王靜歡，劉 珂，萬(wàn) 東，?；埒P

(1. 西南大學(xué)藥學(xué)院暨中醫(yī)藥學(xué)院中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715; 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科&重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400016)

衰老又稱老化，分為生理性衰老與病理性衰老兩類。生理學(xué)衰老是生物體自成熟期開(kāi)始，隨增齡發(fā)生的漸進(jìn)的、受遺傳因素影響的、全身復(fù)雜的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理功能不可逆的退行性變化。衰老是人類生命進(jìn)程的重要環(huán)節(jié)，常伴隨著一些疾病的發(fā)生，如糖尿病、阿爾茨海默癥、冠心病等。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、增殖和存活。PI3K、Akt和mTOR是這一途徑的關(guān)鍵點(diǎn)[1]。PI3K活化后激活A(yù)kt，進(jìn)一步激活mTOR。mTOR有2個(gè)亞型，即mTORC1和mTORC2。Akt激活的是mTORC1。mTORC1下游的直接底物為核糖體S6激酶1(S6K1)和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)；S6K1再進(jìn)一步使核糖體蛋白S6磷酸化，最終啟動(dòng)cap-依賴性蛋白翻譯(蛋白合成的限速步驟)，實(shí)現(xiàn)蛋白合成、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程的中心控制。處于生長(zhǎng)狀態(tài)的神經(jīng)元需要合成大量新的蛋白質(zhì)，胞內(nèi)磷酸化核糖體蛋白S6(p-S6)的表達(dá)水平會(huì)明顯上調(diào)。因此，p-S6表達(dá)水平可間接表征mTOR活性，并常作為神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)的分子標(biāo)志[2]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，p-S6蛋白表達(dá)減少，內(nèi)在活性降低，軸突再生能力下降[3]，提示衰老與細(xì)胞表達(dá)p-S6減少相關(guān)。

地黃作為滋陰補(bǔ)腎中藥，在臨床治療老年性疾病中占有重要地位。以地黃為君藥的復(fù)方在發(fā)育、衰老以及老年性疾病的治療中應(yīng)用歷史也十分久遠(yuǎn)，如六味地黃丸是《小兒藥證直訣》方，金匱腎氣丸是《金匱要略》方，單味地黃抗衰老的實(shí)驗(yàn)研究已有較多報(bào)道[4-5]。梓醇(catalpol)是地黃最主要的有效成分之一，具有利尿、緩瀉、降血糖、保肝等多種藥理作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，梓醇對(duì)老年性疾病，如帕金森、腦卒中、糖尿病、老年性癡呆等有明顯的治療作用。梓醇可以促進(jìn)離體大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)，上調(diào)軸突生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(growth associated protein-43，GAP-43)表達(dá)，有效促進(jìn)腦卒中后的神經(jīng)修復(fù)[7-8]，提示梓醇對(duì)病理性衰老有治療作用。但衰老還存在生理性衰老形式，梓醇對(duì)生理性衰老是否具有抗衰老作用，是否可以延緩正常神經(jīng)元衰老，延遲其死亡等問(wèn)題，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究旨在觀察梓醇是否延緩正常離體皮質(zhì)神經(jīng)元衰老作用，并探討其可能的機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為研發(fā)新的延緩衰老的天然藥物或保健活性物質(zhì)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD大鼠，體質(zhì)量(250±30)g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證批號(hào)：SCXK(渝)2007-2001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后合籠，讓其進(jìn)行自然交配。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理有關(guān)規(guī)定，善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2藥品與試劑梓醇(石家莊流波百鳥(niǎo)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20091091015，純度>98%)；B27、Neurobasal-A神經(jīng)元培養(yǎng)基(Gibco)；Pen-strep、0.25%胰蛋白酶(Genview)；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (Hyclone)；胎牛血清(杭州四季青生物公司)；p-S6兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology)；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 IgG(H+L)、兔多克隆抗體Map-2、GAP-43、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR，均購(gòu)自Proteintech。

1.3儀器生物安全柜(Haier)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(ESCO)；倒置顯微鏡(奧林巴斯)；酶標(biāo)儀(Bioteck)；PCR儀(Eppendorf)；低溫冷凍離心機(jī)(Thermo)；倒置熒光顯微鏡(Leica)；化學(xué)發(fā)光成像儀(Tanon)。

2 方法

2.1皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[9]并做改進(jìn)，無(wú)菌條件下取出生后24 h內(nèi)的乳鼠大腦皮質(zhì)，剪去胼胝體和其他白質(zhì)，PBS液清洗2遍，剪碎，離心，1 000 r·min-1× 8 min。0.25%胰酶溶液37℃消化10 min，每5 min振搖1次，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化10 min，每5 min振搖1次，過(guò)200目篩網(wǎng)。取濾液，離心，1 000 r·min-1× 5 min，棄上清，加含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打均勻，計(jì)數(shù)，以1.4×108·L-1或者5×108·L-1的細(xì)胞密度接種在提前包被過(guò)L-多聚賴氨酸的96孔板和6孔板上。置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，換為Neurobasal-A(含2% B27)無(wú)血清培養(yǎng)基，每隔2 d半量換液。d 7的神經(jīng)元可用于實(shí)驗(yàn)。

