1株海洋來源產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株的篩選及其對木質(zhì)纖維材料的降解能力

摘要：利用平板透明圈法，從海水中分離得到3株具有阿魏酸酯酶活性的菌株。其中，菌株S1表現(xiàn)出良好的阿魏酸酯酶活性且產(chǎn)酶周期短。根據(jù)其形態(tài)特征、分子生物學鑒定結(jié)果，推測S1為嗜甲基菌科。這是首次發(fā)現(xiàn)嗜甲基菌科菌株具有阿魏酸酯酶活性。以去淀粉麥麩（DSWB）為底物檢測酶學性質(zhì)，結(jié)果表明，S1所產(chǎn)阿魏酸酯酶FAES1酶活性為（2.81±0.35）U/mL，該酶最適反應溫度為45 ℃，最適反應pH值為7.0。FAES1在70 ℃保溫2 h仍可保持80%以上酶活性，表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性。FAES1對DSWB、汽爆小麥秸稈（SEWS）、汽爆玉米秸稈（SECS）表現(xiàn)出一定的降解能力，以對DSWB的降解能力最強。FAES1與木聚糖酶協(xié)同作用6 h，分別能夠釋放DSWB、SEWS、SECS中46.0%、33.2%、14.1%的阿魏酸。

關(guān)鍵詞：阿魏酸酯酶；嗜甲基菌科；海洋微生物；鑒定；酶學性質(zhì)

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0275-04

隨著環(huán)境污染的加劇和石化資源的日益枯竭，可再生能源的開發(fā)和利用已經(jīng)成為全世界共同關(guān)注的問題。木質(zhì)纖維素（如麥麩、秸稈等）是地球上較豐富的可再生資源，可以通過光合作用年復一年再生而不枯竭，從而越來越受到重視。我國是農(nóng)業(yè)大國，木質(zhì)纖維素資源十分豐富，僅農(nóng)業(yè)秸稈、皮殼年產(chǎn)量就高達7億t以上[1]，然而目前多用于燃燒、動物飼料，沒有充分發(fā)揮其價值，從而造成資源的浪費。

植物細胞壁中的酚酸類物質(zhì)（如阿魏酸、對香豆酸、咖啡酸等）通過酯鍵在木質(zhì)素之間、木聚糖之間及木聚糖與木質(zhì)素之間形成交聯(lián)，阻礙了木質(zhì)纖維素的降解和利用。目前，水解木質(zhì)纖維素主要通過化學法、生物酶解法2種方式進行[2-4]?；瘜W法雖然操作簡單、效率高，但該過程通常使用強酸、強堿，產(chǎn)生的廢液容易污染環(huán)境。相比之下，生物酶法更加綠色環(huán)保。阿魏酸酯酶（feruloyl esterase，簡稱FAE；EC 31.1.73）屬于羧酸酯水解酶，可以破壞阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯及多聚糖阿魏酸酯中的酯鍵并釋放阿魏酸，可以有效破壞致密的網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)。為提高木質(zhì)纖維素的降解效率，實現(xiàn)阿魏酸酯酶在醫(yī)藥、食品、造紙、生物燃料等行業(yè)的應用，獲得性質(zhì)優(yōu)良的阿魏酸酯酶成為亟待解決的問題。

由于海洋獨特的環(huán)境條件（如高壓、低營養(yǎng)、低溫及局部高溫、高鹽等），海洋來源微生物形成了特殊的結(jié)構(gòu)，為人類提供了眾多結(jié)構(gòu)新穎、功能獨特的生物活性物質(zhì)，如纖維素酶[5]、木聚糖酶[6]等木質(zhì)纖維素降解酶類。由此可以推測，海洋環(huán)境中可能蘊藏著新穎獨特的阿魏酸酯酶資源。本研究從海水中獲得1株產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株，并對該酶對多種植物材料的降解能力進行研究，以期為挖掘海洋來源阿魏酸酯酶資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 海水樣品采自濰坊濱海開發(fā)區(qū)海域（屬于萊州灣南部，于2014年8月采集），樣品的處理方法見文獻[7]。

