桃蛀螟CpunPBP2基因的全長(zhǎng)序列克隆、分子結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析

朱秀云+徐鹿+王志強(qiáng)+陳耕+李進(jìn)步+張亞楠

摘要：氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein，簡(jiǎn)稱OBP）能結(jié)合進(jìn)入到觸角內(nèi)的脂溶性氣味物質(zhì)進(jìn)行并運(yùn)送到感受神經(jīng)元受體部位，被認(rèn)為是昆蟲嗅覺的第1個(gè)生化步驟，其中性信息素結(jié)合蛋白（pheromone binding protein，簡(jiǎn)稱PBP）屬于OBP家族。利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid-amplification of cDNA ends，簡(jiǎn)稱RACE）在已有報(bào)道桃蛀螟CpunPBP2片段的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物獲得該基因的全長(zhǎng)cDNA序列。序列分析表明，CpunPBP2基因具有昆蟲OBP典型特征，即6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)和信號(hào)肽序列。同源比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CpunPBP2的氨基酸序列與其他鱗翅目昆蟲PBP2均具有較高的相似性。進(jìn)一步進(jìn)化分析結(jié)果表明，CpunPBP2能聚在鱗翅目昆蟲PBP/GOBP超家族內(nèi)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步分析桃蛀螟PBP2的生理功能奠定了分子基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：桃蛀螟；基因；氣味結(jié)合蛋白；性信息素結(jié)合蛋白；cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)；全長(zhǎng)克??；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào)： S433.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0050-04

昆蟲作為歷史上最長(zhǎng)的動(dòng)物類群之一，長(zhǎng)期進(jìn)化使它們形成了以觸角為主的發(fā)達(dá)的嗅覺感受系統(tǒng)，借此識(shí)別環(huán)境中大量的化學(xué)信息作出準(zhǔn)確判斷，并產(chǎn)生一系列生理和行為反應(yīng)，如尋找棲息、產(chǎn)卵場(chǎng)所等[1]。自1981年Vogt等用標(biāo)記性信息素方法發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)昆蟲氣味結(jié)合蛋白（OBP）——多音大蠶蛾雄蛾（Antheraea polyphemus）觸角中的性信息素結(jié)合蛋白（pheromone binding protein，簡(jiǎn)稱PBP）[2]以來(lái)，隨著基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展及成本大幅度降低，已在不同昆蟲中發(fā)現(xiàn)有超過(guò)400個(gè)OBP，它們分屬于不同的目和科[3]。

根據(jù)保守半胱氨酸的數(shù)量以及氨基酸序列，昆蟲OBP可分為4類：（1）經(jīng)典OBP（classic OBP），特征為6個(gè)保守的半胱氨酸結(jié)構(gòu)，鱗翅目昆蟲的性信息素結(jié)合蛋白、普通氣味結(jié)合蛋白（general odorant binding protein，簡(jiǎn)稱GOBP）以及觸角結(jié)合蛋白（antennal binding protein，簡(jiǎn)稱ABP）均屬于此類；（2）多C OBP（plus-C OBP），特征為超過(guò)6個(gè)以上的保守半胱氨酸結(jié)構(gòu)，還常會(huì)在保守位置具有一個(gè)脯氨酸；（3）少C OBP（minus-C OBP），特征為少于6個(gè)半胱氨酸結(jié)構(gòu)，僅在4個(gè)保守位置處有半胱氨酸；（4）典型OBP（atypical OBP），特征為擁有一段較長(zhǎng)的C端序列[4-6]。在鱗翅目昆蟲中，OBP的保守性較高，分類清晰，可以明顯地分為3類：性信息素結(jié)合蛋白（PBP）、普通氣味結(jié)合蛋白、觸角特異性蛋白（antennal specific protein，簡(jiǎn)稱ASP）或觸角結(jié)合蛋白。鱗翅目雄蛾的觸角高表達(dá)或?qū)Ｒ槐磉_(dá)PBP，且PBP可以結(jié)合由雌蟲釋放的性信息素[7-8]。但雌雄觸角感器均有表達(dá)的PBP并不一定是對(duì)性信息素特異結(jié)合的，也能結(jié)合其他非性信息素物質(zhì)[9-10]。

