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(湖北文理學(xué)院附屬襄陽(yáng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 襄陽(yáng) 441000)

抗EGFR/VEGF雙特異性單鏈抗體的構(gòu)建及其抗卵巢癌SKOV-3的研究

江紅，毛小剛

(湖北文理學(xué)院附屬襄陽(yáng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北襄陽(yáng)441000)

目的將表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)同時(shí)進(jìn)行靶向治療，可協(xié)同抑制作用，增強(qiáng)抗腫瘤效果。方法使用重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)手段，西妥昔單抗的可變區(qū)和貝伐珠單抗的可變區(qū)通過G4S柔性肽連接在一起，獲得同時(shí)靶向EGFR和VEGF的雙特異性單鏈抗體(scDb)；通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)scDb與EGFR和VEGF的結(jié)合活性，并計(jì)算親和力常數(shù)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)scDb對(duì)受體過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3的結(jié)合能力； MTT法檢測(cè)scDb對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3的增殖抑制；Western Blot研究與單獨(dú)給藥相比scDb對(duì)SKOV-3相關(guān)信號(hào)通路的影響；建立卵巢癌SKOV-3細(xì)胞荷瘤小鼠動(dòng)物模型，檢測(cè)scDb的體內(nèi)抗腫瘤活性。結(jié)果通過重疊PCR手段和畢赤酵母X-33表達(dá)，成功獲得scDb，經(jīng)Western blot鑒定驗(yàn)證了scDb的分子量為55kD，證明表達(dá)及裝配正確。ELISA檢測(cè)scDb與EGFR和VEGF均有結(jié)合活性，通過EC50計(jì)算，得到scDb與EGFR的親和力常數(shù)為1.27nM，與VEGF的親和力常數(shù)為0.75nM。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)scDb與SKOV-3的結(jié)合率為72.00%。MTT實(shí)驗(yàn)，親本抗體組與雙特異性單鏈抗體組對(duì)SKOV-3均有抑制作用。通過Western blot實(shí)驗(yàn)表明，scDb能同時(shí)阻斷EGFR和激酶結(jié)構(gòu)域受體(KDR)的磷酸化，最終導(dǎo)致絲氨酸/蘇氨酸激酶等信號(hào)通路被強(qiáng)烈抑制。通過SKOV-3細(xì)胞裸鼠移植瘤模型的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，scDb組在體內(nèi)仍能發(fā)揮較強(qiáng)的抗腫瘤效果，高劑量組腫瘤抑制率可以達(dá)到(74.53±9.63)%。結(jié)論該文成功構(gòu)建并表達(dá)了scDb。scDb具有良好的體內(nèi)外抗腫瘤活性,為抗腫瘤治療提供了新的思路，有潛在的臨床應(yīng)用前景。

表皮生長(zhǎng)因子受體；人類表皮生長(zhǎng)因子；卵巢癌；雙特異性單鏈抗體

卵巢癌死亡率居于婦科惡性腫瘤的首位，如今對(duì)于卵巢癌的治療仍以手術(shù)和化療、 放療的聯(lián)合治療為主[1-2]。但較多的不良反應(yīng)，較差的患者依從等問題仍然沒有得到很好的解決[3-5]。而近些年靶向藥物的發(fā)展改善了卵巢癌的治療效果，單克隆抗體通過與受體的結(jié)合激活下游信號(hào)通路或者下調(diào)受體表達(dá)，達(dá)到促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[6]。如今靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的貝伐珠單抗(Bevacizumab)成為治療卵巢癌有效的手段[7-12]。研究發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號(hào)通路在卵巢癌的發(fā)展中扮演了重要的角色[12-14]，靶向EGFR的西妥昔單抗(Cetuximab)也作為治療卵巢癌的重要手段。EGFR與VEGF激活的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2都屬于酪氨酸激酶EGFR家族，在多種卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中過度表達(dá)或激活[15]。有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)長(zhǎng)期使用單一種靶向的藥物時(shí)，在給藥一段時(shí)間后會(huì)產(chǎn)生耐藥性。而同時(shí)靶向VEGF和EGFR兩個(gè)靶點(diǎn)則可以抑制多條細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，降低耐藥性和不良反應(yīng)，更好的抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。

