張東波 張 敏 于成功#

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科1(210008) 南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院中西醫(yī)結合系2

·論 著·

Faecalibacteriumprausnitzii上清液通過調節(jié)單核巨噬細胞減輕DSS誘導的小鼠結腸炎*

張東波1張 敏2于成功1#

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科1(210008)南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院中西醫(yī)結合系2

Faecalibacteriumprausnitzii； 炎癥性腸??； 單核細胞； 巨噬細胞； 細胞因子類

炎癥性腸病(IBD)是一類非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。研究發(fā)現，IBD患者結腸炎癥部位存在大量活化的免疫細胞，如T細胞、B細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)、單核-巨噬細胞，其中單核-巨噬細胞在腸道微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。單核細胞隨血液循環(huán)進入組織后可轉化為巨噬細胞，其中LY6Chigh單核細胞在炎癥微環(huán)境中具有一定促炎作用[1]。巨噬細胞按激活途徑不同可分為經典通路激活的M1型和非經典通路激活的M2型。M1型巨噬細胞分泌促炎因子造成組織損傷，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、白細胞介素(IL)-12和膜蛋白CD16/32可用于鑒定M1型巨噬細胞；M2型巨噬細胞分泌抗炎因子并促進組織修復，Arg-1、CD206、DECTIN-1是鑒定M2型巨噬細胞較為理想的表型標記[2]。

Faecalibacteriumprausnitzii(Fp)是新近發(fā)現的一種厭氧性腸道共生菌，在IBD患者中特異性減少。本課題組前期研究[3]發(fā)現Fp及其培養(yǎng)上清液對大鼠實驗性結腸炎具有保護作用，且含細菌代謝產物上清液的抗炎效應明顯優(yōu)于細菌本身。本研究應用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導小鼠結腸炎模型，選擇CD16/32作為M1型巨噬細胞表面標記，CD206作為M2型巨噬細胞表面標記，觀察Fp上清液對單核-巨噬細胞和結腸炎癥的影響，以期為Fp上清液用于IBD的治療提供實驗依據。

材料與方法

一、實驗動物、菌株和主要試劑

雄性清潔級C57BL/6J小鼠30只，6～8周齡，體質量18～21 g，由南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于該中心SPF級動物實驗室中，實驗開始前至少適應性飼養(yǎng)1周。

Fp(ATCC27766，美國模式菌種保藏中心)；DSS(上海西寶生物科技有限公司)；腦心浸液、固定/破膜試劑盒(美國BD公司)；酵母提取液(英國Oxoid公司)；血晶質、纖維二糖、L-半胱氨酸(美國Sigma公司)；麥芽糖(美國Amresco公司)；紅細胞裂解液(德國Miltenyi公司)；FITC標記抗小鼠CD11b抗體、PE標記抗小鼠F4/80抗體、PerCp/Cy5.5標記抗小鼠CD16/32抗體、APC標記抗小鼠LY6C抗體、APC/CY7標記抗小鼠CD45抗體、APC標記抗小鼠CD206抗體、多因子流式檢測試劑盒(美國BioLegend公司)。

二、方法

1. Fp上清液制備：在厭氧箱中將Fp活菌接種至高溫滅菌LYHBHI培養(yǎng)基[腦心浸液(37 g/L)、酵母提取液(5 g/L)、血晶質(5 mg/L)]與纖維二糖(1 g/L)、麥芽糖(1 g/L)、L-半胱氨酸(1 g/L)混合配制的溶液中，37 ℃培養(yǎng)48 h。分光光度計測定活菌數達1×108CFU/mL后，新鮮Fp菌液離心取上清液凍干成凍干粉，-80 ℃保存。使用時取出凍干粉溶解于1/5原液體積的去離子水中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 動物分組和結腸炎模型建立：30只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為對照組、炎癥組和Fp治療組，每組10只，稱重并編號。實驗第1～7 d，對照組小鼠自由飲用蒸餾水，炎癥組和Fp治療組小鼠自由飲用含4.5% DSS的蒸餾水以建立結腸炎模型；Fp治療組小鼠每天以0.01 mL/g濃縮Fp上清液灌胃一次。所有小鼠均自由進食普通飼料。觀察實驗過程中小鼠飲食、活動、排便情況和體質量變化。

