鞏五虎，薛少華，張 巖，朱如心，趙珍敏

（1.西安市公安局刑事偵查局技術(shù)處，陜西 西安 710038；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063）

SiFaTM23 Plex試劑盒（提取測試版）在漢族人群中的法醫(yī)學(xué)調(diào)查

鞏五虎1，薛少華1，張 巖1，朱如心2，趙珍敏2

（1.西安市公安局刑事偵查局技術(shù)處，陜西 西安 710038；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063）

目的評估SiFaTM23 Plex試劑盒（提取測試版）的性能及其所包含的STR基因座在漢族人群中的群體遺傳學(xué)信息。方法應(yīng)用試劑盒對1000名漢族健康無關(guān)個體進(jìn)行分型檢測，檢測試劑盒有效性并統(tǒng)計(jì)分析STR基因座的頻率數(shù)據(jù)及群體遺傳學(xué)參數(shù)信息。結(jié)果該試劑盒最小擴(kuò)增體系可以為6.25μL，標(biāo)準(zhǔn)體系25μL中DNA含量低至125pg可獲取理想分型圖譜。試劑盒中包含的21個常染色體STR基因座在1000人份中共檢測到267個等位基因，均符合Hardy-Weinberg平衡。新增加的兩個STR基因座D1S1656和D10S1248分別檢測到15和11個等位基因，多態(tài)信息含量豐富。結(jié)論SiFaTM23 Plex試劑盒（提取測試版）對于血液樣本檢測性能優(yōu)越，準(zhǔn)確性、重復(fù)性、靈敏度均可滿足法醫(yī)學(xué)檢案需求，可以應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)際檢案及DNA建庫工作。

法醫(yī)遺傳學(xué)；短串聯(lián)重復(fù)序列；SiFaTM23 Plex試劑盒（提取測試版）；漢族

SiFaTM23 Plex試劑盒（提取測試版）由司法鑒定科學(xué)研究院研制。該試劑盒可一次檢測22個STR基因座和一個性別鑒定位點(diǎn)Amelogenin（AMEL）。這些STR基因座既包含了目前國內(nèi)外各個試劑盒生產(chǎn)商所采用的19個常染色體STR基因座[1-2]（vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、PentaD、PentaE、TH01、TPOX），又包括了2個在中國人群具有良好法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值的 STR 基因座[2-4]（D1S1656和D10S1248），還包括了一個用于排除因AMEL等位基因丟失造成性別誤判的Y-STR基因座DYS391。本研究從試劑盒測試及采集基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的角度出發(fā)，對西安及上海兩地的漢族無關(guān)個體進(jìn)行測試，以期評判試劑盒效能并應(yīng)用于實(shí)際檢案工作。其中，試劑盒測試根據(jù)DNA分析方法科學(xué)工作組（Scientific Working Group on DNA Analysis Methods，SWGDAM）對試劑盒有效性驗(yàn)證要求，從PCR擴(kuò)增體系、重復(fù)性、準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性這些角度展開檢測評估。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究共涉及1000份漢族健康志愿者的血樣，采集于西安及上海兩地，其中男性500份，女性500份。實(shí)驗(yàn)前對每名志愿者進(jìn)行風(fēng)險告知，并簽署知情同意書。

用于特異性檢測的動物樣本為雞、鴨、牛、羊、豬、狗、貓、兔和小鼠的血液樣本；微生物樣本為大腸桿菌、酵母菌、乳酸菌、黃色微球菌、綠膿桿菌、表皮葡萄球菌和唾液鏈球菌。

1.2 試劑與儀器

SiFaTM23 Plex試劑盒（提取測試版，司法鑒定科學(xué)研究院）、Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng) 20A［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］，9948標(biāo)準(zhǔn)品（美國Promega公司）、甲酰胺（美國Thermo Fisher Scientific公司）、自動化工作站（澳斯邦生物技術(shù)有限公司）、9700型PCR儀和3130xl基因分析儀（美國AB公司）。

