FOLFOX4新輔助化療對直腸癌組織Ki-67、MMP-2和Fas表達的影響

畢利萍 李玉軍 郭 茜 于曉彬 宋 臻 喬宏杰 張洪巖 齊秀恒

中國石油天然氣集團公司中心醫(yī)院腫瘤科(065000)

FOLFOX4新輔助化療對直腸癌組織Ki-67、MMP-2和Fas表達的影響

畢利萍*李玉軍 郭 茜 于曉彬 宋 臻 喬宏杰 張洪巖 齊秀恒#

中國石油天然氣集團公司中心醫(yī)院腫瘤科(065000)

新輔助化療； 直腸腫瘤； Ki-67抗原； 基質(zhì)金屬蛋白酶2； 受體，fas； 免疫組織化學(xué)

直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率高，治療方式主要有化療(包括手術(shù)或放療前的新輔助化療)、放療和外科手術(shù)治療[1]。直腸癌的聯(lián)合化療方案包括以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的XELOX方案、FOLFOX方案[1-5]以及以伊立替康為基礎(chǔ)的FOLFIRI方案、XELIRI方案[6-7]。以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的新輔助化療對直腸癌患者療效確切[4-5]，對直腸癌肝轉(zhuǎn)移亦可延長術(shù)后無進展生存期[8]，但其作用機制尚未完全明確。本研究通過觀察FOLFOX4新輔助化療對直腸癌患者腫瘤組織中增殖細胞相關(guān)核抗原Ki-67、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移促進因子基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和死亡受體Fas蛋白表達的影響，探討以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的新輔助化療對直腸癌的作用機制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

材料與方法

一、研究對象

前瞻性納入2014年8月—2016年2月在中國石油天然氣集團公司中心醫(yī)院接受根治性手術(shù)治療的病理確診直腸癌患者，采用隨機數(shù)字表法歸入治療組和對照組。治療組患者先接受新輔助化療，再行手術(shù)治療；對照組患者不接受新輔助化療，直接進行手術(shù)治療。入組患者均無遺傳性疾病史，入組前均未接受過放化療，臨床資料不完整者予以剔除。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者本人或家屬簽署知情同意書。

二、治療方案

治療組患者術(shù)前接受FOLFOX4方案新輔助化療：氟尿嘧啶(5-FU) 400 mg/m2靜脈推注，第1 d，隨后5-FU 600 mg/m2加入化療泵持續(xù)靜脈滴注22 h；亞葉酸鈣200 mg/m2靜脈滴注，第1～2 d；奧沙利鉑85 mg/m2靜脈滴注，第1 d。每2周重復(fù)一次，共6個療程。對照組患者僅接受手術(shù)治療。

三、Ki-67、MMP-2、Fas免疫組化染色

兩組患者均留取手術(shù)標(biāo)本，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，HE染色定位后采用SP法行免疫組化染色。免疫組化染色SP試劑盒購自Abcam plc.，兔抗人Ki-67抗體、鼠抗人MMP-2抗體、鼠抗人Fas抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。切片常規(guī)脫蠟、水化，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，熱修復(fù)抗原，兔血清阻斷非特異性染色，依次加入一抗(1∶100稀釋)、生物素標(biāo)記的二抗和酶標(biāo)鏈霉親和素，37 ℃孵育25 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，倒置顯微鏡觀察并拍照。以PBS代替一抗作為陰性對照，已知Ki-67、MMP-2、Fas表達陽性的直腸癌組織切片作為陽性對照。每一樣本重復(fù)檢測2次。

結(jié)果判定：參考既往研究[9]采用的方法，根據(jù)染色強度和陽性細胞占細胞總數(shù)的百分率進行半定量分析。陽性染色強度評分：陽性染色表現(xiàn)為細胞膜、細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)淡黃色至棕褐色顆粒，無染色記0 分；淡黃色記1分；黃色記2分；棕褐色記3分。陽性細胞百分率評分：隨機選取6個高倍視野，計數(shù)細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù)，陽性細胞數(shù)<5%記0分；5%～25%，記1分；26%～50%，記2分；51%～75%，記3分；>75%，記4分?？偡譃閮身椩u分之和：0～2分為陰性表達，3～7分為陽性表達。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料