2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)至d 6，進(jìn)行分組并作相應(yīng)藥物干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分為：正常組、梓醇低(0.1 mg·L-1)、中(1 mg·L-1)、高(10 mg·L-1)劑量組。正常組不用任何藥物處理，僅用Neurobasal-A培養(yǎng)基培養(yǎng)；梓醇組用Neurobasal-A培養(yǎng)基稀釋至低、中、高劑量的梓醇進(jìn)行干預(yù)。每組重復(fù)3次。

2.3顯微鏡觀察神經(jīng)元接種后，分別于培養(yǎng)的7～13 d在倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。每組各孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野，進(jìn)行拍照記錄。

2.4細(xì)胞活力檢測(cè)以96孔板每孔103～104個(gè)細(xì)胞種板，培養(yǎng)至6 d后，加入不同濃度梓醇進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)時(shí)間分別為1～6 d(即細(xì)胞培養(yǎng)d 7～13)。之后，每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基后，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min。將96孔板置于酶標(biāo)儀上，490 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各孔吸光度(A)。

2.5細(xì)胞內(nèi)在活性檢測(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)至13 d后，棄培養(yǎng)液，用0.02 mol·L-1PBS洗5 min×3次，加入4%多聚甲醛4℃固定15 min后，用p-S6兔單克隆抗體免疫熒光染色檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)在活性。陰性對(duì)照用0.02 mol·L-1PBS代替一抗，其余步驟同上。熒光顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光。在200倍鏡下，分別計(jì)數(shù)3個(gè)孔各5個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

2.6軸突生長(zhǎng)檢測(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)至13 d后，棄培養(yǎng)液，用0.02 mol·L-1PBS洗5 min×3次，加入4%多聚甲醛4℃固定15 min后，用Map-2兔多克隆抗體免疫熒光染色檢測(cè)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)情況。陰性對(duì)照用0.02 mol·L-1PBS代替一抗，其余步驟同上。鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)呈綠色熒光。在200倍鏡下每組各孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野，所測(cè)細(xì)胞必須有暈光和突起，每個(gè)視野測(cè)量20個(gè)神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度，取其平均值為該組軸突生長(zhǎng)長(zhǎng)度。

2.7蛋白免疫印跡將細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞密度為5×108·L-1，每孔2 mL。待細(xì)胞培養(yǎng)至d 6，給予藥物干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)至d 13后，除去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞。每孔加100 μL RIPA裂解液裂解細(xì)胞。利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。電泳，轉(zhuǎn)膜，切膜，免疫印跡(GAP-43、p-S6、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR抗體稀釋度均為1 ∶1000，PI3K、Akt、mTOR抗體稀釋度均為1 ∶500)。將顯色后的膜照相，并用Multi-Gaμge軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析，以灰度值代表蛋白的強(qiáng)度，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白(GAPDH、β-tubulin)的灰度比值作為目的蛋白表達(dá)的相對(duì)量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

3 結(jié)果

3.1梓醇可促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元存活，提高其細(xì)胞活力皮質(zhì)神經(jīng)元在培養(yǎng)至d 7時(shí)，胞體光暈明顯，突起增多，伸長(zhǎng)且分支很多，形成致密細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)；培養(yǎng)至d 8時(shí)，絕大多數(shù)神經(jīng)元僅可見(jiàn)1根較長(zhǎng)的軸突，少部分神經(jīng)元突起有分支，部分細(xì)胞突起交織成網(wǎng)；培養(yǎng)至d 9時(shí)，細(xì)胞突起構(gòu)成的網(wǎng)狀增多；從d 10開(kāi)始，神經(jīng)元數(shù)目開(kāi)始減少，突起開(kāi)始萎縮；至d 13時(shí)，只剩下胞體。由此可以推斷，皮質(zhì)神經(jīng)元在培養(yǎng)7～9 d時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)最佳，處于旺盛期；在培養(yǎng)10～13 d時(shí)，細(xì)胞數(shù)目開(kāi)始減少，細(xì)胞開(kāi)始衰老、死亡，處于衰老期。梓醇干預(yù)各組(0.1、1、10 mg·L-1)神經(jīng)元生長(zhǎng)趨勢(shì)與時(shí)間點(diǎn)的關(guān)系與正常組一致，但是正常組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，梓醇干預(yù)各組細(xì)胞暈光明顯，軸突較正常組更粗，更長(zhǎng)；梓醇各組神經(jīng)元細(xì)胞突起多，神經(jīng)元之間的網(wǎng)狀聯(lián)系均比正常組各對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)更加豐富。培養(yǎng)至10～13 d時(shí)，梓醇干預(yù)各組神經(jīng)元數(shù)目減少速度較正常組慢，d 13時(shí)，仍有部分神經(jīng)元有軸突存在，而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，正常組神經(jīng)元數(shù)目逐漸減少，突起逐漸萎縮，至d 13時(shí)，只剩下胞體(Fig 1)。提示不同濃度梓醇均可減少神經(jīng)元細(xì)胞死亡，延緩衰老，維持神經(jīng)元較長(zhǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)狀態(tài)。

