng)用方法的建立. 昆蟲學(xué)報(bào), 2007, 50(9): 871-877.

DONG S Z, GAO X Y, CHENG Z X, HU C, YE G Y. Development of monoclonal antibodies to the vitellin in an endoparasitoid,(Hymenoptera: Pteromalidae) and its application methods., 2007, 50(9): 871-877. (in Chinese)

[10] TUFAIL M, LEE J M, HATAKEYAMA M, OISHI K, TAKEDA M. Cloning of vitellogenin cDNA of the American cockroach,(Dietyoptera) and its structural and expression analyses., 2000, 45(1): 37-46.

[11] TUFAIL M, TAKEDA M. Molecular characteristics of insect vitellogenins., 2008, 54(12): 1447-1458.

[12] TUFAIL M, NAEEMULLAH M, ELMOGY M, SHARMA P, TAKEDA M, NAKAMURA C. Molecular cloning, transcriptional regulation, and differential expression profiling of vitellogenin in two wing-morphs of the brown planthopper,St?l (Hemiptera: Delphacidae)., 2010, 19(6): 787-798.

[13] TUFAIL M, NAGABA Y, ELGENDY A M, TAKEDA M. Regulation of vitellogenin genes in insects., 2014, 17(3): 269-282.

[14] MOON J, KIM Y. Purification and characterization of vitellin and vitellogenin of the beet armyworm,, (Noctuidae: Lepidoptera)., 2003, 6(1): 37-43.

[15] SHU Y H, ZHOU J L, TANG W C, LU K, ZHOU Q, ZHANG G. Molecular characterization and expression pattern of(Lepidoptera: Noctuidae) vitellogenin, and its response to lead stress., 2009, 55(7): 608-616.

[16] LAMISON C D, BALLARINO J, MA M. Temporal events of gypsy moth vitellogenesis and ovarian development., 1991, 16(2): 201-209.

[17] 葉恭銀, 胡萃, 洪健, 龔和. 天蠶卵黃原蛋白的合成、運(yùn)轉(zhuǎn)與沉積. 昆蟲學(xué)報(bào), 1999, 42(3): 225-233.

YE G Y, Hu C, HONG J, GONG H. Synthesis, transport and accumulation of vitellogenin in the Japanese oak silkworm,(Lepidoptera: Saturiidae)., 1999, 42(3): 225-233. (in Chinese)

[18] SEEHUUS S C, NORBERG K, GIMSA U, AMDAM G V. Reproductive protein protects sterile honey bee workers from oxidative stress., 2006, 103(4): 962-967.

[19] LI Z, ZHANG S, LIU Q. Vitellogenin functions as a multivalent pattern recognition receptor with an opsonic activity., 2008, 3(4): e1940.

[20] HUO Y, LIU W, ZHANG F, CHEN X, LI L, LIU Q, ZHOU Y, WEI T, FANG R, WANG X. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector., 2014, 10(3): e1003949.

[21] ZHAO J, SUN Y, XIAO L B, TAN Y A, BAI L X. Molecular characterization and expression of vitellogenin gene fromexposed to cadmium stress., 2016, 593(1): 179-184.

[22] 王巖, 馬紀(jì), 劉小寧. 昆蟲血淋巴的收集技術(shù)與方法. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2009, 46(1): 147-151.

WANG Y, MA J, LIU X N. Techniques and methods for collecting insect haemolymph., 2009, 46(1): 147-151. (in Chinese)

[23] 馬卓, 劉廷輝, 陳潔, 梁超, 曹美琳, 何運(yùn)轉(zhuǎn). 異色瓢蟲卵黃蛋白單克隆抗體的制備及鑒定. 昆蟲學(xué)報(bào), 2015, 58(11): 1186-1193.

MA Z, LIU T H, CHEN J, LIANG C, CAO M L, HE Y Z. Preparation and identification of monoclonal antibodies to the vitellin in(Coleoptera: Coccinellidae)., 2015, 58(11): 1186-1193. (in Chinese)

[24] SMOLENAARS M M W, MADSEN O, RODENBURG K W, VAN DER HORST D J. Molecular diversity and evolution of the large lipid transfer protein superfamily., 2007, 48: 489-502.

[25] NOSE Y, LEE J M, VENO T, HATAKEYAMA M, OISHI K. Cloning of cDNA for vitellogenin of the parasitoid wasp,: vitellogenin primary structure and evolution considerations., 1997, 27(9): 1047-1056.

[26] AZEVEDO D O, ZANUNCIO J C, DELABIE J H C, SERR?O J E. Temporal variation of vitellogenin synthesis in, (Formicidae: Ectatomminae) workers., 2011, 57(7): 972-977.

