黃謐+馮勇

摘要：根據(jù)大鯢虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，GSIV）主要衣殼蛋白（Major Capsid Protein，MCP）基因設計引物，PCR擴增得到MCP基因編碼框全長序列1 392 bp，將其克隆到原核表達載體pET-32a中，構建了重組原核表達載體pET-32a-MCP，并在大腸桿菌BL21中得到了表達，融合表達的重組蛋白分子量約為70 ku，與預期大小一致，主要以包涵體的形式存在。對IPTG濃度，誘導溫度等誘導表達條件進行優(yōu)化，確定0.5 mmol/L的IPTG于37 ℃的條件下誘導6 h重組蛋白的表達量最佳。純化GSIV-MCP重組蛋白免疫新西蘭大白兔，制備了GSIV-MCP多克隆抗體，ELISA檢測抗體效價大于1∶50 000。Western blot檢測顯示該抗體可以特異性識別重組蛋白。間接熒光免疫結果表明，該多克隆抗體可與由GSIV感染引起細胞病變的EPC細胞（GICB）發(fā)生特異性的結合。研究為建立GSIV免疫診斷方法以及為研究GSIV MCP基因編碼蛋白的功能奠定了前期基礎。

關鍵詞：大鯢虹彩病毒；衣殼蛋白；原核表達；多克隆抗體；免疫檢測

中圖分類號：S947.3；Q786；Q789 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）21-4146-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.21.037

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of the Major Capsid Protein of Chinese Giant Salamander Iridovirus

HUANG Mi1，2，F(xiàn)ENG Yong1

（1.Wuhan University School of Basic Medical Science，Wuhan 430071，China；2.Hubei Genomics Institute，Wuhan 430075，China）

Abstract： According to major capsid protein（MCP） gene of chinese giant salamander iridovirus（GSIV），primers were designed，and MCP gene coding frame full-length sequence（1 392 bp in length） was amplified by PCR and then cloned into prokaryotic expression vector pET-32a，to construct the recombinant expression vector pET-32a-MCP. The recombinant expression vector pET-32a-MCP was successfully expressed in E.coli BL21 as a fused recombinant protein with a size of 70 ku equal to the expected size， and presented mainly in inclusion body. The optimum induction condition for expression of the recombinant protein was 0.5 mmol/L IPTG，37 ℃，6 h. The purified recombinant proteins were used to immune New Zealand white rabbits to produce polyclonal antibody，the titers of polyclonal antibodies was above 1∶50 000 by ELISA. Western blot test demonstrated that the recombinant protein was recognized by the polyclonal antibody. An indirect immunofluorescent assay also showed that the polyclonal antibody was able to interact specifically with the pathological EPC cells（GICB） induced by GSIV infection. The conclusions made a preparations for the establishment of GSIV immunodiagnosis and the study of GSIV MCP gene coding protein functions.

Key words： Chinese giant salamander iridovirus（GSIV）； Capsid protein； prokaryotic expression； polyclonal antibodies； immunoassay

中國大鯢（Andrias davidianus）是現(xiàn)存?zhèn)€體體型最大的兩棲動物，俗名娃娃魚，是中國珍貴特產(chǎn)水生動物，屬于國家二級保護動物，在中國部分地區(qū)成功實現(xiàn)了人工養(yǎng)殖。陜西、湖北、湖南、浙江、貴州等省份的大鯢主養(yǎng)區(qū)近年暴發(fā)了大鯢病毒性出血病，該病可感染各種規(guī)格的養(yǎng)殖大鯢，死亡率高達90%以上，給大鯢養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。

大鯢病毒性出血病的病原為大鯢虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，GSIV），是虹彩病毒科（Iridoviridae）蛙病毒屬（Ranavirus）的成員[1-3]。虹彩病毒（Iridoviruses）是一類病毒粒子較大，呈二十面體狀的雙鏈DNA病毒[4]。虹彩病毒科（Iridoviridae）分為5個屬——綠虹彩病毒屬（Chloriridovirus）、虹彩病毒屬（Iridovirus）、淋巴囊腫病毒屬（Lymphocystivirus）、巨大細胞病毒屬（Megalocytivirus）和蛙病毒屬（Ranavirus）[5，6]。虹彩病毒可感染無脊椎動物（綠虹彩病毒屬，虹彩病毒屬）及變溫脊椎動物（蛙病毒屬，淋巴囊腫病毒屬，巨大細胞病毒屬），包括兩棲類、爬行類、甲殼類、軟體動物、昆蟲及魚類等。脊椎動物虹彩病毒，尤其是蛙病毒屬的一些成員已經(jīng)成為導致變溫動物發(fā)病的一個重要原因[7，8]。endprint

