凌云 方明筍 金璐 齊月寒 張利棕 周衛(wèi)民 壽旗揚

浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心 杭州 310053

遙測技術對自發(fā)性高血壓大鼠呼吸、體溫和自主活動的監(jiān)測及分析

凌云 方明筍 金璐 齊月寒 張利棕 周衛(wèi)民 壽旗揚

浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心 杭州 310053

[目的]應用植入式遙測技術，觀察清醒無束縛狀態(tài)下自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat,SHR）呼吸、體溫和自主活動的晝夜波動及不同月齡、性別間的差異。[方法]取3月齡SPF級SHR共16只，雌雄各半，手術植入C50-PXT遙測植入子，術后7 d開始觀測。在3、5、7月齡時分別對清醒無束縛SHR呼吸、體溫和自主活動進行24h連續(xù)監(jiān)測。[結果]3月齡SHR夜間平均呼吸頻率、體溫和自主活動頻率均高于白晝，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。夜間和白晝平均呼吸頻率分別為（85.16±5.84）次/min和（78.66±5.67）次/min，8:00 PM和1:00 AM左右出現峰值，分別為（94.20±3.21）次/min和（93.06±4.11）次/min；2:00 PM～3:00 PM出現低谷，谷值為（71.21±2.37）次/min。夜間和白晝平均體溫分別為（37.69±0.44）℃和（37.18±0.39）℃，在9:00 PM～10:00 PM 和 1:00 AM～2:00 AM 左右出現峰值，分別為（38.09±0.31）℃和（38.11±0.33）℃；在 2:30 PM～3:30 PM 出現低谷，谷值為（36.72±0.21）℃。白天SHR自主活動頻率差異大，在6:30 AM和8:00 AM左右出現兩個峰值，分別為（47.43±5.42）次/min和（50.74±4.79）次/min。隨著月齡的增加，SHR的呼吸頻率逐漸降低；體溫和自主活動則存在性別差異：雄性SHR體溫逐漸升高，雌性則相反；雌性SHR的自主活動頻率隨月齡增加，不同月齡間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而不同月齡雄性SHR的自主活動則無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。[結論]3月齡SHR的呼吸、體溫和自主活動呈晝夜節(jié)律性變化，夜間平均顯著高于白晝。SHR呼吸頻率隨月齡的增加而逐漸減低，性別間差異不顯著；隨月齡增加，雄性和雌性SHR的體溫分別呈現逐漸升高和降低的趨勢；雌性自主活動隨月齡顯著增多，而雄性變化不大。

遙測技術；SHR；呼吸頻率；體溫；自主活動頻率；晝夜節(jié)律；月齡；性別

高血壓是最常見的心血管疾病，近10年發(fā)病率不斷升高，也是心腦血管病最主要的危險因素。自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat,SHR）與人類高血壓患者有相似之處，如發(fā)病機制、外周血管阻力變化、高血壓心血管并發(fā)癥、對鹽的敏感性等方面[1]，是目前國際公認的研究人類原發(fā)性高血壓（essential hypertension,EH）最理想的動物模型以及高血壓基礎研究和藥物篩選的首選[2]。此外，SHR還是目前研究認知障礙和注意力缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder,ADHD）的理想模型[3-4]。

近年來，SHR在醫(yī)學科研中得到了廣泛應用。增強對其病理生理特征的了解，有助于研究者在研究過程中合理設計和安排實驗，解決實驗中動物模型出現的問題。呼吸頻率、體溫、自主活動等生命體征是大鼠實驗中常用的生理指標，能夠反映大鼠生存狀態(tài)的變化。SHR交感神經緊張性高于正常大鼠[5-6]，采用傳統(tǒng)監(jiān)測方法難以真實反映其生理特征。

植入式無線遙測技術是一種應用無線傳輸來進行生理信號采集的技術，可在動物清醒自由的狀態(tài)下，長時間監(jiān)測其生理狀態(tài)，所得到的數據更科學、準確[7]。因此，本實驗采用植入式無線遙測技術監(jiān)測不同月齡和性別SHR的呼吸、體溫、自主活動晝夜變化，為SHR在高血壓、認知障礙和ADHD等多領域的應用提供生理參數的支持。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑 DEM小動物生理信號遙測系統(tǒng)和TL11M2-C50-PXT遙測植入子為美國DSI公司產品；生理遙測系統(tǒng)分析軟件為法國 EMKA公司產品；AWS型動物呼吸麻醉機和恒溫水泵為美國Hallowell公司產品；手術器械包括剪刀、鑷子、牽引器、縫合針線，均購自上海醫(yī)療器械有限公司。麻醉劑異氟烷（批號：120328）購自山東魯南貝特制藥有限公司；生物膠為美國3M公司產品；碘伏消毒液（批號：20120605）購自江西草珊瑚消毒用品有限公司。