1.3 PCR擴(kuò)增和STR分型

采用自動化工作站進(jìn)行血樣DNA的提取。樣本DNA采用標(biāo)準(zhǔn)檢測體系25 μL進(jìn)行擴(kuò)增，其中包含2.5×反應(yīng)緩沖液 10 μL，5×引物混合物 5 μL，0.5 μL DNA聚合酶，其余為去離子水和DNA樣本。推薦DNA樣本范圍為0.5～2 ng，可以根據(jù)DNA樣本濃度進(jìn)行兩者比例的調(diào)節(jié)。PCR擴(kuò)增體系為：95℃ 5min；94℃ 30 min，60℃ 40 s，70℃ 50 s，30 個循環(huán)；60℃30min；4℃持續(xù)保溫，直至取出樣品。PCR產(chǎn)物變性后在3130xl基因分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用Gene-Mapper?ID v3.2.1軟件進(jìn)行分型。

1.4 試劑盒有效性驗(yàn)證

1.4.1 PCR擴(kuò)增體系測試

在實(shí)際檢案工作中，當(dāng)樣本DNA量比較少或者進(jìn)行DNA建庫時，常采用縮小的PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行檢測。為測試小擴(kuò)增體系的有效性，本研究分別采用25μL、12.5μL和6.25μL的體系對標(biāo)準(zhǔn)品9948進(jìn)行擴(kuò)增檢測，檢測重復(fù)3次。

1.4.2 重復(fù)性測試

從1000份志愿者中隨機(jī)選擇100份樣本，分別在司法鑒定科學(xué)研究院法醫(yī)物證學(xué)研究室和西安市公安局刑事偵查局技術(shù)處檢測實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分型檢測，比對結(jié)果的一致性。

1.4.3 準(zhǔn)確性測試

對上述100份樣本采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A進(jìn)行分型檢測，比較相同的19個STR基因座基因型分型結(jié)果的一致性。

1.4.4 靈敏度測試

試劑盒的靈敏度檢驗(yàn)主要用于判斷該試劑盒可以產(chǎn)生可靠分型結(jié)果的DNA擴(kuò)增范圍，對于日常的檢測工作具有重要的指導(dǎo)意義。本次分析中，主要是采用標(biāo)準(zhǔn)品9948進(jìn)行梯度稀釋，稀釋的濃度分別為2000、1000、500、250、125、62.5 和 31.25pg。 重復(fù)檢測 3 次。

1.4.5 特異性測試

法醫(yī)物證檢材受非人類DNA污染是日常檢案工作中常見的一種現(xiàn)象。本研究對常見的一些非人類DNA采用該試劑盒進(jìn)行分型檢測是否會產(chǎn)生特異性PCR產(chǎn)物進(jìn)行了評估。其中，常見的動物DNA種類包括雞、鴨、牛、羊、豬、狗、貓、兔和小鼠；常見的微生物DNA主要為大腸桿菌、酵母菌、乳酸菌、黃色微球菌、綠膿桿菌、表皮葡萄球菌和唾液鏈球菌。上述樣本均采用25μL體系中包含2ng DNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測，重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對試劑盒中涉及的21個常染色體STR基因座進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)和等位基因分布頻率的計(jì)算；根據(jù)等位基因頻率，采用PowerMarker v3.25進(jìn)行基因變異度、雜合度和多態(tài)信息含量的計(jì)算。

試劑盒性能評估主要針對STR基因座，AMEL未納入統(tǒng)計(jì)。平均基因座檢出率的計(jì)算是樣本成功檢測基因座的平均值與試劑盒包含STR基因座（21個常染色體STR和DYS391）的比值，其中STR基因座發(fā)生丟峰或者均衡比低于60%認(rèn)為檢測失敗[2，5]；平均等位基因峰高是樣本檢測等位基因的相對熒光單位（relative fluorescence units，RFU）與檢測等位基因數(shù)目的比值。