共104例直腸癌患者納入研究，其中治療組58例，對照組46例。兩組性別、年齡、腫瘤組織學(xué)類型、T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)，兩組患者均無遠處轉(zhuǎn)移。

二、新輔助化療對直腸癌組織Ki-67、MMP-2、Fas蛋白表達的影響

免疫組化染色顯示，在術(shù)后直腸癌組織中，Ki-67主要表達于細胞核，MMP-2、Fas蛋白主要表達于細胞質(zhì)(圖1)。治療組Ki-67、MMP-2陽性表達率明顯低于對照組，F(xiàn)as陽性表達率明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表1 治療組與對照組直腸癌患者臨床資料比較

圖1 術(shù)后直腸癌組織Ki-67、MMP-2、Fas表達(免疫組化SP法，×100)

表2治療組與對照組術(shù)后直腸癌組織Ki-67、MMP-2、Fas陽性表達率比較n(%)

組別例數(shù)Ki-67MMP-2Fas治療組5824(41.4)21(36.2)36(62.1)對照組4637(80.4)34(73.9)15(32.6)χ2值16.13614.6388.909P值0.0000.0000.003

討 論

直腸癌為消化道常見惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康甚至危及生命，化療為其主要治療方式之一。對于進展期直腸癌患者，新輔助化療能縮小原發(fā)腫瘤病灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，降低腫瘤臨床病理分期，減少術(shù)中轉(zhuǎn)移和術(shù)后并發(fā)癥，提高根治性手術(shù)切除率，為無手術(shù)條件的患者提供手術(shù)機會，從而延長患者生存時間[10]。本研究擬對直腸癌常用新輔助化療方案FOLFOX4的可能作用機制進行探討。

Ki-67是一種表達于增殖細胞的核抗原，細胞周期Gs、G2和M期均可檢測到Ki-67表達，G0期則表達缺如，是目前反映腫瘤細胞增殖活性和增殖速率最可靠的指標(biāo)[11]。本研究中未接受新輔助化療而直接進行手術(shù)治療的對照組患者術(shù)后腫瘤組織Ki-67陽性表達率為80.4 %，國內(nèi)李偉等[12]的研究顯示術(shù)前未接受任何治療的直腸癌患者腫瘤組織Ki-67陽性表達率為87.14 %，顯著高于癌旁非癌組織的17.14%，與本研究結(jié)果一致。Havelund等[13]的研究發(fā)現(xiàn)新輔助放化療可顯著降低直腸癌組織中的Ki-67表達，本研究結(jié)果亦表明FOLFOX4新輔助化療可使直腸癌組織中的Ki-67陽性表達率顯著降低(41.4%對80.4%)，提示FOLFOX4新輔助化療可能對直腸癌細胞增殖具有抑制作用。

MMPs家族是一組蛋白水解酶，可降解基底膜和細胞外基質(zhì)，從而參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移。多項研究發(fā)現(xiàn)MMP-2在結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織或外周血中呈高表達[14-15]，并與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)[14]，提示其可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)王敏等[16]的研究顯示，XELOX化療方案用于晚期結(jié)直腸癌患者，可顯著降低其血清MMP-2水平。本研究探討了新輔助化療對直腸癌患者腫瘤組織MMP-2表達的影響，發(fā)現(xiàn)FOLFOX4新輔助化療可顯著降低MMP-2陽性表達率，表明該治療手段可能對直腸癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力有一定抑制作用。

死亡受體Fas與其配體FasL結(jié)合激活后可進一步與Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)結(jié)合，而后募集凋亡起始分子caspase-8形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體，進而級聯(lián)激活下游caspase-3、6、7，誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OLFOX4新輔助化療可顯著上調(diào)直腸癌患者腫瘤組織中的Fas蛋白表達，提示新輔助化療在直腸癌中可能通過促進腫瘤細胞凋亡發(fā)揮作用。Liang等[17]對不可切除的局部進展期直腸癌患者的研究顯示，同期放化療可顯著降低血清可溶性Fas(sFas)水平，對放化療有應(yīng)答者的sFas水平顯著低于無應(yīng)答者，低sFas水平患者的術(shù)后1年生存率更高。sFas的產(chǎn)生可能是體內(nèi)細胞凋亡的一種調(diào)節(jié)方式，對凋亡起抑制性調(diào)節(jié)作用[18]，因此該研究結(jié)果證實放化療可促進腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，F(xiàn)OLFOX4新輔助化療對直腸癌治療作用的機制可能與抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力以及促進腫瘤細胞凋亡有關(guān)，是一種有效的直腸癌新輔助化療方案。