1.2 實驗動物 3月齡SPF級的SHR共16只，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK（京）2012-0001]，并于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心的SPF級屏障實驗室中進行遙測植入子無菌植入手術[SYXK（浙）2008-0115]。根據3R原則對每只動物給予人道主義關懷。

1.3 實驗方法

1.3.1 遙測感應器植入手術 手術相關物品提前滅菌消毒，用異氟烷（誘導麻醉濃度為3%，維持麻醉為1.5%）對SHR進行麻醉。將SHR仰臥固定于恒溫保溫臺（37～38℃），沿腹中線切開一小口，用牽引器拉開暴露腹腔，仔細推開臟器找到腹主動脈。分離腹主動脈周圍的脂肪和黏連組織，取2號縫合線小心穿過腹主動脈下方并在靠心端打結，暫時阻斷動脈血流。小心刺破主動脈，將無菌導管輕輕插入腹主動脈血管1～2cm。用生物膠和纖維膜粘合血管，10～15s后輕輕解開阻斷動脈血流的縫合線。輕輕推壓腹部使腸道恢復原位，縫合腹腔。見圖1。

圖1 C50-PXT腹腔內放置位點Fig.1 The intraperitoneal site of the C50-PXT implant placement

1.3.2 術后護理 術后3d內每日給予肌注青霉素（20萬U·mL-1）預防感染，本實驗16只大鼠均植入成功，無動物損耗。每只大鼠稱重、標記編號并單籠飼養(yǎng)，以防相互干擾遙測信號。7d后進行實驗。

1.3.3 數據采集、分析及指標的觀察 采集到的信號均以無線方式傳送，并轉化為數據用于統(tǒng)計分析。于3、5、7 月齡時分別檢測 SHR 24h、白晝（6:00 AM～6:00 PM）和夜間（6:00 PM～次日 6:00 AM）的呼吸頻率、體溫、自主活動頻率均值，并分別繪制24h呼吸頻率、體溫和自主活動頻率變化趨勢圖。所有圖片用GaphPad Prism 6軟件制作。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料均用±s表示，采用方差分析（ANOVA）進行檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3月齡SHR呼吸頻率、體溫和自主活動頻率的晝夜比較及24h變化趨勢 晝夜監(jiān)測結果表明，3月齡SHR夜間（6:00 PM～6:00 AM）平均呼吸頻率高于白晝（6:00 AM～6:00 PM），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。夜間8:00 PM左右和1:00 AM左右出現兩個峰值，分別為（94.20±3.21）次/min 和（93.06±4.11）次/min；白晝2:00 PM～3:00 PM出現一個低谷，谷值為（71.21±2.37）次/min。同時，3月齡SHR夜間平均體溫高于白晝，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。夜間9:00 PM～10:00 PM和1:00AM～2:00 AM出現兩個體溫峰值，分別為（38.09±0.31）℃和（38.11±0.33）℃；白晝 2:30PM～3:30PM出現一個低谷，谷值為（36.72±0.21）℃。3月齡SHR夜間平均自主活動頻率高于白晝，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。SHR白晝自主活動頻率差異大，在6:30AM和8:00AM左右出現兩個峰值，分別為（47.43±5.42）次/min 和（50.74±4.79）次/min，說明上午開燈、人員操作和噪音對SHR影響較大，在11:30AM～4:30PM的睡眠期自主活動頻率減低，最低活動頻率為1.09次/min。見表 1、圖 2-4。

表1 3月齡SHR呼吸、體溫和自主活動的晝夜比較（±s，n=16）Tab.1 Comparison of day and night stage respiration,boby temperature,autonomic activity in 3 months old SHR(±s，n=16)

表1 3月齡SHR呼吸、體溫和自主活動的晝夜比較（±s，n=16）Tab.1 Comparison of day and night stage respiration,boby temperature,autonomic activity in 3 months old SHR(±s，n=16)

注：與白晝階段比較，*P＜0.05（夜間和白晝分別統(tǒng)計48個時間點）。Note:Comparison between the day stage and the night stage,*P＜0.05(Statistics include 48 time points in night stage and day stage).

