周麗云 李校天 李 麗 楊俊超 郭永澤

(056002) 河北工程大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)科2 血液內(nèi)科3

1α,25-二羥維生素D3通過上調(diào)MiR-146a表達抑制肝星狀細胞活化*

周麗云1#李校天2&李 麗3楊俊超3郭永澤2河北工程大學1

(056002)河北工程大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)科2血液內(nèi)科3

肝星狀細胞； 纖維化； 1α,25-二羥維生素D3； 微RNAs； MiR-146a

肝纖維化的形成是一個多因素、多細胞參與的復(fù)雜過程，涉及多種細胞和細胞因子的相互制約、相互作用，活化的肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSC)在此過程中起關(guān)鍵作用[1-3]，因此抑制HSC活化成為延緩肝纖維化進程甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要靶點。

微RNAs(miRNAs)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為18～25 nt的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物甚至單細胞生物體內(nèi)，參與基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[4]。以基因芯片和熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)對在靜息期與活化期HSC中差異表達的miRNAs進行篩選和驗證，并聯(lián)合基因本體分析和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析明確相關(guān)miRNAs的生物學功能，發(fā)現(xiàn)有多個miRNAs參與了HSC的增殖、活化，可促進或抑制肝纖維化發(fā)生、發(fā)展。

肝臟是維生素D3代謝的重要部位，1α,25-二羥維生素D3[1α,25-dihydroxyvitamin D3, 1,25(OH)2D3]是維生素D在體內(nèi)的最終活性形式，與體內(nèi)鈣和骨鹽的平衡密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3有一定的抗肝纖維化作用，對于其是否系通過影響HSC中的miRNAs表達而抑制HSC活化、增殖，進而抑制肝纖維化進展，目前尚不清楚。本實驗從基因?qū)W角度出發(fā)，探討1,25(OH)2D3對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)激活的HSC中相關(guān)miRNAs表達的影響，旨在明確1,25(OH)2D3是否可通過調(diào)控miRNAs表達而抑制HSC活化，研究結(jié)果可為1,25(OH)2D3用于治療肝纖維化提供更多理論和實驗依據(jù)，同時為臨床逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供更多的藥物靶點和臨床治療思路。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

大鼠原代HSC-T6細胞株(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)。TRIzolTM試劑、細胞凋亡檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific)；qPCR試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；miR-146a mimic、miR-146a mimic陰性對照(miR-146a mimic NC)凍干粉、riboFectTMCP轉(zhuǎn)染試劑(廣州市銳博生物科技有限公司)；1,25(OH)2D3(Sigma-Aldrich Co.)；CCK-8試劑盒(同仁化學研究所)。

二、方法

1. qPCR篩選差異表達miRNAs、驗證轉(zhuǎn)染是否成功、檢測1,25(OH)2D3干預(yù)對miR-146a表達的影響：通過文獻檢索，選取既往研究報道的在靜息期與活化期HSC中存在明顯差異表達的miRNAs，初步納入miR-146a、miR-30c、miR-193、miR-101、miR-200a五個miRNAs[5-8]，采用qPCR作進一步篩選、驗證。HSC長至單層80%～90%時，更換無血清RPMI1640培養(yǎng)基同步化細胞，然后以終濃度10 pmol/L TGF-β1活化細胞3 h，以不予TGF-β1處理的未活化HSC作為對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，以TRIzolTM試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以之為模板，采用SYBR Green Ⅰ行qPCR。各miRNAs特異性上游引物序列見表1，通用下游引物序列：5’-CTC AAC TGG TGT CGT GGA-3’；通用鼠源內(nèi)參U6引物序列：上游5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。反應(yīng)條件：95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算目的miRNAs相對表達量。

轉(zhuǎn)染是否成功的驗證和1,25(OH)2D3干預(yù)對miR-146a表達影響的檢測，qPCR步驟同差異表達miRNAs篩選。

表1 候選miRNAs上游引物序列

2. MiRNA mimic轉(zhuǎn)染：miR-146a mimic和miR-146a mimic NC于使用前瞬時離心，以滅菌ddH2O配制成20 μmol/L儲存液，分裝保存。以30 μL 1×riboFectTMCP緩沖液稀釋1.25 μL miR-146a mimic或miR-146a mimic NC，輕輕混勻后加入3 μL riboFectTMCP轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹打混勻，室溫孵育0～15 min。將24孔板中HSC的培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，加入上述混合液，輕輕混勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