2 結(jié)果與討論

2.1 STR基因座的遺傳信息

本研究結(jié)合國際法醫(yī)遺傳學(xué)會（International Society for Forensic Genetics，ISFG）對于 STR 命名的最新要求[6]，對試劑盒中涉及的21個常染色體根據(jù)人類基因組GRCh38和GRCh37序列分布進(jìn)行了核心重復(fù)單元（motif）位置及結(jié)構(gòu)的整理，結(jié)果見表1。其中，根據(jù)motif的結(jié)構(gòu)信息可以分為簡單、復(fù)合和復(fù)雜3種情況，僅基因座D21S11屬于復(fù)雜情況，為[TCTA][TCTG][TCTA]TA[TCTA]TCA[TCTA]TCCATA[TCTA]，其中，TA、TCA、TCCATA堿基不納入核心重復(fù)單元。除Penta E和Penta D基因座外，其余均為4堿基重復(fù)。對于這兩個基因座上出現(xiàn)的OL等位基因，注意等位基因的命名。

表1 21個常染色體STR基因座的核心序列結(jié)構(gòu)及位置信息

2.2 試劑盒有效性驗(yàn)證

對標(biāo)準(zhǔn)品9948分別采用25μL、12.5μL和6.25μL擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測，結(jié)果表明，采用三種不同擴(kuò)增體系，樣本均可以得到理想的擴(kuò)增，且電泳分型結(jié)果準(zhǔn)確可信。重復(fù)性檢測主要選擇100份樣本分別在2個不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，分型結(jié)果一致。準(zhǔn)確性檢測主要是對上述100份樣本分別采用2個不同的商業(yè)化試劑盒進(jìn)行檢測，其中19個相同的常染色體STR基因座分型結(jié)果一致。

采用標(biāo)準(zhǔn)體系進(jìn)行靈敏度檢測，結(jié)果表明，DNA模板量在125 pg到2 000 pg可以得到完整理想的分型圖譜，平均峰高為596RFU到4231RFU。當(dāng)DNA量降至62.5 pg和31.25 pg時，等位基因的平均檢出率分別為95.45%和86.36%，等位基因的平均丟峰率增加，主要發(fā)生在大片段擴(kuò)增產(chǎn)物峰；平均等位基因峰高呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，當(dāng)DNA量降至31.25 pg時，平均RFU為118（表2），可以滿足分析要求。上述結(jié)果可以指導(dǎo)鑒定實(shí)踐中采用該試劑盒進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，獲取理想分型結(jié)果對DNA量的要求。

對常見動物DNA和微生物DNA的檢測結(jié)果均為陰性，表明該試劑盒具有高度特異性，可用于對人類DNA檢材的檢測及分析。

表2 SiFaTM23 Plex測試試劑盒（提取測試版）靈敏度測試結(jié)果 （n=3，±s）

表2 SiFaTM23 Plex測試試劑盒（提取測試版）靈敏度測試結(jié)果 （n=3，±s）

DNA模板量/pg等位基因峰高/RFU 2000 100.00±0.00 4231.03±552.25 1000 100.00±0.00 2431.50±545.89 500 100.00±0.00 1646.75±500.00 250 100.00±0.00 869.38±632.00 125 100.00±0.00 596.15±200.00 62.5 95.45±4.55 219.35±654.00 31.25 86.36±4.55 118.32±984.00等位基因平均檢出率/%

2.3 基因座的法醫(yī)學(xué)效能

本次檢測中無關(guān)個體來源于西安及上海兩地漢族人群。針對不同地區(qū)人群分別展開等位基因頻率數(shù)據(jù)的計(jì)算，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），合并人群統(tǒng)計(jì)21個常染色體STR基因座的等位基因分布及頻率（表3）。在1000份無關(guān)個體樣本中共檢測到1 078個基因型、267個等位基因（表4）。采用PowerMarker v3.25統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，TPOX和TH01基因座的最大等位基因頻率均大于0.5，導(dǎo)致這兩個基因座基因變異度、雜合度和多態(tài)信息含量最小。在21個常染色體STR基因座中，本次檢測發(fā)現(xiàn)Penta E基因座的基因變異度、雜合度和多態(tài)信息含量最高，均在0.9以上。新增加的兩個STR基因座D1S1656和D10S1248分別檢測到15和11個等位基因，遺傳效能可滿足法醫(yī)學(xué)應(yīng)用。另外，試劑盒中納入的DYS391基因座主要針對性別進(jìn)行進(jìn)一步判斷分析，同時對于父系關(guān)系鑒定提供一個STR基因座的基本信息。本研究中500名男性個體在該基因座上共檢見 5 種等位基因 6、9、10、11、12，其中最為常見的等位基因?yàn)?0和11。