11.26±12.10 15.64±7.81*時間段 呼吸頻率（次/min） 體溫（℃） 自主活動頻率（次/min）白晝階段（day stage）夜間階段（night stage）78.66±5.67 85.16±5.84*37.18±0.39 37.69±0.44*

圖2 3月齡SHR呼吸頻率24h變化趨勢圖（代表峰值代表谷值）Fig.2 Fluctuation trend of respiratory rate of 3 months old SHR in 24h(stands for peakstands for valley)

圖3 3月齡SHR體溫24h變化趨勢圖（代表峰值代表谷值）Fig.3 Fluctuation trend of body temperature of 3 months old SHR in 24h(stands for peakstands for valley)

圖4 3月齡SHR自主活動頻率24h變1化趨勢圖（代表峰值代表谷值）Fig.4 Fluctuation trend of autonomic activity rate of 3 months old SHR in 24h(stands for peakstands for valley)

2.2 不同月齡、性別SHR呼吸頻率的比較 SHR的呼吸頻率隨著月齡增加而降低，雄性7月齡SHR的呼吸頻率低于3月齡，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；雌性7月齡SHR呼吸頻率低于雌性3月齡和5月齡SHR，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同月齡雌雄之間比較，雌性平均呼吸頻率略高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 2。

2.3 不同月齡、性別SHR體溫的比較 體溫是大鼠最重要的生理指標之一，涉及代謝等較多因素。本研究結果顯示，雄性SHR隨著月齡增加體溫呈現升高的趨勢，其中7月齡SHR體溫明顯高于3月齡和5月齡，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而雌性SHR隨著月齡增加體溫表現為降低的趨勢，其中7月齡SHR體溫低于3月齡和5月齡，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；此外，同月齡雌雄個體之間比較，3月齡和5月齡SHR雌雄間體溫差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而7月齡則無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表2 不同月齡、性別SHR呼吸頻率的比較（±s，n=8）Tab.2 Comparison of respiratory rate in SHR with different months old and sex(±s，n=8)

表2 不同月齡、性別SHR呼吸頻率的比較（±s，n=8）Tab.2 Comparison of respiratory rate in SHR with different months old and sex(±s，n=8)

注：與同性別3月齡比較，*P＜0.05；與同性別5月齡比較，#P＜0.05。Note:Compared with 3 months old group of the same sex,*P＜0.05;compared with 5 months old group of the same sex,#P＜0.05.

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表3 不同月齡、性別SHR體溫的比較（±s，n=8）Tab.3 Comparison of temperature in SHR with different months old and sexes(±s，n=8)

表3 不同月齡、性別SHR體溫的比較（±s，n=8）Tab.3 Comparison of temperature in SHR with different months old and sexes(±s，n=8)

注：與同性別 3 月齡比較，*P＜0.05；與同性別 5 月齡比較，#P＜0.05；與同月齡雄性比較，ΔP＜0.05。Note:Compared with 3 months old group of the same sex,*P＜0.05;compared with 5 months old group of the same sex,#P＜0.05;comparison between males of the same age,ΔP＜0.05.

37.82±0.23*#37.68±0.18*#不同月齡SHR體溫（℃）3月齡 5月齡 7月齡雄性雌性性別37.26±0.28 38.12±0.22Δ 37.38±0.30 38.00±0.28Δ

2.4 不同月齡、性別SHR自主活動頻率的比較 雄性SHR自主活動頻率隨月齡增加無明顯變化；但雌性變化明顯，到5月齡時，與3月齡比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），然而7月齡較3月齡顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），7月齡與5月齡比較也無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。另一方面，相同月齡的雌雄之間比較表明：7月齡時雌性SHR自主活動頻率約兩倍于雄性SHR，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而其余各月齡雌雄間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 不同月齡、性別SHR自主活動頻率的比較（±s，n=8）Tab.4 Comparison of autonmic activity rate in SHR with different months old and sexes(±s，n=8)

表4 不同月齡、性別SHR自主活動頻率的比較（±s，n=8）Tab.4 Comparison of autonmic activity rate in SHR with different months old and sexes(±s，n=8)

注：與同性別3月齡比較，*P＜0.05；與同月齡雄性比較，#P＜0.05。Note:Compared with 3 months old group of the same sex,*P＜0.05;comparison between males of the same age,#P＜0.05.