3. 細胞培養(yǎng)和分組：取HSC，使用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每24～48 h換液一次。細胞長滿至t25培養(yǎng)瓶中約80%～90%時，胰酶消化傳代，傳至3～4代時進行細胞分組。實驗設(shè)5個組別，分別予下述處理：①TGF-β1刺激組：終濃度10 pmol/L TGF-β1；②miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組：50 nmol/L miR-146a mimic+10 pmol/L TGF-β1；③miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組：50 nmol/L miR-146a mimic NC+10 pmol/L TGF-β1；④1,25(OH)2D3治療組：2.5×10-6mol/L 1,25(OH)2D3+0.1% DMSO+10 pmol/L TGF-β1；⑤DMSO對照組：0.1% DMSO+10 pmol/L TGF-β1。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。藥物濃度和培養(yǎng)時間根據(jù)本課題組前期實驗結(jié)果設(shè)定。

4. CCK-8實驗檢測細胞活力：HSC接種于96孔板，每孔100 μL，待細胞長至80%時，按步驟3分組進行干預(yù)，每組設(shè)3個復(fù)孔。干預(yù)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育約1 h，使用酶標儀測定450 nm波長處吸光度值(A值)。細胞存活率=(實驗孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)×100%。

5. 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：取對數(shù)生長期HSC，按步驟3分組干預(yù)24 h后，棄去培養(yǎng)基，胰酶消化細胞，以培養(yǎng)基輕輕吹打，4 ℃ 1 200 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗2次，以500 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，細胞數(shù)目為5×105。以孔徑為40～50 μm 的300目尼龍網(wǎng)過濾細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μl PI，輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育5 min，上流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、差異表達miRNAs

qPCR檢測顯示， HSC活化前后miR-146a相對表達量分別為1.523±0.085和0.507±0.012(P=0.039)，miR-101分別為1.117±0.115和0.810±0.056(P=0.401)，miR-30c分別為1.003±0.105和0.593±0.129(P=0.629)，miR-193分別為1.001±0.092和0.750±0.044(P=0.263)，miR-200a分別為1.340±0.053和0.927±0.081(P=0.267)(圖1)。5種miRNAs在活化HSC中的表達均有所下調(diào)，但僅miR-146a差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 活化與未活化HSC差異表達miRNAs篩選結(jié)果

二、 轉(zhuǎn)染成功與否驗證和1,25(OH)2D3對miR-146a表達的影響

qPCR檢測顯示，miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組HSC中的miR-146a相對表達量較miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組顯著增高(33.72±4.79對0.41±0.12，P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。1,25(OH)2D3治療組HSC中的miR-146a相對表達量較DMSO對照組顯著增高(4.53±0.73對0.35±0.11，P<0.05)，提示1,25(OH)2D3可上調(diào)miR-146a表達。

三、細胞存活率

CCK-8實驗顯示，以TGF-β1刺激組HSC的細胞存活率作為參考值(100%)進行標準化，1,25(OH)2D3治療組和DMSO對照組HSC存活率分別為 62.77%±0.16%和83.32%±0.06%，miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組和miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組HSC存活率分別為53.50%±0.58%和93.32%±0.03%，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示1,25(OH)2D3可通過上調(diào)miR-146a表達抑制活化HSC增殖。

四、細胞凋亡率

流式細胞術(shù)檢測顯示，TGF-β1刺激組、1,25(OH)2D3治療組、miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組、miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組和DMSO對照組HSC凋亡率分別為 6.26%±0.03%、13.40%±1.33%、19.07%±0.60%、5.36%±0.32%和7.13%±0.08%，1,25(OH)2D3治療組明顯高于DMSO對照組和TGF-β1刺激組，miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組明顯高于miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組和TGF-β1刺激組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)，提示1,25(OH)2D3可通過上調(diào)miR-146a表達促進活化HSC凋亡。

A：1,25(OH)2D3治療組；B：DMSO對照組；C：miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組；D：miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組