基于這一理論本文提出一種同時(shí)靶向VEGF和EGFR雙特異性單鏈抗體(bispecific single-chain diabody，scDb)的研究方案[11, 17-19]。其相較于單克隆抗體含有兩種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)，在腫瘤細(xì)胞的不同靶點(diǎn)之間同時(shí)發(fā)揮效應(yīng)功能，產(chǎn)生協(xié)同抑制的效果，解決了抗體單獨(dú)使用療效不佳且易產(chǎn)生耐藥性的問題[16]。并且雙特異性單鏈抗體相較于雙特異性抗體分子量更小，腫瘤組織滲透能力更強(qiáng)，免疫原性更低。為腫瘤的臨床治療提供新的方案和思路。

1材料與方法

1.1一般材料

Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；蛋白Marker購(gòu)自上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；鼠抗His抗體，F(xiàn)ITC耦聯(lián)的羊抗鼠IgG-Fc單克隆抗體購(gòu)自南京賽博生物公司；西妥昔單抗購(gòu)自德國(guó)默克公司；貝伐珠單抗購(gòu)自瑞士羅氏公司；胎牛血清FBS購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Balb/c裸鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物中心；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及相關(guān)培養(yǎng)耗材購(gòu)自美國(guó)熱電公司；TMB(Tetramethylbenzidine)顯色液購(gòu)自上海碧云天公司；多種細(xì)胞因子購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司。

1.2方法

1.2.1 scDb表達(dá)及純化

通過DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索西妥昔單抗和貝伐珠單抗的輕鏈與重鏈可變區(qū)蛋白序列(如表1)。使用G4S柔性肽將其連接在一起(見圖1A)[18]，并在C端引入6個(gè)組氨酸作為His標(biāo)簽。雙特異性單鏈抗體序列經(jīng)過畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化后送公司合成，并導(dǎo)入穿梭載體pPICZα中。采用畢赤酵母X-33表達(dá)系統(tǒng)，將菌種接種于 YPD 液體培養(yǎng)基(含終濃度 25μg/mL的博萊霉素)中 30℃活化培養(yǎng) 20～24h，搖床轉(zhuǎn)速為 220rpm；再將其1%接種量接于添加有 1×生物素溶液的 BMGY培養(yǎng)基中， 220rpm，30 ℃培養(yǎng) 20～24h；低溫3 000 rpm離心10min 收集 BMGY培養(yǎng)基中的菌體，將菌體重懸于等體積加有 1×生物素溶液的BMMY 培養(yǎng)基中，添加終濃度為 0.5%的甲醇， 30℃誘導(dǎo)發(fā)酵，每24h 補(bǔ)添加甲醇(終濃度 0.5%)進(jìn)行誘導(dǎo)，連續(xù)誘導(dǎo)表達(dá) 5d。發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀法初步提取后采用鎳柱進(jìn)一步分離純化得到電泳純蛋白，最后對(duì)利用Western Blot對(duì)純化得到的蛋白進(jìn)行鑒定，以期獲得高產(chǎn)量高純度的雙特異性單鏈抗體。

表1 西妥昔單抗和貝伐珠單抗的輕鏈與重鏈可變區(qū)蛋白序列

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定scDb的結(jié)合活性

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定scDb的結(jié)合活性，先紫外線照射酶條30 min，使其活化。每孔加100μL 1μg/mL的EGFR或VEGF溶液， 4℃過夜包被。吸去抗原，每孔加200μL 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5min，拍干孔里溶液，加入 200μL脫脂牛奶封閉液，37 ℃孵育1h。棄封閉液，拍干，200μL PBS洗3次，每次5min，拍干。以碳酸鹽緩沖液梯度稀釋雙特異性單鏈抗體，加入100μL稀釋好的抗體，37 ℃孵育1h。棄上清，拍干，200μLPBS洗3次，每次5min，拍干。用封閉液稀釋抗His-HRP抗體，每孔加100μL，37℃孵育1h。吸去檢測(cè)性抗體，洗滌同上，拍干，每孔加100μL TMB 顯色液，室溫置于暗處孵育10～15min。每孔加50μL終止液，于多功能酶標(biāo)儀測(cè)定OD450-OD630吸光度差值。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)測(cè)結(jié)合

制備SKOV-3單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為在107個(gè)/mL。分為雙特異性單鏈抗體組和脫脂牛奶空白對(duì)照組。在每組中分別加入250μL相應(yīng)的抗體或脫脂牛奶，抗體濃度為100nmol/mL，冰上孵育1h，洗滌，孵育鼠抗His抗體，洗滌，再孵育FITC-耦聯(lián)的羊抗鼠IgG抗體，洗滌，上機(jī)檢測(cè)。使用FlowJo 7.6.1對(duì)流式數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.2.4 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT法)