Fig 1 Morphological observation of cortical neurons in different time points in each group(×100)

Tab 1的MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組神經(jīng)元細(xì)胞活力先升高，后降低。d 7～9，MTT值升高，與形態(tài)學(xué)觀察所見(jiàn)細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)增強(qiáng)一致；d 10～13，MTT值逐漸降低，與形態(tài)學(xué)觀察所見(jiàn)細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)減弱一致。梓醇各劑量組均明顯高于正常組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的MTT吸光度值(P<0.05)，而且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，在d 10之后尤其明顯。提示不同濃度的梓醇可以提高神經(jīng)元細(xì)胞活力，延緩其衰老，延遲其細(xì)胞死亡的時(shí)間。據(jù)Fig 1、Tab 1的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)研究選擇衰老后期的d 13進(jìn)行相關(guān)形態(tài)及機(jī)制的探討。

3.2梓醇可升高p-S6陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，促進(jìn)p-S6蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞活性如Fig 2所示，藥物干預(yù)6 d(細(xì)胞培養(yǎng)至13 d)后，梓醇各組p-S6陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較正常組均增多(P<0.05)，其中梓醇1 mg·L-1劑量組增多最明顯。與正常組相比，梓醇1 mg·L-1劑量組可明顯促進(jìn)p-S6蛋白表達(dá)(P<0.05)；而梓醇0.1、10 mg·L-1劑量組則無(wú)明顯變化。提示不同濃度的梓醇可在神經(jīng)元處于衰老期時(shí)誘導(dǎo)其細(xì)胞內(nèi)在活性，延緩細(xì)胞衰老。

Fig 2 Catalpol increased number of p-S6 positive cells, promote p-S6 protein expression and induce cortical neuronal cell activity

Tab 1 Effects of catalpol at different doses on neuronal cell viability(A490,±s, n=6 )

*P<0.05vscontrol

3.3梓醇可促進(jìn)GAP-43蛋白表達(dá)，促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元軸突延伸如Fig 3所示，給藥6 d(細(xì)胞培養(yǎng)至13 d)后，正常組神經(jīng)元軸突萎縮，軸突長(zhǎng)度驟減，梓醇給藥各組神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度均比正常組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。梓醇各組間比較，濃度為1 mg·L-1時(shí)對(duì)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)促進(jìn)作用最強(qiáng)。與正常組相比，梓醇10 mg·L-1劑量組可明顯促進(jìn)GAP-43蛋白表達(dá)(P<0.05)。提示不同濃度梓醇可明顯促進(jìn)神經(jīng)元軸突延伸。

3.4梓醇對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元的抗衰老作用與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)如Fig 4所示，各組內(nèi)參蛋白GAPDH和β-tubulin的表達(dá)差異無(wú)顯著性。給藥6 d(細(xì)胞培養(yǎng)至13 d)后，與正常組相比，梓醇1、10 mg·L-1組可明顯促進(jìn)p-PI3K/t-PI3K、p-Akt/t-Akt蛋白表達(dá)(P<0.05)；梓醇各組p-mTOR/t-mTOR蛋白表達(dá)隨著梓醇濃度的升高先增加后降低，但其表達(dá)均明顯高于正常組(P<0.05)。

4 討論

地黃是滋陰補(bǔ)血、填精補(bǔ)髓的代表中藥，本研究觀察了地黃的主要活性成分梓醇對(duì)離體培養(yǎng)的新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的抗衰老作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)至7～9 d，細(xì)胞狀態(tài)最佳，處于旺盛期；在培養(yǎng)至10～13 d時(shí)，細(xì)胞數(shù)目開(kāi)始減少，細(xì)胞開(kāi)始衰老、死亡，處于衰老期。我們的結(jié)果與其他研究一致[10-11]。皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)至d 7時(shí)，細(xì)胞極性狀態(tài)最佳，適合觀測(cè)和研究樹(shù)突與軸突的生長(zhǎng)機(jī)制。而培養(yǎng)至13 d左右，細(xì)胞萎縮，處于衰老、死亡的邊緣。本實(shí)驗(yàn)主要目的是觀測(cè)梓醇對(duì)抗神經(jīng)元衰老的作用和機(jī)制，故后期實(shí)驗(yàn)中衰老期的d 13進(jìn)行機(jī)制的探討。