表3 21個STR基因座的頻率信息 （n=1000）

表 3（續(xù)）

表4 21個STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù) （n=1000）

2.4 小結(jié)

本研究基于1 000份漢族無關(guān)個體樣本探討了SiFaTM23 Plex試劑盒（提取測試版）的法醫(yī)學(xué)性能及STR基因座的多態(tài)信息。結(jié)果表明，試劑盒對于血液樣本檢測性能優(yōu)越，25 μL標(biāo)準(zhǔn)體系中采用125 pg DNA可完全分型，等位基因分布均衡。采用成熟的PowerMarker軟件可以獲取常染色體STR基因座的基本遺傳學(xué)參數(shù)，幫助法醫(yī)學(xué)者快速判斷相關(guān)STR基因座信息。

[1]ENSENBERGER M G，HILL C R， MCLAREN R S，et al.Developmental validation of the PowerPlex?21 System[J].Forensic Sci Int Genet，2014，9：169-178.

[2]ZHANG S，BIAN Y，TIAN H，et al.Development and validation of a new STR 25-plex typing system[J].Forensic Sci Int Genet，2015，17：61-69.

[3]GUO F， ZHOU Y， LIU F， et al.Evaluation of the Early Access STR Kit v1 on the Ion Torrent PGM platform[J].Forensic Sci Int Genet，2016，23：111-120.

[4]ZHANG S， TIAN H， WU J， et al.A new multiplex assay of 17 autosomal STRs and Amelogenin for forensic application[J].PLoS ONE，2013，8（2）：e57471.

[5]GILDER J R，INMAN K，SHIELDS W，et al.Magnitude-dependent variation in peak height balance at heterozygous STR loci[J].Int J Legal Med，2011，125（1）：87-94.

[6]PARSON W，BALLARD D，BUDOWLE B，et al.Massively parallel sequencing of forensic STRs：Considerations of the DNA commission of the International Society for Forensic Genetics （ISFG） on minimal nomenclature requirements[J].Forensic Sci Int Genet，2016，22：54-63.

2017-03-16）

（本文編輯：張素華）

Forensic Investigation in Han Population by SiFaTM23 Plex Kit （Beta Version）

GONG Wu-hu1,XUE Shao-hua1,ZHANG Yan1,ZHU Ru-xin2,ZHAO Zhen-min2
（1.Department of Technology,Department of Criminal Investigation,Xi′an Municipal Public Security Bureau,Xi′an 710038,China;2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Academy of Forensic Science,Shanghai 200063,China）

ObjectiveTo investigate the performance of SiFaTM23 Plex Kit （beta version） and its population genetics of STR loci in Han population.MethodsGenotyping was performed for 1 000 unrelated healthy Han individuals by the kit.The efficiency of the kit was tested,and the frequency data and population genetics parameter information of STR loci were analysed statistically.ResultsThe minimum amplification system could be 6.25 μL.In 25μL standard reaction system,a satisfied genotyping profiles could be obtained with the DNA content as low as 125 pg.Among the 1 000 individuals,267 alleles were detected by 21 autosomal STR loci of the kit,which conformed to Hardy-Weinberg equilibrium.Fifteen and eleven alleles were observed at the newly added STR lociD1S1656andD10S1248,respectively,which showed a high polymorphism information content.ConclusionSiFaTM23 Plex Kit（beta version）is excellent in testing blood samples.Its accuracy,repeatability and sensitivity can satisfy the need of forensic practice,which makes it be applied to forensic-related case work and DNA database establishment.

forensic genetics;short tandem repeat;SiFaTM23 Plex Kit （beta version）;Han nationality

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.05.015

1004-5619（2017）05-0516-06

上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺資助項(xiàng)目（16DZ 2290900）；上海市標(biāo)準(zhǔn)研制項(xiàng)目（14DZ0502500）

鞏五虎（1968—），男，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究工作；E-mail：gongwuhu1@126.com

趙珍敏，女，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)工作；E-mail：zhaozm@ssfjd.cn