制備SKOV-3單細(xì)胞懸液，鋪板，用培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整至3×104個(gè)/mL，以100μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)置只有培養(yǎng)基不含細(xì)胞的空白對(duì)照組。用含2%FBS的相應(yīng)培養(yǎng)基將西妥昔單抗或貝伐珠單抗以及等量雙特異性單鏈抗體以50μL/孔的量加入96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1h。按照每孔50μL的量加入含20ng/mLEGF和VEGF的2%FBS-1640培養(yǎng)基，使每孔中EGF和VEGF的終濃度均為10ng/mL；培養(yǎng)72小時(shí)后每孔加入11μL的5mg/mL的MTT溶液，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，按每孔加入150μL DMSO后將 96 孔板放于微量振蕩器上振蕩10min。最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm 處和630nm處的吸光值，將OD570-OD630作為每個(gè)孔的吸光值；抑制率按此計(jì)算公式：抑制率(%)= (對(duì)照組吸光值-實(shí)驗(yàn)組吸光值)/對(duì)照組吸光值×100。

1.2.5 蛋白質(zhì)印免疫跡法研究腫瘤細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路

收集培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的SKOV-3腫瘤細(xì)胞，用相應(yīng)完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/mL，按每孔2mL加入六孔板中，輕輕旋搖使細(xì)胞均勻分布在孔板中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。待SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，PBS潤(rùn)洗兩遍，每孔加入2mL無血清培養(yǎng)基，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)12h。PBS潤(rùn)洗兩遍，用含2%FBS的相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋西妥昔單抗、貝伐珠單抗和雙特異性單鏈抗體至100nM，按照每孔2mL的量加入上述孔板中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)1h。取出上述6孔板，每孔加入終濃度均為10ng/mL的VEGF和EGF，培養(yǎng)30min。收集上述各孔中的細(xì)胞至1.5mL的EP管中，用PBS洗滌兩次，每EP管中加入100μL細(xì)胞裂解液、1μL PMSF、 1μLCocktail (Ⅲ)、1μL NaF和1μLNa3VO4，將細(xì)胞重懸后置于4℃，裂解30min，每5min顛倒數(shù)次。冷凍離心機(jī)4℃， 2 000 rpm離心20min，用移液槍小心吸取離心上清液，轉(zhuǎn)移至干凈的EP管中，經(jīng)Bradford蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度。Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EGFR、磷酸化EGFR、激酶結(jié)構(gòu)域受體(kinase domain region receptor，KDR)、磷酸化KDR、AKT、磷酸化AKT和β-Actin。

1.2.6體內(nèi)抗腫瘤活性檢測(cè)

制備SKOV-3單細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)在106個(gè)/mL，取200μL細(xì)胞懸液接種于裸鼠右側(cè)腋皮下，觀察移植瘤生長(zhǎng)情況。并隨機(jī)分組，每組8只，共分為以下5組：陰性對(duì)照組(PBS組)，抗EGFR的西妥昔單抗組(10mg/kg)，抗VEGF的貝伐珠單抗組(10mg/kg)，同時(shí)靶向EGFR與VEGF的雙特異性單鏈抗體高劑量組(10mg/kg)，雙特異性單鏈抗體低劑量組(5mg/kg)。待瘤體積達(dá)到50～100mm3時(shí)開始尾靜脈給藥(記為day 1)，每?jī)商旖o一次藥并且對(duì)腫瘤體積進(jìn)行測(cè)量，按以下公式計(jì)算瘤體積：V=LW2/2(其中V代表瘤體積，L代表腫瘤最長(zhǎng)徑，W代表為腫瘤垂直方向的最大橫徑)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。在第19天結(jié)束給藥，并計(jì)算各組體內(nèi)腫瘤抑瘤率，抑瘤率=(對(duì)照組平均體積-實(shí)驗(yàn)組平均體積)/對(duì)照組平均體積×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1獲得裝配正確的雙特異性單鏈抗體