本研究發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的正常組比較，梓醇終濃度在0.1～10 mg·L-1時(shí)可明顯增加MTT吸光度值，促進(jìn)神經(jīng)元存活；從形態(tài)上看，梓醇低、中、高劑量組神經(jīng)元數(shù)量多，光暈明顯，軸突較長(zhǎng)，神經(jīng)元突起形成的網(wǎng)狀聯(lián)系豐富；而且更明顯的是，不同濃度的梓醇組，在細(xì)胞培養(yǎng)d 10～13時(shí)，細(xì)胞活力均明顯高于正常組(P<0.05)。提示不同濃度的梓醇在細(xì)胞衰老期時(shí)可延緩神經(jīng)元衰老，維持細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞活力。

Fig 3 Catalpol promoted GAP-43 protein expression and delayed cortical neuron axonal atrophy

Fig 4 Effect of catalpol on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway related proteins in cortical neurons(±s, n=3 )

A-C: Effects of each group on expressions of t-PI3K, p-PI3K, t-Akt, p-Akt, t-mTOR, p-mTOR protein; D: Analysis of expressions of p-PI3K/t-PI3K, p-Akt/t-Akt, p-mTOR/t-mTOR protein in each group.*P<0.05vscontrol group.

研究表明[12]，人在20～90歲神經(jīng)元數(shù)量的減少不會(huì)超過(guò)10%或20%。大腦功能更多取決于神經(jīng)元聯(lián)系的質(zhì)量，而不是神經(jīng)元的數(shù)量。因此，與衰老有關(guān)的神經(jīng)功能障礙是神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)連接質(zhì)量下降的結(jié)果。細(xì)胞內(nèi)在生長(zhǎng)活性的提高與神經(jīng)元聯(lián)系的質(zhì)量、大腦功能具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)度。因此，本研究選擇p-S6染色來(lái)表征細(xì)胞內(nèi)在活性，GAP-43染色來(lái)表征神經(jīng)元內(nèi)在聯(lián)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至13 d后，梓醇各組p-S6陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較正常組均增多，其中梓醇1 mg·L-1劑量組增多最明顯。同時(shí)，梓醇能夠增加神經(jīng)元突起的長(zhǎng)度，神經(jīng)元之間的聯(lián)系明顯比正常組豐富，其變化趨勢(shì)同p-S6染色結(jié)果一致，提示梓醇對(duì)神經(jīng)元內(nèi)在活性的調(diào)節(jié)與促進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)在聯(lián)系有關(guān)，梓醇可能通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)在活性，提升神經(jīng)元內(nèi)在聯(lián)系，來(lái)延緩神經(jīng)元衰老。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活和分化[13]。本研究采用Western blot法檢測(cè)了PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵磷酸化蛋白，以探討梓醇延緩離體培養(yǎng)的神經(jīng)元衰老，維持較長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞活力的可能機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，給藥6 d(細(xì)胞培養(yǎng)至13 d)后，與正常組相比，梓醇各組p-PI3K/t-PI3K和p-Akt/t-Akt比值隨著梓醇濃度的升高而增加，呈現(xiàn)出濃度依賴性，且梓醇(1、10 mg·L-1)組差異具有顯著性(P<0.05)；而p-mTOR/t-mTOR比值與梓醇濃度的關(guān)系與磷酸化S6蛋白變化一致，均是先升高后降低。梓醇(0.1、1、10 mg·L-1)組p-S6蛋白表達(dá)先升高后降低；但與正常組相比，僅梓醇(1 mg·L-1)組差異具有顯著性(P<0.05)。梓醇(10 mg·L-1)組可明顯促進(jìn)GAP-43蛋白表達(dá)。提示在細(xì)胞衰老期，GAP-43蛋白表達(dá)受PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)控。PI3K蛋白活化，Akt被磷酸化激活，mTOR被進(jìn)一步磷酸化激活，從而促進(jìn)磷酸化S6蛋白和GAP-43蛋白表達(dá)，減緩軸突萎縮，增加突起，豐富神經(jīng)元之間的聯(lián)系，延緩神經(jīng)細(xì)胞衰老。

總之，本研究結(jié)果證實(shí)了梓醇具有誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)在活性，提高神經(jīng)元細(xì)胞活力，延緩軸突萎縮，豐富神經(jīng)元之間的聯(lián)系，延緩神經(jīng)元衰老的潛能。其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。提示梓醇對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)再生和抗衰老可能有潛在的治療價(jià)值。

(致謝：本研究在西南大學(xué)藥學(xué)院中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝各位老師和同學(xué)對(duì)本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)、幫助。)

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