[27] SORGE D, NAUEN R, RANGE S, HOFFMANN K H. Regulation of vitellogenesis in the fall armyworm,(Lepidoptera: Noctuidae)., 2000, 46(6): 969-976.

[28] ZHANG B, LIU H, HELEN H S, WANG J J. Effect of host plants on development, fecundity and enzyme activity of, (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae)., 2011, 10(8): 1232-1240.

[29] 司升云, 周利琳, 王少麗, 江幸福, 許再福, 慕衛(wèi), 王冬升, 王小平, 陳浩濤, 楊亦樺, 吉訓(xùn)聰. 甜菜夜蛾防控技術(shù)研究與示范—公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng) “甜菜夜蛾防控技術(shù)研究與示范” 研究進(jìn)展. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2012, 49(6): 1432-1438.

SI S Y, ZHOU L L, WANG S L, JIANG X F, XU Z F, MU W, WANG D S, WANG X P, CHEN H T, YANG Y H, JI X C. Progress in research on prevention and control of beet armyworm,in China., 2012, 49(6): 1432-1438. (in Chinese)

[30] SU J, SUN X X. High level of metaflumizone resistance and multiple insecticide resistance in field populations of, (Lepidoptera: Noctuidae) in Guangdong Province, China., 2014, 61(3): 58-63.

（責(zé)任編輯 岳梅）

Polyclonal antibody preparation ofvitellogeninand its protein expression at different Developmental stages

ZHAO Jing, SUN Yang, TAN YongAn, XIAO LiuBin, JIANG YiPing, BAI LiXin

(Institute of Plant Protection/Key Lab of Food Quality and Safety of Jiangsu Province-State Key Laboratory Breeding Base, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014)

The objective of this study is to prepare the polyclonal antibody ofvitellogenin(Vg), investigate the expression pattern of Vgprotein in female hemolymph ofat different developmental stages, and to provide a basis for studying the function and mechanism of synthesis, transportation and utilization.The fragment ofwas amplified from the cDNA of 24-h-old female adults ofby PCR which included the vitellogenin-N region. The fragment ofwas then inserted into the pMD-19T for sequencing. The nucleic acid sequence and the amino acids encoded by this gene fragment were analyzed by DNAMAN software. The sequencedfragment was inserted into the expression vector pCzn1 byI andI digestion. The recombinant vector pCzn1-Vg was then inserted intoArcticExpress. TheArcticExpress expressing the Vg recombinant protein was collected and crushed by ultrasonic. The supernatant and the precipitate were collected, respectively, and SDS-PAGE was used to analyze the expression of the recombinant protein. The recombinant Vg protein was expressed at different temperatures and concentrations of IPTG and the optimized expression condition was achieved. The recombinant protein was purified by Ni-NTA agarose. The purified recombinant protein was used to produce polyclonal antibody via immunizing rabbit. The titer of rabbit anti-Vg antiserum was evaluated by indirect ELISA. The content of Vg in female hemolymph ofat different developmental stages was detected by Western blot.The length of the fragment ofis 2 091 bp, encoding 697 amino acids. The predicted molecular weight of Vg recombinant protein is 80.88 kD. The molecular weight of Vg recombinant protein expressed inis 80 kD, which is consistent with the predicted molecular weight. It was mainly expressed in inclusion body rather than the supernatant. The results of Vg recombinant protein content expressed at different temperatures and concentrations of IPTG showed that it was highly expressed at inducing temperature of 25℃ with 0.6 mmol·L-1IPTG. It had no obvious effect on boosting the Vg recombinant protein level and other protein content increased by raising temperature and the concentration of IPTG. After immunizing New Zealand white rabbits with four times, the ELISA assay showed that the rabbit anti-Vg antiserum had a good sensitivity with the titer 1﹕512 000.The Vg content in female hemolymph ofat different developmental stages was detected by Western blot. A single Vg band of approximately 180 kD was detected. Vg was first expressed at late stage of female pupa and showed a low expression level. After female adult eclosion, Vg expression was in a dynamic balance which peaked in 48-h-old female adults, then decreased.The Vg recombinant protein was successfully purified and the optimized expression condition (temperature of 25℃ with 0.6 mmol·L-1IPTG) is clearly defined. The polyclonal antibody of Vg protein with high titer was obtained and the expression pattern of Vg inis explicit.

; vitellogenin gene; prokaryotic expression; polyclonal antibody; expression pattern

2017-06-06；

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（6111661）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-18-16）、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院基金計(jì)劃（6111612）、國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303028）、江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地自主研究課題（3201632）

接受日期：2017-09-01

聯(lián)系方式：趙靜，E-mail：jingzhao0126@126.com。通信作者肖留斌，E-mail：xlbwll@sohu.com