3. 標本獲取和處理：實驗第8 d，以頸椎脫臼法處死小鼠，取外周血、脾臟和結腸組織，測量結腸長度(肛門至回盲部)。

眼球取血，離心提取血清，-80 ℃保存，用于多因子流式檢測。

取小鼠脾臟，置于0.9% NaCl溶液中，研磨組織并以200目濾網過濾組織懸液，以紅細胞裂解液裂解紅細胞，300×g離心5 min，PBS洗滌1次，重懸后計數細胞，取1×105個細胞行流式檢測。

取小鼠結腸，PBS充分沖洗2次，剪成大小約0.5 cm×0.5 cm的片狀，置于含1 mmol/L DTT、1 mmol/L EDTA、1%雙抗(青霉素+鏈霉素)、5%胎牛血清的PBS中。37 ℃水浴搖床輕微振蕩20 min，去除上皮組織和黏液，重復此步驟2次。處理后的組織呈半透明片狀結構，充分剪碎后置于1 mg/mL膠原酶Ⅳ溶液中，37 ℃水浴搖床輕微振蕩消化40～60 min；組織懸液以400目濾網過濾，300×g離心10 min；以含l%雙抗、5%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，得到的細胞懸液先后以40%和80% Percoll細胞分離液進行密度梯度離心(800×g, 20 ℃, 20 min)，獲取中間層腸黏膜固有層淋巴細胞，取1×104個細胞行流式檢測。

4. 結腸組織病理學評分：取結腸病變顯著部位，4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，行HE染色。參照Dutra等[4]采用的標準行病理學評分：0分，黏膜結構正常，無炎癥；1分，黏膜結構稍不規(guī)則，極少量白細胞浸潤；2分，黏膜結構不規(guī)則，少量白細胞浸潤；3分，黏膜結構紊亂，大量白細胞浸潤，血管密度高，腸壁增厚；4分，黏膜結構紊亂，白細胞透壁浸潤，杯狀細胞減少，血管密度高，腸壁增厚。

5. 流式細胞術檢測單核細胞、巨噬細胞和M1/M2型巨噬細胞：取細胞加入表面抗體FITC-CD11b、PE-F4/80、PerCp/Cy5.5-CD16/32、APC-LY6C、APC/CY7-CD45，常溫避光孵育20 min，PBS洗去多余抗體；加入固定/破膜劑300 μL，4 ℃避光孵育20 min；加入固定/破膜緩沖液2 mL，洗滌2次；加入APC-CD206抗體，4 ℃避光孵育30 min；加入固定/破膜緩沖液1 mL，洗滌1次；以200 μL PBS重懸后上流式細胞儀檢測。單核細胞、巨噬細胞、M1型和M2型巨噬細胞表面標記分別為CD11b和LY6C、CD11b和F4/80、CD16/32、CD206。

6. 多因子流式檢測：重懸、梯度稀釋標準品，將待測血清樣本稀釋至標準品濃度范圍內。確定待測樣本數量，混合待測細胞因子捕獲微球(每種10 μL)，混合前充分渦旋3～5 s以確保準確吸取等量微球?；旌弦?00×g離心5 min，棄上清，加入緩沖液重懸沉淀，室溫避光孵育30 min。以微球混合液將血清樣本稀釋4倍后上流式細胞儀檢測。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、一般情況和結腸組織病理學變化

實驗第3 d，炎癥組小鼠出現體質量下降、稀便、少量血便，Fp治療組出現體質量下降和稀便，未見血便；實驗第7 d，炎癥組小鼠出現大量血便，停止進食，毛發(fā)枯萎，拱背、扎堆，Fp治療組出現少量血便，進水、進食減少，毛發(fā)略枯萎，活動量減少。

與對照組相比，炎癥組和Fp治療組小鼠體質量明顯下降，結腸長度縮短，病理學評分增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，炎癥組上述改變較Fp治療組更為嚴重(P<0.05)(圖1、表1)。

A：炎癥組；B：Fp治療組

組別例數體質量下降值(g)結腸長度(cm)病理學評分對照組10-4.1±0.2**6.89±0.39**0.80±0.42*炎癥組104.2±0.5**4.22±0.53**3.50±0.53*Fp治療組101.9±0.34.65±0.342.70±0.52