1.1.2 試劑 阿魏酸乙酯，購自Sigma-Aldrich公司；阿魏酸標準品，購自阿拉丁試劑公司；PCR擴增相關(guān)試劑和DL15000 Marker，購自TaKaRa公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；木聚糖酶（50 000 U/g），購自江蘇銳陽生物科技有限公司；麥麩，購自當?shù)孛娣蹚S；除乙腈為色譜純外，其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 ABI9700 PCR擴增儀；LC-20A高效液相色譜儀，日本島津；DYY-6C型核酸電泳槽，北京六一生物科技有限公司；GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)，美國Syngene公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺，江蘇蘇凈集團有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 （1）篩選培養(yǎng)基：0.05%氯化鈣，1%氯化鈉，0.05%磷酸氫二鉀，0.05%磷酸二氫鉀，0.1%硫酸銨，0.005% 硫酸鎂，2%瓊脂，pH值7.0～7.2。每個平板倒 20 mL 篩選培養(yǎng)基，加入0.3 mL過濾除菌的10%（體積分數(shù)）溶于二甲基甲酰胺（DMF）的阿魏酸乙酯，立即搖勻，直至呈現(xiàn)云霧狀；（2）發(fā)酵培養(yǎng)基：1%氯化鈉，0.5%硫酸銨，0.1% 酵母粉，0.05%磷酸氫二鉀，0.05%磷酸二氫鉀，0.5%阿魏酸乙酯，pH值7.0～ 7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 平板法初篩 將樣品的稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基上，20 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察是否出現(xiàn)透明水解圈。根據(jù)透明圈出現(xiàn)的早晚、透明圈直徑與菌落直徑比值（R值）的大小篩選獲得活性高且產(chǎn)酶周期短的菌株。將菌株接種于篩選培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌體16S rDNA序列測定與分析 將菌株接種于液體培養(yǎng)基中，20 ℃培養(yǎng)2 d，離心收集菌體，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取其DNA。采用16S rDNA的通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGCTACCTT GTTACGACTT-3′）進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序工作。將測序結(jié)果在GenBank中進行序列同源性分析，并利用Mega 5.2軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.3 菌體粗酶液酶學特性的研究 從篩選培養(yǎng)基上挑取少許菌種，接種于裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，20 ℃靜置培養(yǎng)2 d。4 ℃、16 000 g離心5 min，收集上清，即得到粗酶液。

（1）粗酶酶活性的測定。酶解底物為去淀粉麥麩（DSWB），制備方法參見文獻[8]。取上述250 μL粗酶液于離心管中，并加入750 μL磷酸緩沖液（100 mmol/L，pH值 7.0），45 ℃恒溫水浴保溫5 min。隨后加入10 mg DSWB反應60 min，沸水浴5 min后終止反應，通過高效液相色譜（HPLC）檢測酶反應液中阿魏酸的含量。在上述反應條件下，1 min產(chǎn)生1 μg阿魏酸所需的酶量定義為1個酶活性單位（U）。endprint

HPLC的檢測條件如下：Inertsil C8-3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-1%冰醋酸（體積比 30 ∶ 70）；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長320 nm；進樣量20 μL。

（2）粗酶的最適溫度與溫度穩(wěn)定性。分別用不同溫度（30～70 ℃）代替上述酶反應體系中反應溫度，測定粗酶液在各溫度下的酶活性。以最高酶活性為100%，計算相對酶活性。將粗酶液置于不同溫度（45～80 ℃）下，恒溫水浴處理 2 h，每個溫度設(shè)3個重復，測定殘余酶活性。

（3）粗酶的最適pH值與pH值穩(wěn)定性。使用檸檬酸鈉緩沖液（50 mmol/L，pH值5.0），50 mmol/L pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.4、8.0的磷酸緩沖液和甘氨酸-NaOH緩沖液（50 mmol/L，pH值9.0、10.0）代替上述酶反應體系中使用的緩沖液，測定在各pH值下的酶活性。設(shè)最高酶活性為100%，計算相對酶活性。將粗酶液置于不同緩沖液（pH值5.0～10.0）中，45 ℃保溫2 h，每個pH值設(shè)3個重復，測定殘余酶活性。