桃蛀螟[Conogethes punctiferalis（Guenée）]別稱桃斑螟、桃蛀心蟲、桃蛀野螟，隸屬于鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae）。桃蛀螟食性雜、分布廣，其幼蟲可危害板栗、桃、李、杏、玉米、蓖麻、向日葵等40多種果樹、油料和糧食作物。近年來(lái)，陸續(xù)有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，桃蛀螟在我國(guó)的長(zhǎng)江流域、中部和北部地區(qū)對(duì)梨、板栗、向日葵、高粱、玉米的產(chǎn)量造成了重大危害[11-12]。桃蛀螟在幼蟲期取食的部位以致于傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥很難對(duì)它們產(chǎn)生直接有效的作用。桃蛀螟性引誘劑的開發(fā)已成功應(yīng)用于種群的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，但直接用于害蟲防治，同該技術(shù)應(yīng)用于其他重要蛾類害蟲的情況相似，無(wú)論是用交配干擾法還是大量誘捕法，都存在成本偏高、效果不理想等問(wèn)題。況且現(xiàn)在使用的化學(xué)農(nóng)藥不僅僅會(huì)使害蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性，而且還會(huì)大大加劇環(huán)境污染和對(duì)非靶標(biāo)生物的殺傷作用[13]。因此，生產(chǎn)上亟須更為高效的行為調(diào)控技術(shù)來(lái)防治這類害蟲。桃蛀螟性信息素所含有的2種主要醛類組分（Z10-16：Ald、E10-16：Ald）在化學(xué)結(jié)構(gòu)上也與其他螟蛾科害蟲相同或相似。另外，桃蛀螟所危害的果樹和農(nóng)作物同樣也是鱗翅目其他科害蟲的取食對(duì)象，因此以桃蛀螟為研究材料的研究成果，也將對(duì)其他昆蟲的相關(guān)研究具有很好的借鑒意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

于2014年7—9月利用燈誘的方式，在淮北師范大學(xué)相山校區(qū)校園內(nèi)采集試蟲。隨后將收取的成蟲（約60頭）觸角按照雌雄1 ∶ 1的比例放于-80 ℃冰箱備用。

1.2 總RNA提取及RACE-cDNA的合成

總RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，并按操作說(shuō)明書進(jìn)行提取。5′/3′ -RACE-ready cDNA模板合成使用SMARTTM RACE cDNA Amplication Kit（634925，TaKaRa & Clontech），并存放于-20 ℃冰箱中。

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系及程序

1.3.1 PCR引物設(shè)計(jì) 按照SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒使用說(shuō)明中關(guān)于引物設(shè)計(jì)的要求，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)RACE引物（gene specific primer，簡(jiǎn)稱GSP）（表1）。

1.3.2 PCR反應(yīng)體系及程序 利用特異引物（表1）和RACE分別擴(kuò)增桃蛀螟PBP2基因的5′、3′序列，所采用的RACE-PCR條件按照操作試劑盒（SMART Kit，TaKaRa）說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 PCR產(chǎn)物純化、克隆、測(cè)序和序列分析endprint

PCR產(chǎn)物純化：采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（Axygen）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

連接反應(yīng)：經(jīng)膠回收后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接于pEASY-T3載體上（全式金生物，北京），操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

轉(zhuǎn)化反應(yīng)：上步連接成功的載體和目的基因轉(zhuǎn)化至 Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞（全式金生物，北京）中，操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)GeneDoc軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，并利用NCBI-Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）及與NCBI-GenBank已經(jīng)登錄的基因序列進(jìn)行同源搜索比對(duì)，信號(hào)肽預(yù)測(cè)由網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器SignalP V4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）完成，蛋白分子量和等電點(diǎn)由http：//www.expasy.org/網(wǎng)站預(yù)測(cè)，雙螺旋結(jié)構(gòu)和3D同源建模由http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi、http：//swissmodel.expasy.org預(yù)測(cè)分析。

利用ClustalW 2.0及Mega 6.0采用鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（抽樣分析為1 000次），對(duì)桃蛀螟等昆蟲的PBP基因進(jìn)行系統(tǒng)分析，選用的其他昆蟲序列參考[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 全長(zhǎng)克隆與分析

在原有CpunPBP2片段的基礎(chǔ)上[15]，設(shè)計(jì)特異引物并利用RACE-PCR擴(kuò)增出300 bp左右的條帶（圖1），與預(yù)測(cè)大小相符。純化后的PCR產(chǎn)物克隆到pEASY-T3 easy載體中，隨后經(jīng)菌液PCR擴(kuò)增出500 bp左右條帶（圖2），選取5個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)分析5′、3′RACE的測(cè)序結(jié)果，得到開放閱讀框?yàn)?13 bp，編碼170個(gè)氨基酸的CpunPBP2序列（圖3）。經(jīng)軟件預(yù)測(cè)，CpunPBP2的N-端最初25個(gè)氨基酸為信號(hào)肽（圖4），成熟蛋白的分子量為16.51 ku，等電點(diǎn)為4.93。