14.28±2.54 28.75±5.93*#不同月齡SHR自主活動頻率（次/min）3月齡 5月齡 7月齡雄性雌性性別13.34±1.64 14.37±6.67 13.49±2.57 21.12±10.68

3 討論

傳統(tǒng)的體溫、呼吸頻率和自主活動的監(jiān)測方法，由于對動物存在一定的束縛，而且環(huán)境條件要求較高，因此不能正確反映動物的實際生理狀態(tài)。本研究通過手術將輕量級的遙測傳感器植入SHR體內，可制備在實驗動物清醒、自由活動狀態(tài)下的SHR遙測模型，避免束縛等應激因素對動物的影響，長期、動態(tài)地監(jiān)測動物呼吸、體溫和自主活動，比較不同月齡和性別SHR這些指標方面的變化，為SHR的相關研究提供重要的生理參數。

從24h的變化趨勢來看，3月齡SHR夜間平均呼吸頻率、體溫和自主活動頻率（主要為雌性SHR）明顯高于白晝，呼吸頻率和體溫的最高值出現在夜間，而最低值出現在白晝，符合大鼠晝伏夜出的生理特性。而自主活動在6:30 AM和8:00 AM左右出現兩個高峰點，可能是上午開燈、人員操作和噪音對大鼠影響較大，造成峰值出現在白晝。因此，在檢測動物生理和病理指標時，應盡量避開這兩個時間段。對于獲得數據的穩(wěn)定性和可靠性而言，特別是一些精細的實驗，具有重要的意義。此外，比較其它品系如Wistar、MIJ和HFJ的同月齡大鼠[8]，本研究中SHR呼吸頻率相對較慢，體溫相對偏低，其原因是否與SHR自發(fā)高血壓有關，值得進一步研究。

呼吸、體溫以及自主活動與血壓一樣，均是動物的重要生理指標，因此被稱為生命體征。它們之間存在著相互影響，過熱或應激都會導致動物呼吸頻率加快，增加動物的壓迫感，影響其血壓變化，造成不一致和不準確的血壓讀數[9]。因此，保證動物的其他生命體征的穩(wěn)定，是保障血壓測量一致性和準確性的重要手段，對SHR具有重要的意義。

動物的體溫是最重要的生命體征之一，與許多因素相關，包括年齡、性別、生理周期、晝夜等[10]。正常情況下，其變化范圍不會超過1℃，否則可能預示著機體重要的病理生理改變[11]，比如癌癥潛伏期的發(fā)熱現象，為潛在的疾病提供了重要的警示信號。同時，體溫也是機體重要的防御機制，如病毒、細菌感染后的發(fā)熱，是機體調集免疫細胞并通過提高體溫使得病毒和癌細胞酶失活，阻止其對機體侵擾的一種免疫反應。因此，體溫對于機體的健康和內環(huán)境穩(wěn)定起到了關鍵的作用。筆者在實驗中發(fā)現，3月齡時雌性SHR體溫高于雄性，有統(tǒng)計學差異，該結果與其他大鼠的生理特征相吻合[8，12-13]，其原因主要是雌性大鼠的體溫受到生理周期影響波動較大，因此很多單一性別的實驗往往采用雄性大鼠。然而本研究進一步發(fā)現，隨著月齡的增加，雄性體溫逐漸升高，雌性逐漸降低，到7月齡時雌雄之間已經趨向一致，表明生理周期對老齡雌性SHR體溫的影響大大降低，因此對于研究老齡化的實驗，雌雄大鼠均可適用。至于雄性SHR體溫隨月齡增大而升高的現象，目前國內外還未有相關報道?？紤]到性別和月齡為主要差異，筆者認為可能是由于體重的增加，或者雄性激素水平的影響而導致其差異。