與Fp治療組比較，*P<0.05,**P<0.01

二、脾臟和結腸組織單核細胞變化

1. 脾臟：炎癥組CD11b+LY6C+單核細胞(總單核細胞)、CD11b+LY6Chigh促炎單核細胞百分率均顯著高于對照組和Fp治療組(P<0.05)(圖2A、2B)，表達巨噬細胞標記的CD11b+LY6C+F4/80+單核細胞百分率則顯著低于對照組和Fp治療組(P<0.05)(圖2C)。

2. 結腸固有層：炎癥組總單核細胞、促炎單核細胞百分率均顯著高于對照組和Fp治療組(P<0.05)(圖2D、2E)，F4/80+單核細胞百分率顯著高于對照組(P<0.05)，與Fp治療組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2F)；Fp治療組總單核細胞、F4/80+單核細胞百分率亦顯著高于對照組(P<0.05)(圖2D、2F)。

三、脾臟和結腸組織巨噬細胞變化

1. 脾臟：炎癥組CD11bhighF4/80mid巨噬細胞、CD11b-F4/80high巨噬細胞百分率均顯著低于對照組和Fp治療組(P<0.05)(圖3A、3B)，Fp治療組CD11b-F4/80high巨噬細胞百分率亦顯著低于對照組(P<0.05)(圖3B)；炎癥組M1型巨噬細胞百分率顯著高于對照組和Fp治療組(P<0.05)(圖3C)，三組間M2型巨噬細胞百分率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3D)。

2. 結腸固有層：炎癥組CD11bhighF4/80mid巨噬細胞百分率顯著高于對照組和Fp治療組(P<0.05)(圖3E)，CD11b-F4/80high巨噬細胞百分率顯著低于對照組和Fp治療組(P<0.05)(圖3F)，Fp治療組CD11bhighF4/80mid巨噬細胞百分率亦顯著高于對照組(P<0.05)(圖3E)；炎癥組M1型巨噬細胞百分率顯著高于對照組和Fp治療組(P<0.05)(圖3G)，M2型巨噬細胞百分率顯著低于對照組和Fp治療組(P<0.05)(圖3H)，Fp治療組M1、M2型巨噬細胞百分率均顯著高于對照組(P<0.05)(圖3G、3H)。

四、外周血細胞因子水平

多因子流式檢測顯示，Fp治療組外周血IL-10、IL-4水平顯著高于炎癥組(P<0.05)，炎癥組IL-6、干擾素(IFN)-γ、趨化因子CCL2水平顯著高于對照組和Fp治療組(P<0.05)(表2)。

討 論

IBD的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，腸道菌群失衡和免疫功能失調是IBD發(fā)病的主要原因[5]。

兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

組別例數IL-10(pg/mL)IL-6(pg/mL)IL-4(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)CCL2(pg/mL)對照組10700±20***130±560±3**120±8*70±4炎癥組10500±25***370±16***10±1*280±14**210±6**Fp治療組101300±30140±836±2200±13100±5

與Fp治療組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

既往研究[3,6]發(fā)現Fp上清液可通過調節(jié)免疫炎癥因子表達，減輕動物模型的腸道炎癥。巨噬細胞是一種抗原呈遞細胞，在炎癥反應中具有促炎和抗炎的雙重作用。本研究結果提示Fp上清液可減少促炎單核細胞數量，并參與調控單核細胞分化為巨噬細胞以及巨噬細胞極性改變等過程，從而減輕小鼠腸道炎癥。

單核-巨噬細胞系統(tǒng)在維持組織穩(wěn)態(tài)和免疫系統(tǒng)平衡中起有重要作用[7]。單核細胞通過血液循環(huán)抵達炎癥部位，轉化為巨噬細胞并參與炎癥反應。CD11b+LY6C+單核細胞主要包括CD11b+LY6Chigh促炎單核細胞和CD11b+LY6Clow單核細胞兩種類型，前者被招募至炎癥部位后，逐漸轉化為巨噬細胞，并在炎癥微環(huán)境中上調TLR2、NOD2表達，分泌IL-26、IL-23等促炎細胞因子[1,8]。本研究中Fp治療組小鼠脾臟和結腸固有層總單核細胞和促炎單核細胞百分率均顯著低于炎癥組。部分單核細胞表達巨噬細胞標記F4/80，提示炎癥過程中有部分巨噬細胞來源于單核細胞[7,9]。本研究中Fp治療組小鼠脾臟F4/80+單核細胞百分率顯著高于炎癥組，結腸固有層中兩組間差異卻無統(tǒng)計學意義，考慮與樣本量較小有關。綜上，本研究證實炎癥過程中單核細胞數量大量增多，以促炎單核細胞增多為主；單核細胞在轉化為促炎單核細胞的過程中同時向巨噬細胞轉化[10]，Fp上清液干預可減少單核細胞總數和促炎單核細胞數量，并促進單核細胞向巨噬細胞轉化。