1.2.4 菌體粗酶液對木質(zhì)纖維素材料的降解 通過在上述酶反應體系中添加10 U木聚糖酶后測定阿魏酸釋放量提高與否檢測粗酶與木聚糖酶的協(xié)同關(guān)系。分別使用250 μL FAES1和混合酶液（250 μL FAES1、10 U木聚糖酶）作用于10 mg DSWB、10 mg汽爆小麥秸稈（SEWS）、10 mg汽爆玉米秸稈（SECS）6 h后，每個組合設(shè)3次重復，測定阿魏酸的釋放量。SEWS、SECS采用曾薇等的方法[9]進行制備。上述植物纖維材料中阿魏酸的含量可以采用Mukherjee等的方法[10]進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株S1的篩選

利用平板透明圈法，從海水中篩選到3株具有阿魏酸酯酶活性的菌株。由表1、圖1可知，菌株S1出現(xiàn)阿魏酸酯酶活性最早，且透明圈直徑最大。透明圈出現(xiàn)的早晚與產(chǎn)酶周期、R值與酶活性呈正相關(guān)，由此說明菌株S1產(chǎn)酶周期短，且阿魏酸酯酶活性較高。

2.2 產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株S1的鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 菌株S1在固體培養(yǎng)基中于 20 ℃ 培養(yǎng)2 d后，直徑為2～3 mm，菌落為白色，且長入培養(yǎng)基內(nèi)部，表面干燥、粗糙，邊緣不規(guī)則，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，不易挑起（圖1）。在液體培養(yǎng)基中，S1呈顆粒狀附著于甁壁，不使培養(yǎng)基變渾濁（圖2-a）。該菌在普通細菌營養(yǎng)培養(yǎng)基（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基）中不生長。通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，S1細胞呈球狀（圖2-b），革蘭氏陰性。

2.2.2 16S rDNA擴增及分析 通過PCR擴增獲得菌株S1的16S rDNA片段的電泳結(jié)果如圖3所示。經(jīng)測序，此16S rDNA序列長1 437 bp，提交至NCBI GenBank，注冊號為KT721290。將該序列提交至GenBank進行同源序列比對，結(jié)果顯示，在檢索到的100個相似性較高的16S rDNA序列中，有39個為甲基營養(yǎng)菌種屬，1個為氨基營養(yǎng)菌種屬，其余為不可培養(yǎng)微生物。其中，菌株S1與鞭毛甲基小桿菌（Methylobacillus flagellatus）的同源性最高，高達97%。以16S rDNA序列同源性為基礎(chǔ)，使用Mega 5.2的鄰接（Neighbor-Joining） 分析法經(jīng)過1 000次置換式取樣計算出 Bootstrap值生成系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖4。結(jié)合該菌的形態(tài)特征，推測該菌屬于嗜甲基菌科。

2.3 粗酶FAES1酶學特性研究

2.3.1 粗酶酶活性 以DSWB為底物檢測粗酶的酶活性，結(jié)果表明，該粗酶的酶活性為（2.81±0.35）U/mL。

2.3.2 粗酶的最適作用溫度和熱穩(wěn)定性 FAES1在45 ℃時酶活性最高，在40～60 ℃時相對酶活性保持在70%以上，高于60 ℃或低于40 ℃時酶活性呈下降趨勢。由圖5可見，當粗酶液于70 ℃保溫2 h后，殘余酶活性可維持80%以上；當溫度上升至75 ℃時，粗酶液保育2 h后仍可保存45%左右的酶活性。由此可見，F(xiàn)AES1具有明顯的熱穩(wěn)定性，從而使其在高溫工業(yè)流程（如制漿過程）中具有應用潛力。

2.3.3 粗酶的最適作用pH值和pH值穩(wěn)定性 由圖6可知，F(xiàn)AES1的最適pH值為7.0。在pH值6.0～9.0的范圍內(nèi)，粗酶表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，殘余酶活性可維持80%以上。