呼吸頻率也是動物重要的生理指標之一，其同樣受到年齡、性別、晝夜等因素的影響。正常情況下，動物的呼吸頻率與其心動周期呈正相關，可一定程度反映動物的心率變化[14-15]。以往其他研究結果顯示[8，12]，呼吸頻率與性別沒有顯著的相關性，隨著品系的不同而不同；本實驗結果則發(fā)現，SHR品系各月齡間雌性均高于雄性。同時，隨著月齡的增加，不同性別SHR的呼吸頻率均明顯降低，其原因可能是隨著月齡增加，SHR代謝水平和心率減慢，這與人類及其他動物相類似。

動物的自主活動作為動物精神狀態(tài)的一種反映，主要用于考察動物中樞神經系統(tǒng)的功能和篩選神經精神藥物研究的模型[16-17]。本研究發(fā)現，雌性SHR自主活動隨著月齡增加而增加，差異有統(tǒng)計學意義，而雄性則沒有；該結果與Hyde等[18]的研究結果相符，其原因可能與雄性大鼠黑質紋狀體兩側失衡有關。此外，郭田友等[19]研究證實，其開發(fā)的藥物可通過調控煙堿型乙酰膽堿受體影響SHR的自主活動。因此，對SHR的自主活動觀察，也有利于進一步對神經系統(tǒng)功能藥物的研究。

目前，對于大鼠呼吸、體溫和自主活動等生理數據的背景資料研究不多，更需要做好該方面的工作，特別是在如圍手術期及其護理、代謝疾病、肝腎功能，以及腫瘤等重大疾病的預防方面尤為重要，因此值得進一步深入研究。

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Monitoring of Respiration,Body Temperature and Autonomic Activity in SHR by Implantable Telemetry

LING Yun,FANG Mingsun,JIN Lu,et al Laboratory Animal Research Center Zhejiang Chinese Medical University Hangzhou(310053)

[Objective]To observe dynamic changes,sex differences and the circadian fluctuation of respiratory rate,body temperature and autonomic activity rate in unrestrained spontaneously hypertensive rat(SHR)by implantable telemetry.[Methods]Sixteen SPF grade SHR,half male and half female,were implanted with C50-PXT implantation,and experiment was started after the recovery of 7d.Respiratory rate,body temperature and autonomic activity rate were respectively monitored for 24h continuously using telemetry system when SHR were 3,5,7 months old.[Results]The mean frequency of respiration,body temperature and autonomic activity of SHR at night stage were significantly higher than day stage(P＜0.05).The average respiratory rate of night and day were(85.16±5.84)times/min and(78.66±5.67)times/min,respectively.There were two peaks of respiratory rate at 8:00 PM and 1:00 AM,(94.20±3.21)times/min and(93.06±4.11)times/min,respectively;and there was a low valley between 2:00 PM～3:00 PM,(71.21±2.37)times/min.The average body temperature at night and day were(37.69±0.44)degrees and(37.18±0.39)degrees,respectively.There were two peaks of body temperature between 9:00 PM～10:00 PM and 1:00 AM～2:00 AM(38.09±0.31)degrees and (38.11±0.33)degrees,respectively;and a valley period between 2:30 PM～3:30 PM,(36.72±0.21)degrees.During day stage,activity rate of SHR changed significantly,two peaks appeared at 6:30 AM and 8:00 AM,respectively(47.43±5.42)time/min and (50.74±4.79)time/min.SHR respiratory rate decreased as age increased.Male SHR body temperature rose as age increased,while female SHR was opposite.Male SHR autonomic activities rate had no obvious change as age increased;but female SHR activity rate significantly increased with the age (P＜0.05).[Conclusion]Three-month-old SHR showed circadian rhythm changes of respiratory rate,body temperature and autonomic activity rate.The average respiratory rate,temperature and activity rate of night stage were higher than that of the day stage.The respiratory,body temperature and autonomic activities of 3,5 and 7 month old SHR were related in varying degrees with their age and sex.Respiratory rate decreased gradually as age increased,but the difference between the sexes was not significant;with the increase of the age of month,the temperature of male and female SHR increased and decreased,respectively;female autonomic activity increased significantly with age,while males did not change significantly.

telemetry technology;SHR;respiratory rate;body temperature;autonomic activity rate;circadian rhythm;months of age;sex

R331

A

1005-5509（2017）11-0895-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.11.013

浙江省公益性技術應用研究計劃（2011C37076）

Fund project:Zhejiang Public Welfare Technology Application Research Project(2011C37076)

壽旗揚，E-mail:sqy133＠126.com

2017-05-24）