1株耐熱纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及其酶學(xué)特性

金偉+陳文靜+繆禮鴻+劉蒲臨

摘要：采用富集培養(yǎng)并結(jié)合濾紙條降解法進(jìn)行初篩，從土壤中分離到1株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的耐熱真菌XT3。通過(guò)菌株的形態(tài)特征和18S rDNA序列同源性比較，該菌株被鑒定為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。發(fā)酵試驗(yàn)表明，XT3菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)的最適起始pH值為4.0，最適產(chǎn)酶發(fā)酵溫度為45 ℃；該菌株產(chǎn)生的羧甲基纖維素（CMC）酶和濾紙酶的最適作用溫度分別為80、70 ℃，具有較好的耐熱性、耐酸性。此外，研究還表明，XT3菌株能夠較好地利用木薯酒糟液發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，在木薯酒糟液培養(yǎng)基中添加2%麩皮可使發(fā)酵液的纖維素酶活性提高2.1倍，表明該菌株具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；煙曲霉；耐高溫真菌；篩選；木薯酒糟培養(yǎng)液

中圖分類號(hào)： Q939.96；S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0272-03

纖維素的降解由內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶協(xié)同完成。纖維素酶在微生物中廣泛存在，但是微生物所產(chǎn)纖維素酶的熱穩(wěn)定性往往并不理想，絕大部分真菌纖維素酶的最適反應(yīng)溫度一般為50～60 ℃[1]。耐熱酶在工業(yè)應(yīng)用中具有許多突出的優(yōu)點(diǎn)，嗜熱微生物及其產(chǎn)生的耐熱酶一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一[2-3]。

木薯酒糟利用的是木薯生產(chǎn)乙醇后的殘?jiān)?，由于其纖維質(zhì)含量較高，一般不宜直接作為飼料，如不加以合理利用將造成資源浪費(fèi)[4]。新鮮木薯酒糟液具有高溫、濕熱和偏酸的特點(diǎn)，因此，利用木薯酒糟液培養(yǎng)耐熱真菌生產(chǎn)高溫纖維素酶具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究報(bào)道了1株從土壤中篩選的產(chǎn)高溫纖維素酶的耐熱真菌，對(duì)該菌的產(chǎn)酶條件和部分酶學(xué)特性進(jìn)行研究，并進(jìn)一步探索利用木薯酒糟培養(yǎng)高溫真菌生產(chǎn)耐熱纖維素酶的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 本研究菌種分別是從武漢市、廈門(mén)市周邊地區(qū)富含纖維素的土壤中分離獲得的。黑曲霉為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。木薯酒糟液（含干基4%）由廣西中糧生物質(zhì)能源有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 （1）富集培養(yǎng)基：取1 000 mL木薯酒糟，用15%H2SO4、NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為4.0～5.0。（2）羧甲基纖維素（CMC）瓊脂培養(yǎng)基：10 g羧甲基纖維素鈉，4 g （NH4）2SO4，2 g KH2PO4，0 5 g MgSO4·7H2O，0.5 g MnSO4，20 g瓊脂，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為4.0～5.0。（3）復(fù)篩液體培養(yǎng)基：10 g羧甲基纖維素鈉，4 g （NH4）2SO4，2 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g MnSO4，加蒸餾水至 1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為4.0～5.0。（4）PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g蔗糖，20 g瓊脂，加蒸餾水至1 000 mL，pH值自然。（5）濾紙條崩解培養(yǎng)基：1.5 g牛肉膏，1.0 g蛋白胨，2.0 g CaCO3，加蒸餾水至1 000 mL。每個(gè)試管分裝成高7 cm深層，并放入1條11 cm×6 cm濾紙條。（6）發(fā)酵培養(yǎng)基：1 000 mL木薯酒糟液，4 g （NH4）2SO4，2 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g MnSO4，pH值4.0～5.0。比較不同碳源培養(yǎng)基發(fā)酵效果時(shí)，分別用40 g稻草或40 g麩皮加960 mL蒸餾水替代木薯酒糟液，其余成分同上。（7）不同起始pH值稻草發(fā)酵培養(yǎng)液：用15%H2SO4、NaOH溶液分別調(diào)節(jié)稻草發(fā)酵培養(yǎng)液的起始pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。以上培養(yǎng)基均在121 ℃濕熱滅菌20 min后使用。