主要衣殼蛋白（Major capsid protein，MCP）是虹彩病毒二十面體衣殼的主要結構蛋白，為一個單一的多肽，其分子量約為50 ku，占病毒總蛋白量的45%，占病毒可溶性蛋白的90%[9，10]。MCP基因在同屬間具有高度的保守性，不同屬間具有足夠的差異性，是研究虹彩病毒分類及系統(tǒng)演變的靶基因。本研究將GSIV主要衣殼蛋白在大腸桿菌BL21中進行了融合表達，并將其純化，制作多克隆抗體，為大鯢病毒性疾病的防治及GSIV的免疫檢測試劑盒的研制奠定一定的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、細胞系、菌株與質粒 大鯢虹彩病毒由武漢大學基礎醫(yī)學院實驗室分離鑒定；鯉上皮瘤細胞系（Epithelioma papilloma cyprini，EPC）由武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號CCTCCGDC0174；原核表達載體pET-32a、表達菌株BL21（DE3）購于Novagen公司；pMD19-T載體購于TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ（Promega），T4 DNA連接酶（TakaRa，T4 DNA Ligase），HRP標記的羊抗兔IgG（ABCLONAL BIOTECHNOLOGY，INC.），病毒DNA提取試劑盒（OMEGA，Viral DNA Kit），膠回收試劑盒（OMEGA，Gel Extraction Kit），質粒提取試劑盒（Promega，Pure YieldTM Plasmid Midiprep System），免疫熒光染色試劑盒（碧云天，免疫熒光染色試劑盒—抗兔Cy3），化學發(fā)光底物（Thermo，SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate）。

離心機（Sigma，3K-15），化學發(fā)光成像與分析系統(tǒng)（BiO-RAD，ChemiDocTM XRS+），PCR儀（Biometra，T-professional），低溫恒溫槽（上海恒平科學儀器有限公司），小型垂直電泳槽（BiO-RAD，Mini-PROTEAN？誖Tetra System），酶標儀（BiO-RAD，iMarkTM），半干轉印槽（BiO-RAD，TRANS-BLOT？誖SD），倒置熒光顯微鏡（LEICA，DFC420C）。

1.1.3 引物 上游引物，5′-CGGAATTCATGTCTTCTG

TAACCG-3′含有EcoRⅠ酶切位點；下游引物，5′-CC

AAGCTTTTACAAGATTGGGAATC-3′含有HindⅢ酶切位點。

1.2 MCP基因的克隆

GSIV接種至EPC細胞，當細胞出現(xiàn)典型病變時，凍融病變細胞3次，將培養(yǎng)瓶中的懸濁液利用病毒DNA提取試劑盒抽提GSIV核酸，以抽提產(chǎn)物為模板，進行PCR擴增。采用50 μL反應體系，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，Primers（F/R，10 μmol/L）各1 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）1 μL，DNA模板為0.5 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR擴增程序為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，經(jīng)膠回收試劑盒回收目的片段，將純化的的MCP基因與pMD19-T載體于16 ℃連接4 h后，轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，命名為pMD19-T-MCP，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.3 重組表達載體的構建

重組質粒pMD19-T-MCP與原核表達載體pET-32a分別由EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，通過膠回收試劑盒回收目的片段，用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，轉化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，PCR篩選陽性克隆，擴大培養(yǎng)后提取質粒，經(jīng)酶切鑒定后，命名為pET-32a-MCP，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 重組蛋白的表達及表達形式的分析

將培養(yǎng)過夜的陽性重組菌pET-32a-MCP/BL21以1∶100的比例接種到LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL Amp）中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600 nm為0.4～0.6時，取2 mL菌液作為誘導菌的對照，然后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導4 h后，取2 mL誘導菌液及上述對照菌液4 ℃ 5 000 g離心5 min收集菌體，用100 μL PBS重懸菌體，加入等量的SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水中處理10 min，取10 μL進行SDS-PAGE分析。取誘導后的菌液進行超聲破碎處理，4 ℃ 5 000 g離心5 min取上清及沉淀分別進行SDS-PAGE分析。