圖2各組HSC細胞凋亡情況流式細胞分析

討 論

肝纖維化是慢性肝病進展為肝硬化乃至肝細胞癌的必經(jīng)階段，細胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積為其主要病理過程。HSC活化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)[1-3]，可致ECM合成增加，因此抑制HSC活化對于肝纖維化的治療至關(guān)重要。盡管目前對肝纖維化可逆轉(zhuǎn)這一觀點已達成共識，但仍缺乏效果明確的逆轉(zhuǎn)藥物。MiRNAs是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的內(nèi)源性非編碼RNA，其表達具有明顯的組織特異性和時序特異性。成熟miRNA的種子序列(seed sequence)可與靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)互補結(jié)合，從而降解靶mRNA或抑制蛋白翻譯，參與調(diào)節(jié)機體內(nèi)約1/3的基因表達。隨著分子生物學研究的深入，已發(fā)現(xiàn)miRNAs在細胞生長、增殖、分化、凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。近年研究顯示，miRNAs與HSC的增殖和凋亡密切相關(guān)，如miR-146a、miR-30c、miR-193、miR-101、miR-200a在活化HSC中的表達水平明顯下調(diào)，miR-146a下調(diào)可通過TGF-β/Smad4信號通路促進HSC活化[5]；而miR-146a、miR-30c和miR-193過表達可使TGF-β誘導(dǎo)的HSC增殖顯著受抑[5-6]；miR-101可通過靶向抑制TGF-βⅠ型受體(TβRⅠ)及其轉(zhuǎn)錄激活因子KLF6抑制TGF-β1信號通路，進而抑制HSC活化[7]；上調(diào)HSC中的miR-200a表達可在mRNA和(或)蛋白水平抑制其下游TGF-β2或β-catenin，從而影響HSC的活化和增殖[8]。本研究采用qPCR技術(shù)驗證了上述5個miRNAs在TGF-β1誘導(dǎo)激活的HSC中的表達水平均低于靜息期HSC，其中miR-146a差異表達顯著(P<0.01)。MiR-146a位于人類5號染色體LOC285628基因的第二外顯子，Baltimore的團隊于2006年首先報道了該miRNA的生物學功能及其調(diào)控機制[9]。隨后不斷有研究報道其與機體自身免疫之間有著錯綜復(fù)雜的關(guān)系，近年研究發(fā)現(xiàn)其表達變化與病毒復(fù)制、肝細胞再生、炎癥反應(yīng)甚至肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展亦有密切聯(lián)系。由此推測，某些具有抑制肝纖維化作用的藥物可能通過上調(diào)HSC中的miR-146a表達而抑制HSC活化。

1,25(OH)2D3是維生素D在體內(nèi)的最終活性形式，經(jīng)典作用為調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝。近年來，隨著研究的深入，1,25(OH)2D3所具有的免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細胞增殖和遷移以及抗纖維化作用逐漸被揭示。Giangreco等[10]的體外實驗和對腫瘤組織標本的研究證實，1,25(OH)2D3可通過上調(diào)miR-100、miR-125b表達抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲和遷移，得出前列腺癌患者可能受益于維生素D3的結(jié)論。另有1,25(OH)2D3通過調(diào)節(jié)miRNAs表達譜誘導(dǎo)膀胱癌細胞凋亡的報道[11]。Li等[12]的研究顯示，1,25(OH)2D3可通過下調(diào)miR-27b增加維生素D受體(VDR)表達，從而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，達到抑制肺纖維化進程的目的。Abramovitch等[13]的實驗研究顯示，1,25(OH)2D3對大鼠原代培養(yǎng)HSC具有抗增殖作用，在大鼠肝纖維化模型中可顯著減少ECM沉積。本課題組前期體外實驗亦證實1,25(OH)2D3對HSC具有明顯的抗增殖、促凋亡作用[14]；進一步的動物模型研究顯示，1,25(OH)2D3可顯著改善肝纖維化模型大鼠的肝組織炎癥，抑制纖維化進程[15]。然而，關(guān)于1,25(OH)2D3抗肝纖維作用的具體機制，目前尚未完全明確。本研究對1,25(OH)2D3是否通過直接影響HSC中的miRNAs表達而發(fā)揮抑制活化HSC增殖并促進其凋亡的作用進行了探討。首先，研究通過重復(fù)既往實驗證實miR-146a在TGF-β1誘導(dǎo)激活的HSC中表達顯著下調(diào)。進一步將化學合成的具有模擬內(nèi)源性miR-146a作用的miR-146a mimic轉(zhuǎn)染入TGF-β1誘導(dǎo)激活的HSC，然后以qPCR驗證轉(zhuǎn)染是否成功以及1,25(OH)2D3干預(yù)對miR-146a表達的影響，以CCK-8實驗和流式細胞術(shù)檢測細胞增殖和凋亡情況，結(jié)果顯示1,25(OH)2D3治療組HSC中的miR-146a表達較DMSO對照組顯著增高，1,25(OH)2D3治療組和miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組HSC存活率分別較DMSO對照組和miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組顯著降低，凋亡率則分別較相應(yīng)對照組顯著增高，與TGF-β1刺激組相比亦顯著增高。上述結(jié)果提示1,25(OH)2D3可通過上調(diào)miR-146a表達抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC活化，促進細胞凋亡。