2.4 粗酶FAES1與木聚糖酶對木質(zhì)纖維素材料的協(xié)同作用

通過在反應體系中添加木聚糖酶與否檢驗FAES1與木聚糖酶的協(xié)同作用。經(jīng)測定，當FAES1單獨作用于10 mg DSWB、10 mg SEWS、10 mg SECS 6 h時，可以釋放阿魏酸的量分別約占各種材料中總阿魏酸含量的37.0%、16.5%、79%；當使用混合酶液（含F(xiàn)AES1與木聚糖酶）作用同樣時間，阿魏酸釋放量分別約占總含量的46.0%、33.2%、141%，均高于單獨使用FAES1，其中以對DSWB的降解能力最強（表2）。

3 討論與結(jié)論

本研究通過平板透明圈法從海水中獲得1株產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株S1，通過其培養(yǎng)特征、形態(tài)特征和分子生物學鑒定，初步推測其屬于嗜甲基菌科，這是首次發(fā)現(xiàn)此科菌株具備阿魏酸酯酶活性，為生產(chǎn)阿魏酸酯酶的微生物新成員。

經(jīng)過初步酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，菌株S1所生產(chǎn)的阿魏酸酯酶FAES1在70 ℃下仍保持較高酶活性，與騰沖嗜熱厭氧菌（Thermoanaerobacter tengcongensis）來源的阿魏酸酯酶TtFAE[11]相似。萊州灣南岸海域年平均水溫11～12 ℃[12]，并不屬于高溫海域，然而源于菌株S1的阿魏酸酯酶FAES1卻具有顯著的熱穩(wěn)定性。已報道的阿魏酸酯酶Est27[13]、纖維素酶Cel5A[14]表現(xiàn)出與其非極端環(huán)境的來源不相關(guān)的良好的耐鹽性。此現(xiàn)象的出現(xiàn)可能由于非極端環(huán)境承受更大溫度、鹽度、pH值的變化波動，那么處于非極端環(huán)境的生物酶需要適應這些波動而發(fā)揮其生物活性[11]。FAES1所具有的顯著熱穩(wěn)定性使其具備工業(yè)應用的潛力。endprint

FAES1對麥麩、小麥秸稈、玉米秸稈均表現(xiàn)出降解能力，顯示其較廣的天然底物范圍，其中以對麥麩的作用能力最強。與StFaeC（Sporotrichum thermophile）[15]、AusfaeA（Aspergillus usamii）[16]相似，F(xiàn)AES1單獨作用于DSWB時能夠釋放阿魏酸，且能夠釋放出高達37%的阿魏酸，遠高于上述阿魏酸酯酶（單獨使用StFaeC、AusfaeA分別可釋放DSWB中3.7%、19.48% 阿魏酸），表現(xiàn)出較高的酶活性。木聚糖酶的加入可以提高阿魏酸的釋放量，說明阿魏酸酯酶在木質(zhì)纖維素降解過程中與木聚糖酶具有良好的協(xié)同關(guān)系[13]。阿魏酸以其抗氧化、防自由基、抗血栓、降血脂、抗癌、抗輻射等功能著稱[17]，可用作功能性食品、化妝品的添加劑，廣泛存在于麥麩中。FAES1與木聚糖酶的協(xié)同作用能夠釋放DSWB中高達46%的阿魏酸，顯示FAES1在提高麥麩價值方面極具應用潛力。

上述試驗結(jié)果顯示，海洋環(huán)境中確實蘊藏著豐富且新穎的阿魏酸酯酶，可利用宏基因組技術(shù)開發(fā)更多的海洋阿魏酸酯酶資源。后續(xù)研究將進一步確定FAES1的類型，并圍繞菌株S1產(chǎn)酶條件的優(yōu)化、FAES1的純化、阿魏酸酯酶基因克隆與表達等方面展開工作，以期提高阿魏酸酯酶FAES1的活性，深入挖掘其應用價值。

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