1.2 耐高溫產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選方法

取枯枝落葉下5～10 cm的土壤樣品10 g，加至90 mL無(wú)菌水中搖勻，制成土壤懸液，取1mL土壤懸液接種于富集培養(yǎng)基中，50 ℃、170 r/min培養(yǎng)2 d后，將適當(dāng)稀釋的菌液分別涂布于pH值4.0～5.0的初篩培養(yǎng)基平板上，50 ℃培養(yǎng)3 d。挑取部分在初篩平板上生長(zhǎng)較大的單菌落，分別劃線轉(zhuǎn)接至纖維素培養(yǎng)基上純化1～2次后，進(jìn)行菌株編號(hào)保藏。取初篩保存的各菌株分別接入濾紙條崩解培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 d后，濾紙條培養(yǎng)液中出現(xiàn)不同深度的黃色膠狀物，濾紙發(fā)生不同程度的潰爛。根據(jù)培養(yǎng)液黃色深淺及濾紙條的腐爛程度，選取對(duì)纖維素降解能力較強(qiáng)的菌株用于酶活性的測(cè)定。

1.3 纖維素酶活性的測(cè)定

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定。

1.3.2 羧甲基纖維素酶（簡(jiǎn)稱CMCase）活性的測(cè)定[5] 每個(gè)菌株取5 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心10 min，取上清液，即為粗酶液。在25 mL刻度試管中先加入3 mL 1%CMC溶液，再加入1.0 mL粗酶液，搖勻。樣品放入50 ℃水浴中保溫反應(yīng)l h后，立即加入1.5 mL DNS試劑，然后各樣品及空白對(duì)照同時(shí)放入沸水浴中反應(yīng)5 min，取出后立即置于水中冷卻，540 nm處測(cè)定其吸光度。酶活性單位定義：在一定的反應(yīng)條件（pH值、溫度）下，1 h內(nèi)由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位（U）。

CMC酶最適溫度的測(cè)定：設(shè)置50、60、70、80、90 ℃ 5個(gè)溫度梯度，讓酶液與1%CMC在對(duì)應(yīng)溫度下充分反應(yīng)1 h，測(cè)定540 nm下的吸光度，得到該酶的最適作用溫度。

1.3.3 濾紙酶活測(cè)定[6] 取3 mL pH值4.8檸檬酸緩沖液，加入1 cm×6 cm新華定量濾紙，再加入粗酶液1.0 mL，50 ℃恒溫水浴保持l h，加入1.5 mL DNS試劑于沸水浴中放置 5 min，冷卻定容后于540 nm處測(cè)定其吸光度，用DNS法測(cè)定還原糖含量。在上述條件下，定義1 h催化水解底物生成 1 μmol 葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活性單位（U）。endprint

1.4 高溫真菌DNA提取、PCR及18S rDNA序列比對(duì)方法[7]

18S rRNA基因分析：使用18S通用引物5′-GGAAGGG

RTGTATTTATTAG-3′、5′-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測(cè)序由上海博亞公司完成，序列比對(duì)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫產(chǎn)纖維素酶真菌的分離及酶活性比較

從30株耐高溫真菌中初步選出7株對(duì)濾紙條降解能力較強(qiáng)的菌株，分別編號(hào)為XT3、E4、XMY3、D5、D6、D3、L8。將這7株菌株分別接種于木薯酒糟發(fā)酵培養(yǎng)基中，于50 ℃、170 r/min 下培養(yǎng)2 d，測(cè)定各菌株CMCase活性和濾紙酶活性。由圖1可以看出，這7株菌株中，菌株XT3的濾紙酶活性、CMC活性均最高，分別為1.982、2.112 U/mL。

2.2 XT3菌株的分類鑒定結(jié)果

XT3菌株的顯微形態(tài)觀察結(jié)果顯示，該菌株的分生孢子梗較短，頂端膨大呈圓形的頂囊上附著許多單層或雙層的小梗，末端著生分生孢子（圖2），從其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)看，該菌株是典型的曲霉屬真菌。為了進(jìn)一步確定該菌的分類地位，用通用引物擴(kuò)增出其18S rDNA序列，將XT3菌株測(cè)序得到的18S rDNA序列（1 080個(gè)堿基對(duì)）在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明，XT3的18S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中煙曲霉（Aspergillus fumigatus） ATCC3627的同源性達(dá)100%。因此，根據(jù)XT3菌株的形態(tài)特征和18S rDNA序列對(duì)比結(jié)果，可將XT3菌株鑒定為1株煙曲霉。