西妥昔單抗和貝伐珠單抗的輕鏈與重鏈可變區(qū)蛋白序列，通過重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)將其通過G4S柔性肽連接在一起，并在C端引入6個(gè)組氨酸作為His標(biāo)簽(見圖1A)，導(dǎo)入穿梭載體pPICZα中，使用畢赤酵母X-33表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)過硫酸銨沉淀法和鎳柱純化得到雙特異性單鏈抗體。如雙特異性單鏈抗體的示意圖(見圖1B)可以看出，雙特異性單鏈抗體具有同時(shí)靶向EGFR和VEGF的雙特異性。雙特異性單鏈抗體的分子量為55kD，Western Blot驗(yàn)證(見圖1C)了雙特異性單鏈抗體裝配的正確性。獲得了純度較高且裝配正確的雙特異性單鏈抗體。

注： A為雙特異性單鏈抗體基因設(shè)計(jì)； B為雙特異性單鏈抗體結(jié)構(gòu)示意圖；C為WB驗(yàn)證抗體分子量；Lane1～4為純化的雙特異性單鏈抗體。

圖1雙特異性單鏈抗體的基因設(shè)計(jì)，結(jié)構(gòu)示意圖及WB驗(yàn)證

Fig. 1 Gene design, structural diagram and western blot of scDb

2.2 scDb與EGFR和VEGF有較好的結(jié)合活性

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)結(jié)果計(jì)算出雙特異性單鏈抗體與抗原的結(jié)合半數(shù)有效濃度(EC50)即親和力常數(shù)為，EC50越小，抗體與抗原的親和力越高。如圖2A，表1顯示：雙特異性單鏈抗體與EGFR的結(jié)合半數(shù)有效濃度(EC50)為190.51ng/L，即1.27nM。雙特異性單鏈抗體與VEGF的結(jié)合半數(shù)有效濃度(EC50)為112.02ng/L，即0.75nM。雙特異性單鏈抗體分別與EGFR和VEGF顯示出來較高的親和力，其親和力常數(shù)均達(dá)到了nM級(jí)，顯示了理想的親和力。

2.3 scDb能有效結(jié)合到卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3表面

對(duì)使用脫脂牛奶作為一抗孵育的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，并進(jìn)行設(shè)門，將對(duì)照組的FITC陽(yáng)性閾值控制在1%以下，以這個(gè)門為基準(zhǔn)再計(jì)算雙特異性單鏈抗體組的FITC陽(yáng)性閾值，結(jié)果顯示：雙特異性單鏈抗體與A549細(xì)胞的結(jié)合率為72.00%(見圖2B)，母體單抗西妥昔的結(jié)合率為，表明制備的雙特異性抗體仍然保留有母體抗體的結(jié)合活性，并沒有因?yàn)榭贵w改造造成結(jié)合能力的降低。同時(shí)也從另一個(gè)方面明了腫瘤細(xì)胞模型模型選擇的正確性。

注：A為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定雙特異性單鏈抗體與EGFR及VEGF的親和力 ；B為雙特異性單鏈抗體，母體單抗西妥昔與SKOV-3細(xì)胞的結(jié)合。

圖2雙特異性單鏈抗體與EGFR及VEGF的親和力及其與SKOV-3細(xì)胞的結(jié)合

Fig.2 Affinities of scDb to EGFR and VEGF and the binding activities of scDb to SKOV-3

表2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定雙特異性單鏈抗體與EGFR及VEGF的親和力

2.4 MTT法研究了scDb對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖抑制作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見圖3、表3)，與PBS組對(duì)照相比，西妥昔單抗，貝伐珠單抗與雙特異性單鏈抗體均有抑制效果，且抑制作用呈濃度依賴性。在抗體濃度達(dá)到400nM時(shí)，雙特異性單鏈抗體抑制增殖率可以達(dá)到(65.75±3.64)%，明顯強(qiáng)于貝伐珠單抗組(43.16±2.52)%(t=3.562，P=0.007)和西妥昔單抗組(36.33±2.24)%(t=4.562，P=0.001)。通過MTT實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步確定雙特異性單鏈抗體設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)與效果。

圖3 MTT法檢測(cè)不同抗體對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖抑制作用

Fig 3. Inhibition of different antibodies to SKOV-3 proliferation detected by MTT