1.5 重組蛋白表達條件的優(yōu)化及純化

將培養(yǎng)過夜的陽性重組菌pET-32a-MCP/BL21以1∶100的比例接種到LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL Amp）中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600 nm為0.4～0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，于加入IPTG的后的0、2、4、6、8 h分別取樣，進行SDS-PAGE分析，以確定最佳誘導時間。在最佳誘導時間下，分別加入1.0、0.5、0.1、0 mmol/L的IPTG，以確定最佳的IPTG濃度。經(jīng)過誘引的重組菌株經(jīng)超聲波破碎處理，離心去上清液，沉淀溶解在適量的磷酸鈉緩沖液（含8 mol/L尿素）中，然后參照蛋白純化試劑盒對重組蛋白進行純化。

1.6 重組蛋白多克隆抗體的制備及檢測endprint

取純化后的重組蛋白2 mL采用皮下多點注射法免疫新西蘭大白兔 （免疫前采集正常血清作為陰性對照），以后每2周加強免疫1次，共4次。首次免疫加入與重組蛋白等量弗氏完全佐劑，后3次加入與重組蛋白等量弗氏不完全佐劑。末次加強免疫后7 d心臟采血，分離血清。抗血清經(jīng)抗原親和純化得到純化的多克隆抗體。用純化的GSIV-MCP重組蛋白為抗原，以每孔100 μg的濃度4 ℃包被96孔板，待測多克隆抗體為一抗，按1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000，1∶128 000，1∶256 000， 1∶512 000的比例稀釋待測多抗，將注射佐劑加PBS的陰性血清以1∶1 000，1∶4 000稀釋作為陰性對照。用HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，以四甲基苯胺（TMB）溶液顯色后用酶標儀測定OD450 nm，以確定抗體效價。將誘導表達的重組菌pET-32a-MCP/BL21進行進行SDS-PAGE電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上，用含有20g/L BSA的PBST（含有終濃度為0.05%的Tween-20）室溫封閉1 h，用制備的GSIV-MCP抗體室溫孵育1 h，PBST（含有終濃度為0.05%的Tween-20）洗膜后，用HRP標記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h，再次清洗，最后用化學發(fā)光底物工作液孵育5 min顯色。同時用未經(jīng)誘導表達的重組菌pET-32a-MCP/BL21作為對照進行相同操作。

1.7 間接熒光免疫檢測GSIV

以純化的GSIV-MCP多克隆抗體為一抗，紅色熒光探針標記的羊抗兔IgG（H+L）抗體為二抗，參照免疫熒光染色試劑盒（碧云天，免疫熒光染色試劑盒-抗兔Cy3）對感染GSIV的EPC進行檢測。同時用沒有感染GSIV的EPC作為對照進行相同操作。

2 結果與分析

2.1 MCP基因的克隆

利用引物經(jīng)PCR反應從抽提的病毒總DNA中擴增出目的片段，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析片段大小為1 400 bp，其分子量與預期大小一致，結果見圖1。膠回收PCR產(chǎn)物，連接pMD19-T載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得了陽性重組菌株pMD19-T-MCP/DH5α，測序結果表明成功克隆了大小為1 392 bp的目的片段至T載體中。

2.2 重組表達載體的構建及鑒定

經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切的pET-32a，與MCP基因連接后，轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，PCR鑒定獲得了陽性重組菌株pET-32a-MCP/BL21。提取重組質粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果表明雙酶切得到的目的片段以及PCR鑒定陽性克隆的產(chǎn)物均與預期大小的核酸片段相同，結果見圖2。測序結果進一步證明MCP基因被正確地插入到pET-32a載體上，成功構建了重組表達載體。

2.3 重組蛋白的表達及表達形式的分析

SDS-PAGE分析表明重組菌株pET-32a-MCP/ BL21經(jīng)1 mmol/L的IPTG于37 ℃的條件下誘導4 h，能有效地誘導重組菌株的表達，蛋白分子質量約為70 ku，與預期大小一致。誘導表達的菌體通過超聲破碎處理后，表達產(chǎn)物主要存在于超聲破碎后的沉淀中，說明表達的蛋白主要以包涵體形式存在。結果見圖3。

2.4 重組蛋白表達條件的優(yōu)化及純化

重組菌株pET-32a-MCP/BL21用1 mmol/L的IPTG于37 ℃的條件下分別誘導0、2、4、6、8 h，重組蛋白的表達量以誘導時間為6 h為最佳，結果見圖4。以1.0、0.5、0.1、0 mmol/L的IPTG于37 ℃的條件下誘導6 h，以0.5 mmol/L的IPTG誘導重組蛋白的表達量最大，結果見圖5。因此初步確定重組菌株pET-32a-MCP/BL21融合表達重組蛋白的最佳條件為0.5 mmol/L的IPTG于37 ℃的條件下誘導6 h。重組蛋白經(jīng)蛋白純化試劑盒的純化得到了高純度的可溶性蛋白質。結果見圖6。經(jīng)Bradford法測定并調(diào)整蛋白質的濃度為250 μg/mL。