2.2 序列同源分析

利用NCBI-BLAST網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）及NCBI-GenBank序列庫(kù)中已登錄序列進(jìn)行家族預(yù)測(cè)分析，結(jié)果（圖5）表明，CpunPBP2基因?qū)儆诶ハx PBP-GOBP超家族。

將CpunPBP2 cDNA所推導(dǎo)的氨基酸序列，與已知其他鱗翅目昆蟲PBP2進(jìn)行同源比對(duì)分析（圖6），結(jié)果表明，CpunPBP2的氨基酸序列與其他昆蟲PBP2均（MsexPBP2、SinfPBP2、SexigPBP2、HvirPBP2）具有較高的相似性，分別為62%、69%、67%、62%。從圖6還可看出，CpunPBP2具有典型的昆蟲OBP結(jié)構(gòu)：6個(gè)保守的半光氨酸位點(diǎn)，且第2個(gè)和第3個(gè)半胱氨酸間隔3個(gè)氨基酸、 第5個(gè)和第 6 個(gè)半胱氨酸間隔8個(gè)氨基酸[16]。利用CpunPBP2同已有的家蠶BmorPBP晶體結(jié)構(gòu)的同源預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，CpunPBP2同BmorPBP類似，即含有6個(gè)α-螺旋和1個(gè)額外α-螺旋（圖7），這些螺旋機(jī)構(gòu)可能會(huì)參與到桃蛀螟性信息素的識(shí)別過(guò)程中。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

選取已報(bào)道的鱗翅目蛾類昆蟲：家蠶（Bombyx mori）、大螟（Sesamia inferens）、?；页嵋苟辏⊿podoptera littoralis）和煙草天蛾（Manduca sexta）[17-18]與桃蛀螟的PBP2進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果表明，CpunPBP2能聚在鱗翅目昆蟲PBP/GOBP超家族內(nèi)（圖8）。

3 結(jié)論與討論

本研究基于桃蛀螟CpunPBP2的片段信息，利用RACE技術(shù)成功克隆該基因的全長(zhǎng)cDNA序列。通過(guò)序列分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CpunPBP2具有OBP基因的典型序列特征，即分子量約15～17 ku、N末端具1條20個(gè)氨基酸左右的信號(hào)肽、序列中具有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)[19]，并且與其他昆蟲PBP表現(xiàn)出較高的相似性等。CpunPBP2基因全長(zhǎng)序列的成功獲得，為進(jìn)一步研究其生理功能以及篩選高效的桃蛀螟行為控制劑提供了基礎(chǔ)[20]。

另外，張亞楠對(duì)大螟所有鑒定到OBP的組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)OBP在觸角中高表達(dá)，并且半數(shù)左右的OBP在非觸角組織中（胸和腹部）也檢測(cè)到微弱的條帶，這其中就包括PBP和GOBP，這暗示昆蟲PBP和GOBP可能在大螟的嗅覺行為中起到重要的作用[21]。值得一提的是，該研究在大螟的幼蟲中也檢測(cè)到性信息素結(jié)合蛋白PBP1、PBP3的微弱表達(dá)信號(hào)，并且該結(jié)果與之前報(bào)道的海灰翅夜蛾（S. littoralis）幼蟲類似，Poivet等的解釋是海灰翅夜蛾幼蟲中的PBP能感受吸附在或是雌蛾產(chǎn)卵時(shí)殘留在綠葉上的性信息素，所以可利用這種行為幫助幼蟲尋找食物[22]。這些研究表明，鱗翅目昆蟲PBP功能可能不僅僅只在成蟲感受性信息素途徑中起到作用，可能在幼蟲取食或其他的生理活動(dòng)中擔(dān)當(dāng)重要的角色。

結(jié)果表明，蛾類昆蟲PBP具有以下典型特征：（1）同科雄蛾觸角中具有多個(gè)PBP基因和雌蛾腺體中具有多種性信息素組分，且大部分物種性信息素的數(shù)量多于PBP的數(shù)量；（2）同一PBP在雌雄觸角間差異表達(dá)，不同PBP在雌蟲或雄蟲觸角中差異表達(dá)；（3）PBP在觸角感器分布具有多樣性，而對(duì)CpunPBP2同其他昆蟲PBP的進(jìn)化分析結(jié)果表明，該基因?qū)儆诶ハxPBP超家族，因此CpunPBP2很有可能也具有以上特征。

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