表3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞抑制率

注：與雙特異性單鏈抗組比較，*Plt; 0.05，**Plt;0.01，***Plt;0.001。

2.5 scDb影響多種腫瘤細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路

EGFR和VEGF均參與AKT等信號(hào)通路的調(diào)控，而AKT信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過Western Blot初步研究了聯(lián)合靶向EGFR和VEGF對(duì)腫瘤細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示，由EGF激活的EGFR的磷酸化可被西妥昔單抗抑制，由VEGF刺激的KDR的磷酸化可被貝伐珠單抗抑制，而聯(lián)合給藥可同時(shí)抑制EGFR和VEGF的磷酸化(見圖4)。抑制EGFR 磷酸化或KDR磷酸化均可抑制AKT的磷酸化，當(dāng)EGFR磷酸化(EGF刺激)和KDR磷酸化(VEGF刺激)被同時(shí)抑制時(shí)，AKT的磷酸化水平被降至更低。這一現(xiàn)象可以證明聯(lián)合給藥能降低EGFR/KDR的磷酸化，有效抑制EGFR/KDR的活化，降低控制細(xì)胞存活相關(guān)的Akt蛋白的表達(dá)激活。

注：Western Blot分析了在EGF和VEGF的刺激下雙特異性單鏈抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞SKOV-3中EGFR、KDR、AKT磷酸化水平的影響，并與貝伐珠單抗和西妥昔單抗作比較。

圖4雙特異性單鏈抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞SKOV-3相關(guān)信號(hào)通路的影響

Fig 4 Effects of scDb on signal transduction pathway of SKOV-3 cancer cell

2.6 scDb具有良好的體內(nèi)活性

進(jìn)一步研究scDb體內(nèi)抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見圖5A、5B、表4)，單獨(dú)抑制EGFR或VEGF均能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)抑制EGFR和VEGF的作用效果更加明顯。雙特異性單鏈抗體能顯著抑制SKOV-3細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，其抗腫瘤作用效果呈現(xiàn)濃度依賴性，高濃度抗體給藥組的活性比低濃度給藥組強(qiáng)。在第19天給藥結(jié)束，通過瘤體積的測(cè)量，發(fā)現(xiàn)雙特異性單鏈抗體高劑量組在體內(nèi)發(fā)揮較強(qiáng)的抗腫瘤效果，該給藥組的瘤體積明顯低于其他各組(見圖5A)。與PBS陰性對(duì)照組相比高劑量組腫瘤抑制率可以達(dá)到(74.53±9.63)%，明顯優(yōu)于低劑量組(60.32±5.68)%(t=3.262，P=0.005)，親本貝伐珠單抗(49.45.±4.63)%(t=3.562，P=0.007)與西妥昔單抗組(37.46±6.62)%(t=3.062，P=0.004)(見圖5B、表4)。

表4 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組腫瘤抑制率

注：與雙特異性單鏈抗-高劑量組比較，*Plt;0.05，**Plt;0.01，***Plt;0.001。

注：A為檢測(cè)不同給藥組19天內(nèi)荷瘤裸鼠的瘤體積變化；B為根據(jù)第19天腫瘤體積計(jì)算不同抗體組的體內(nèi)腫瘤抑制率。

圖5不同抗體對(duì)荷SKOV-3移植瘤裸鼠模型體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

Fig 5 In vivo assay of SKOV-3 cell xenografts in nude mice

3討論

3.1單一抗體治療卵巢癌的局限性

VEGF和EGFR都為卵巢癌研究的熱門靶點(diǎn)，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。但是多種研究表明單獨(dú)抑制某一條通路，在卵巢癌治療前期有較好的效果，但一段時(shí)間過后治療效果逐步降低，并產(chǎn)生耐藥。耐藥的產(chǎn)生與腫瘤的代償機(jī)制有關(guān)，當(dāng)抑制一條通路后另一條相關(guān)通路就會(huì)代償性的被激活，腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)。臨床上會(huì)選擇聯(lián)合用藥的方案來同時(shí)抑制不同的信號(hào)通路，然而抗體聯(lián)合治療在臨床應(yīng)用上受到很多局限，包括研發(fā)成本高、抗體產(chǎn)量低、上市申請(qǐng)法規(guī)繁瑣等，而且全長(zhǎng)抗體分子量大，很難滲透入腫瘤組織發(fā)揮藥效。

3.2雙特異性單鏈抗體治療卵巢癌的優(yōu)勢(shì)

基于此設(shè)計(jì)出雙特異性單鏈抗體，其有兩種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)，在腫瘤細(xì)胞的不同靶點(diǎn)之間同時(shí)發(fā)揮效應(yīng)功能，產(chǎn)生協(xié)同抑制的效果，更好地發(fā)揮靶向抑制的功能。并且其相較于全長(zhǎng)抗體的優(yōu)勢(shì)在于其分子量較小和生產(chǎn)成本較低，并且擁有更好的體內(nèi)外滲透性，故在抗腫瘤領(lǐng)域擁有較好的應(yīng)用價(jià)值。