2.5 重組蛋白多克隆抗體的制備及檢測

收集經(jīng)過4次免疫的新西蘭大白兔抗血清，抗血清經(jīng)抗體親和純化得到純化的多克隆抗體，濃度為3 mg/mL。經(jīng)ELISA法測定，抗體效價大于1∶50 000。Western blot結果表明，GSIV-MCP多克隆抗體能特異性識別重組蛋白。結果見圖7。

2.6 間接熒光免疫檢測GSIV

間接熒光免疫結果顯示，感染GSIV的EPC細胞在綠光激發(fā)下呈現(xiàn)出鮮光的紅色，并且隨著病毒感染時間的增加，紅色熒光的強度增加；沒有感染GSIV的EPC細胞則沒有紅色熒光出現(xiàn)。說明制備的GSIV-MCP多抗能夠特異性地檢測GSIV。結果見圖8。

3 討論

大鯢病毒性出血病是近年暴發(fā)的一種傳染病，可感染各種規(guī)格的養(yǎng)殖大鯢，發(fā)病大鯢體表具有典型的出血癥狀，后肢腫大或潰瘍，解剖發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟器官出血或壞死，其死亡率可達90%以上。大鯢病毒性出血病的病原為大鯢虹彩病毒。虹彩病毒是一類病毒粒子較大的胞漿型DNA病毒，是水生動物的一類主要病原。在中國已經(jīng)從甲魚[11]、云斑尖塘鱧[12]、條石鯛[13]、大口黑鱸[14，15]、虎紋蛙蝌蚪[16]等多種水生動物體內(nèi)檢測出虹彩病毒。

虹彩病毒的衣殼呈二十面體結構，由六面體狀的衣殼亞單位構成。衣殼亞單位又稱主要衣殼蛋白（Major capsid protein），其數(shù)量與病毒粒子的大小有關。MCP基因為虹彩病毒的一個晚期基因，在虹彩病毒感染的晚期大量表達，編碼的主要衣殼蛋白分子量約為50 ku，構成病毒的二十面體衣殼[10，17]。比較虹彩病毒MCP基因的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，虹彩病毒MCP基因的氨基酸序列是高度保守的，同一屬的同源性一般在90%以上，不同屬之間的同源性一般為40%～50%[17]。endprint

本研究中將大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白（GSIV-MCP）基因克隆至原核表達載體pET-32a中進行了融合表達，表達的重組蛋白的分子量約70 ku。由于pET-32a原核表達載體，含有一段編碼硫氧還蛋白的序列（編碼109個氨基酸）、6個組氨酸標簽序列及一個S標簽序列（編碼15個氨基酸）與目的蛋白融合表達，因此重組蛋白的分子量比目的蛋白大20.4 ku。目的基因與pET-32a融合表達這不僅提高了表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性，而且便于純化和鑒定，同時又不影響目的蛋白的免疫原性。重組表達載體pET-32a-MCP經(jīng)誘導條件的優(yōu)化，在大腸桿菌BL21中得到了高效表達。結果表明，0.5 mmol/L的IPTG于37 ℃的條件下誘導6 h重組蛋白的表達量最佳。重組蛋白主要以包涵體形式存在，包涵體的形成便于重組蛋白的純化。包涵體經(jīng)磷酸鈉緩沖液（含8 mol/L尿素）溶解、蛋白純化試劑盒純化得到了高純度的可溶性蛋白。以此蛋白免疫新西蘭大白兔制備了抗血清，抗血清經(jīng)過抗體親和純化得到純度較高的多克隆抗體。Western blot得到一條與預期大小一致蛋白雜交帶，說明GSIV-MCP多克隆抗體特異性較好，純度較高。間接熒光免疫結果表明，GSIV-MCP多克隆抗體能特異性的檢測GSIV，說明制備的GSIV-MCP多克隆抗體能夠滿足GSIV免疫檢測的要求。

將GSIV主要衣殼蛋白在大腸桿菌BL21中進行了融合表達，并將其純化，制作多克隆抗體，這將為大鯢病毒性疾病的防治及GSIV的免疫檢測試劑盒的研制奠定一定的基礎。

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