巨噬細胞在小鼠不同組織部位的表面標記不同，如在大腦中其表面標記為CD11b，在肺臟中為CD11b和CD11c，在脾臟和腸道固有層為CD11b和F4/80[11]。巨噬細胞一般可分為CD11b-F4/80high和CD11bhighF4/80mid兩個亞群[7]，前者起源于胚胎前體細胞，定居于組織中，后者主要來源于造血干細胞，由遷移至炎癥部位的單核細胞轉化而來，可參與炎癥反應[10]。本研究結果顯示炎癥組小鼠CD11bhighF4/80mid巨噬細胞百分率在脾臟中顯著降低，在腸道固有層則顯著增高，可能是脾臟巨噬細胞在炎癥過程中迅速遷移至結腸炎癥部位參與炎癥反應所致。此外，炎癥組小鼠脾臟和結腸固有層CD11b-F4/80high巨噬細胞百分率均顯著降低，考慮與其在炎癥反應中被消耗且由單核細胞再次補充延遲有關。

巨噬細胞可分為M1和M2兩種類型[12]，前者在體外可由IFN-γ和脂多糖(LPS)刺激分化形成，分泌IL-12、IL-6、IL-23、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β等促炎細胞因子促進炎癥反應；后者在體外主要由IL-4、IL-13刺激分化形成，分泌IL-10等抗炎細胞因子減輕炎癥反應[13-15]。本研究發(fā)現炎癥組小鼠脾臟和結腸固有層M1型巨噬細胞百分率均顯著增高，Fp治療組結腸固有層M2型巨噬細胞百分率顯著增高，各組間脾臟M2型巨噬細胞百分率差異無統(tǒng)計學意義，提示巨噬細胞主要在炎癥部位發(fā)生極化，Fp上清液可促進M2型巨噬細胞極化，進而減輕腸道炎癥反應。

Fizz1在巨噬細胞的炎癥修復功能中發(fā)揮重要作用，可作為M2型巨噬細胞的表面標記[16]。炎癥過程中Th1/Th2細胞比例失衡：Th1細胞增生并分泌IFN-γ，進而下調Fizz1 mRNA表達；Th2細胞可分泌IL-4、IL-13，上調Fizz1 mRNA表達，促進巨噬細胞向M2型極化，參與炎癥修復，清除壞死組織。本研究發(fā)現Fp治療組小鼠外周血IFN-γ水平顯著低于炎癥組，IL-4水平顯著高于炎癥組，表明Fp上清液可通過促進IL-4分泌和抑制IFN-γ分泌誘導M2型巨噬細胞極化，減少M1型極化。

IL-6可由M1型巨噬細胞分泌，黏膜局部IL-6水平可反映IBD疾病活動性[17]。IL-10作為一種抗炎細胞因子，具有維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)的作用，可抑制巨噬細胞分泌IL-1、TNF-α、IL-6、IL-8等，并可減少IL-2、IFN-γ產生，抑制T細胞增殖以及細胞毒性反應[18]。趨化因子CCL2主要由促炎單核細胞分泌，可招募包括單核細胞在內的多種炎癥細胞至炎癥部位參與炎癥反應，清除外來病原微生物，促進機體組織損傷修復[19]，CCL2及其受體CCR2基因敲除小鼠炎癥部位單核細胞聚集明顯減少[20]。本研究顯示Fp治療組小鼠外周血IL-6、CCL2水平顯著低于炎癥組，IL-10水平顯著高于炎癥組，表明Fp上清液可通過下調促炎細胞因子分泌、促進抗炎細胞因子分泌以及抑制炎癥細胞趨化至炎癥部位而減輕腸道炎癥反應。

綜上所述，Fp上清液可通過減少促炎單核細胞數量、誘導腸道炎癥部位巨噬細胞向M2型極化以及促進抗炎細胞因子分泌、抑制促炎細胞因子和趨化因子分泌等途徑在小鼠結腸炎中發(fā)揮抗炎作用。本研究為臨床應用Fp上清液預防和治療IBD提供了理論依據，但其有效性和安全性仍需大樣本臨床研究加以驗證。

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(2017-05-03收稿；2017-07-10修回)

FaecalibacteriumprausnitziiSupernatantAmelioratesDSS-inducedColitisinMiceviaRegulatingMonocytesandMacrophages

ZHANGDongbo1,ZHANGMin2,YUChenggong1.

1DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing(210008);2DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,theFirstClinicalMedicalCollege,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing

YU Chenggong, Email: chenggong_yu@nju.edu.cn

Faecalibacteriumprausnitzii; Inflammatory Bowel Disease; Monocytes; Macrophages; Cytokines

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.11.002

國家自然科學基金(81470819)

#本文通信作者，Email: chenggong_yu@nju.edu.cn

背景：Faecalibacteriumprausnitzii(Fp)數量在炎癥性腸病(IBD)患者中特異性減少，既往研究顯示Fp上清液在實驗性結腸炎中具有明顯抗炎效應。目的探討Fp上清液對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠結腸炎模型單核-巨噬細胞和結腸炎癥的影響。方法30只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為對照組、炎癥組和Fp治療組，后兩組連續(xù)7 d飲用含4.5% DSS的蒸餾水以建立結腸炎模型，Fp治療組在造模同時予Fp上清液灌胃。觀察各組小鼠體質量變化、排便情況和結腸組織病理學改變，以流式細胞術檢測脾臟和結腸固有層不同表型單核細胞和巨噬細胞以及外周血細胞因子水平。結果Fp治療組小鼠體質量下降、結腸縮短、結腸組織病理學改變均輕于炎癥組(P<0.05)，脾臟和結腸固有層總單核細胞和促炎單核細胞百分率、結腸固有層M1型巨噬細胞百分率均顯著低于炎癥組(P<0.05)，結腸固有層M2型巨噬細胞百分率則顯著高于炎癥組(P<0.05)，外周血白細胞介素(IL)-10、IL-4水平顯著高于炎癥組(P<0.05)，IL-6、干擾素(IFN)-γ、趨化因子CCL2水平顯著低于炎癥組(P<0.05)。結論Fp上清液可通過減少促炎單核細胞數量、誘導腸道炎癥部位巨噬細胞向M2型極化以及促進抗炎細胞因子分泌、抑制促炎細胞因子和趨化因子分泌等途徑在小鼠結腸炎中發(fā)揮抗炎作用。

Background: The abundance ofFaecalibacteriumprausnitzii(Fp) is reduced in patients with inflammatory bowel disease (IBD). Previous studies demonstrated that the supernatant of Fp exerts an obvious anti-inflammatory effect in experimental colitis.AimsTo investigate the effect of Fp supernatant on monocytes/macrophages and colonic inflammation in dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.MethodsThirty male C57BL/6J mice were randomly divided into control group, colitis group and Fp treatment group. Acute colitis was induced by drinking 4.5% DSS in distilled water for seven days in colitis and Fp treatment groups. Mice in Fp treatment group were also given gastric infusion of Fp supernatant during the process of colitis induction. Weight loss, defecation and histopathological damage of colon tissue were observed. The percentages of monocytes and macrophages of different phenotypes in spleen and colonic lamina propria, as well as the serum levels of a series of inflammatory cytokines were detected by flow cytometry.ResultsCompared with colitis group, Fp treatment showed an ameliorating effect on weight loss, shortening of colon length and histopathological damage (P<0.05). The percentages of total amount of monocytes and proinflammatory monocytes in spleen and colonic lamina propria, and the percentage of M1 macrophages in colonic lamina propria in Fp treatment group were significantly lower than those in colitis group; the percentage of M2 macrophages in colonic lamina propria in Fp treatment group was significantly higher than that in colitis group (Pall <0.05). The serum levels of interleukin (IL)-10 and IL-4 in Fp treatment group were significantly higher than those in colitis group, and the levels of IL-6, interferon (IFN)-γ and chemokine CCL2 were significantly lower than those in colitis group (Pall <0.05).ConclusionsFp supernatant may exert anti-inflammatory effect in experimental colitis in mice via reducing proinflammatory monocytes, inducing M2 polarization of macrophages in inflamed colon, promoting secretion of anti-inflammatory cytokines, and inhibiting secretion of proinflammatory cytokines and chemokines.