綜上所述，1,25(OH)2D3調(diào)控miR-146a表達可能是其抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC活化、促進細胞凋亡的重要機制之一，但其涉及的具體信號通路有待進一步研究。本課題組將在后續(xù)體外和體內(nèi)實驗中繼續(xù)探索1,25(OH)2D3的抗肝纖維化作用與miR-146a及其下游信號通路之間的關(guān)系，以期為1,25(OH)2D3用于肝纖維化的治療提供更多依據(jù)，同時為臨床逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供更多治療思路，從而改善肝纖維化患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。

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(2017-06-03收稿；2017-07-05修回)

1α,25-DihydroxyvitaminD3InhibitsActivationofHepaticStellateCellsbyUp-regulatingMiR-146aExpression

ZHOULiyun1,LIXiaotian2,LILi3,YANGJunchao3,GUOYongze2.

1HebeiUniversityofEngineering,Handan,HebeiProvince(056002);2DepartmentofGastroenterology,3DepartmentofHematology,AffiliatedHospitalofHebeiUniversityofEngineering,Handan,HebeiProvince

LI Xiaotian, Email: xtianli@sina.com

Hepatic Stellate Cells; Fibrosis; 1α,25-Dihydroxyvitamin D3; MicroRNAs; MiR-146a

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.11.003

河北省研究生創(chuàng)新能力培養(yǎng)資助項目(171290080015)；河北省衛(wèi)生廳重點科技研究計劃項目(20150490)

#Email: 1071815100@qq.com

&本文通信作者，Email: xtianli@sina.com

背景：1α,25-二羥維生素D3[1,25(OH)2D3]是維生素D在體內(nèi)的最終活性形式，研究顯示其具有一定的抗肝纖維化作用，但具體作用機制尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)有多個微RNAs(miRNAs)參與了肝星狀細胞(HSC)的增殖、活化，可促進或抑制肝纖維化發(fā)生、發(fā)展。目的探討1,25(OH)2D3是否可通過調(diào)控miRNAs表達而抑制HSC活化。方法通過文獻檢索和qPCR技術(shù)篩選在轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)激活的HSC與未活化HSC之間明顯差異表達的miRNAs。分別以差異表達miRNA mimic、陰性對照mimic、1,25(OH)2D3和DMSO與TGF-β1共同干預(yù)HSC，采用CCK-8實驗和流式細胞術(shù)檢測細胞活力和細胞凋亡情況。結(jié)果篩選顯示miR-146a在活化HSC中的表達顯著下調(diào)(P<0.05)。與DMSO對照組相比，1,25(OH)2D3治療組HSC中的miR-146a表達和細胞凋亡率顯著增高，細胞存活率顯著降低(P均<0.05)。MiR-146a mimic轉(zhuǎn)染組與陰性對照mimic轉(zhuǎn)染組相比亦表現(xiàn)為miR-146a表達和細胞凋亡率顯著增高，細胞存活率顯著降低(P均<0.05)。結(jié)論1,25(OH)2D3調(diào)控miR-146a表達可能是其抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC活化、促進細胞凋亡的重要機制之一。

Background: 1α,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25(OH)2D3], the active form of vitamin D, is reported in some studies having antifibrotic potential in liver fibrosis, however, its mechanism is not fully clarified. MicroRNAs (miRNAs) have recently been shown could regulate the proliferation and activation of hepatic stellate cells (HSCs), and are involved in the promotion or inhibition of liver fibrosis.AimsTo explore whether the inhibiting effect of 1,25(OH)2D3on activation of HSCs is by regulating miRNAs expression.MethodsLiterature review and qPCR method were used to screen out the differentially expressed miRNAs between transforming growth factor-β1 (TGF-β1)-stimulated (activated) HSCs and the inactivated HSCs. Then the HSCs were co-cultured with TGF-β1 and the mimic of differentially expressed miRNA, the negative control mimic, 1,25(OH)2D3and DMSO, respectively, and the cell viability and apoptosis were determined by CCK-8 assay and flow cytometry.ResultsExpression of miR-146a was down-regulated in activated HSCs (P<0.05). Compared with HSCs in DMSO group, the expression of miR-146a was significantly up-regulated in HSCs treated with 1,25(OH)2D3; meanwhile, the cell viability was decreased and the apoptosis was increased (Pall <0.05). In HSCs transfected with miR-146a mimic, the expression of miR-146a was up-regulated, the cell viability was decreased, and the apoptosis was increased similarly with HSCs in 1,25(OH)2D3group (Pall <0.05).ConclusionsRegulation of miR-146a expression might be one of the important mechanisms of 1,25(OH)2D3in inhibiting TGF-β1-stimulated HSC activation and inducing apoptosis in HSCs.