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(2017-05-18收稿；2017-07-19修回)

EffectofNeoadjuvantChemotherapyWithFOLFOX4onExpressionsofKi-67,MMP-2andFasinRectalCancer

BILiping,LIYujun,GUOQian,YUXiaobin,SONGZhen,QIAOHongjie,ZHANGHongyan,QIXiuheng.

DepartmentofOncology,CentralHospitalofChinaNationalPetroleumCorporation,Langfang,HebeiProvince(065000)

QI Xiuheng, Email: qhyy876@126.com

Neoadjuvant Chemotherapy; Rectal Neoplasms; Ki-67 Antigen; Matrix Metalloproteinase 2;Receptors, fas; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.11.004

*Email: a077pe@163.com

#本文通信作者，Email: qhyy876@126.com

背景：直腸癌為消化道常見惡性腫瘤。以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的新輔助化療對直腸癌患者療效確切，但其作用機制尚未完全明確。目的探討FOLFOX4(亞葉酸鈣+氟尿嘧啶+奧沙利鉑)新輔助化療對直腸癌患者腫瘤組織中增殖細胞相關(guān)核抗原Ki-67、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和死亡受體Fas蛋白表達的影響。方法前瞻性納入2014年8月—2016年2月中國石油天然氣集團公司中心醫(yī)院病理確診直腸癌患者104例，隨機分為治療組(n=58)和對照組(n=46)，治療組患者術(shù)前接受6個療程FOLFOX4方案新輔助化療，對照組患者直接行手術(shù)治療。取術(shù)后腫瘤組織標(biāo)本，以免疫組化法檢測Ki-67、MMP-2、Fas蛋白表達。結(jié)果直腸癌組織中Ki-67主要表達于細胞核，MMP-2、Fas主要表達于細胞質(zhì)。治療組Ki-67、MMP-2陽性表達率顯著低于對照組(41.4%對80.4%,P<0.05; 36.2%對73.9%,P<0.05)，F(xiàn)as陽性表達率顯著高于對照組(62.1%對32.6%,P<0.05)。結(jié)論FOLFOX4新輔助化療對直腸癌治療作用的機制可能與抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力以及促進腫瘤細胞凋亡有關(guān)。

Background: Rectal cancer is a common malignant tumor of alimentary tract. It has been demonstrated that oxaliplatin-based neoadjuvant chemotherapy is effective for rectal cancer, however, its mechanism is not fully clarified.AimsTo explore the effect of neoadjuvant chemotherapy with FOLFOX4 (folinic acid, fluorouracil, and oxaliplatin) on expressions of Ki-67, a proliferating cell-associated nuclear antigen, matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), and Fas, a death receptor in cancerous tissue of patients with rectal cancer.MethodsA total of 104 cases of patients with histologically proven rectal cancer from Aug. 2014 to Feb. 2016 at Central Hospital of China National Petroleum Corporation were enrolled prospectively and randomly allocated into treatment group (n=58) and control group (n=46). Patients in treatment group finished 6 cycles of neoadjuvant chemotherapy with FOLFOX4 before surgery, and those in control group underwent surgery directly. Expressions of Ki-67, MMP-2 and Fas protein in cancerous tissue of surgical specimens were determined immunohistochemically.ResultsImmunoreactivity of Ki-67 mainly located in the nucleus of rectal cancer cells, and those of MMP-2 and Fas mainly located in the cytoplasm. Expression rates of Ki-67 and MMP-2 were significantly lower in treatment group than in control group (41.4%vs. 80.4%,P<0.05; 36.2%vs. 73.9%,P<0.05), while those of Fas was significantly higher in treatment group than in control group (62.1%vs. 32.6%,P<0.05).ConclusionsThe therapeutic effect of neoadjuvant chemotherapy with FOLFOX4 on rectal cancer might be associated with the inhibition of proliferative, invasive and metastatic capacities and induction of apoptosis in cancer cells.