2.3 發(fā)酵條件對(duì)菌株XT3產(chǎn)酶活性的影響

2.3.1 碳源對(duì)菌株XT3產(chǎn)酶的影響 將XT3分別接種于木薯酒糟液培養(yǎng)基、4%稻草培養(yǎng)基、4%麩皮培養(yǎng)基中，50 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)2 d后，分別測(cè)定CMCase活性、濾紙酶活性。由圖3可以看出，XT3菌株在木薯酒糟液培養(yǎng)基中的濾紙酶活性、CMCase活性均最高，分別為1.97、2.04 U/mL，其濾紙酶活性是在稻草培養(yǎng)基中的2.2倍。

2.3.2 起始pH值對(duì)菌株XT3產(chǎn)酶的影響 將XT3接種于不同pH值的木薯酒糟液培養(yǎng)基中，50 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)2 d后分別測(cè)定發(fā)酵液CMCase活性、濾紙酶活性。從圖4可以看出，XT3菌株在木薯酒糟液pH值4.0時(shí)，其濾紙酶活性、CMCase活性均達(dá)到最高值，表明XT3菌株產(chǎn)生的纖維素酶具有較好的耐酸性。

2.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株XT3產(chǎn)纖維素酶活的影響 將XT3分別接種于pH值4.0的木薯酒糟液培養(yǎng)基中，于不同溫度、170 r/min搖床培養(yǎng)2 d后，分別測(cè)定CMCase活性、濾紙酶活性。圖5表明，培養(yǎng)溫度為45 ℃時(shí)XT3菌株的濾紙酶活性、纖維素酶活性最高，分別為2.82、2.61 U/mL。

2.3.4 不同添加物對(duì)菌株XT3產(chǎn)纖維素酶的影響 將菌株XT3分別接種于木薯酒糟液以及添加1%麩皮、2%麩皮、01%吐溫-80、0.2%吐溫-80、0.2%洗衣粉的木薯酒糟液培養(yǎng)基中，于50 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)2 d后測(cè)定CMCase活性和濾紙酶活性。圖6表明，添加2%麩皮的木薯酒糟液培養(yǎng)基產(chǎn)纖維素酶效果最好，其CMCase活性達(dá) 3.836 U/mL，是不添加任何成分的對(duì)照培養(yǎng)基酶活性的21倍。

2.4 XT3菌株產(chǎn)纖維素酶最適酶促反應(yīng)溫度測(cè)定

將XT3菌株和1株黑曲霉菌株分別接種于pH值4.0的木薯酒糟液培養(yǎng)基中，分別于45、35 ℃搖床培養(yǎng)2 d，得到粗酶液，在不同反應(yīng)溫度下測(cè)定其CMCase酶活性、濾紙酶活性。由圖7可以看出，XT3菌株的CMC酶活性在80 ℃最高，達(dá)25 U/mL，是黑曲霉最高酶活性的1.5倍。XT3菌株的濾紙酶活性在70 ℃時(shí)最高，達(dá)2.11 U/mL，為黑曲霉最高酶活性的14倍，表明XT3菌株產(chǎn)生的纖維素酶具有較好的耐熱性。

3 結(jié)論與討論

本研究從土壤中分離和篩選到1株產(chǎn)纖維素酶活性較高的耐熱真菌XT3菌株，經(jīng)鑒定為1株煙曲霉。該菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最適起始pH值為4.0，最適產(chǎn)酶溫度為45 ℃。XT3菌株產(chǎn)生的CMC酶、濾紙酶的最適溫度分別為80、70 ℃。目前，國(guó)內(nèi)已有報(bào)道表明，嗜熱真菌產(chǎn)纖維素酶的最適溫度為60 ～ 70 ℃[8-12]， 因此XT3菌株所產(chǎn)生的嗜熱纖維素酶具有深入研究的價(jià)值。

XT3菌株能夠較好地利用木薯酒糟液發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，與不添加任何成分的木薯酒糟液培養(yǎng)基相比，XT3菌株在添加2%麩皮的木薯酒糟液培養(yǎng)基中產(chǎn)纖維素酶能力提高了21倍，表明利用嗜熱或耐熱真菌資源開(kāi)發(fā)利用木薯酒糟生產(chǎn)耐高溫纖維素酶具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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