3.3雙特異性單鏈抗體在體內(nèi)外均呈現(xiàn)良好抑瘤效果

本研究以雙靶向VEGF和EGFR的雙特異性單鏈抗體為研究對(duì)象，考察其在體內(nèi)外抑制卵巢癌SKOV-3的活性，獲得增強(qiáng)的抗腫瘤功能，可以為雙靶向抑制VEGF和EGFR通路的卵巢癌治療策略以及新型抗卵巢癌藥物的開發(fā)提供一定的經(jīng)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。首先設(shè)計(jì)并表達(dá)雙特異性單鏈抗體，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定雙特異性單鏈抗體與EGFR和VEGF的結(jié)合活性，并計(jì)算出雙特異性單鏈抗體的親和力常數(shù)，都能達(dá)到nM級(jí)，顯示了理想的親和力。流式細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了改造的抗體雙特異性單鏈抗體保留了親本抗體原有的卵巢癌細(xì)胞靶向性。細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)驗(yàn)證了雙特異性單鏈抗體較親本抗體更為有效的體外抗腫瘤活性。通過Western blot實(shí)驗(yàn)初步研究了聯(lián)合給藥對(duì)腫瘤細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路，結(jié)果表明， 聯(lián)合給藥能同時(shí)阻斷EGFR和KDR的磷酸化，最終導(dǎo)致AKT等信號(hào)通路被抑制。EGFR/KDR的活化被抑制后，降低控制細(xì)胞存活相關(guān)的AKT蛋白的表達(dá)激活，這與腫瘤細(xì)胞的存活和增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。最后，利用SKOV-3細(xì)胞裸鼠移植瘤模型對(duì)雙特異性單鏈抗體的體內(nèi)對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)表明相比于親本抗體雙特異性單鏈抗體可以顯著的抑制小鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)，抑制EGFR的磷酸化和腫瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述，雙特異性單鏈抗體雙靶向VEGF和EGFR信號(hào)通路，這種協(xié)同抑制可以有效的阻斷EGFR與KDR之間的竄擾(crosstalk)，對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的體內(nèi)外抗腫瘤作用效果優(yōu)于單靶向的親本抗體，可以為VEGF和EGFR信號(hào)通路聯(lián)合治療提供一種新的臨床治療的思路和經(jīng)驗(yàn)。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：安瑞芳]

Constructionofbispecificsingle-chaindiabodyofanti-EGFR/VEGFandagainstovariancarcinomaSKOV-3

JIANG Hong, MAO Xiao-gang

(HubeiCollegeofArtsandSciencesAffiliatedCentralHospitalofXiangyang,HubeiXiangyang441000,China)

ObjectiveTo build a bispecific single-chain diabody (scDb) targeting epidermal growth factor receptor (EGFR) and vascular endothelial growth factor (VEGF) to enhance anti-tumor effect by synergistic inhibition.MethodsThe scDb targeting EGFR and VEGF was obtained by linking variable region of Cetuximab and Bevacizumab with G4S by means of PCR. ELISA was used to analyze the affinity of scDb to EGFR and VEGF, and affinity constant was calculated. The binding activity of scDb to SKOV-3 was detected by flow cytometry, and MTT assay was used to detect the inhibition of cell proliferation. Western Blot was used to research the effects of scDb on SKOV-3 signal transduction pathway. Finally, mouse tumor model was generated by endermic injecting SKOV-3 cells to detect the antitumor activity of scDb in vivo.ResultsThe scDb was purified with PCR and X-33 expression of pichia pastoris, and the Western blot results showed that scDb had a correct molecular weight of 55kD, proofing correct expression and assembly. ELISA revealed affinity of scDb to EGFR and VEGF, and the affinity constant was 1.27nM to EGFR and 0.75nM to VEGF. Binding ratio of scDb to SKOV-3 was 72.00% detected by flow cytometry. MTT assay showed that both parental antibody group and scDb group had inhibitory effect on SKOV-3. Western Blot analysis revealed that scDb could block phosphorylation of EGFR and kinase domain region receptor (KDR) and thus signal transduction pathway of serine and threonine kinase was strongly inhibited. In vivo assay of the SKOV-3 cell xenografts in nude mice showed that scDb played a stronger antitumor effect in vivo. Tumor inhibition rate of group with high dose reached 74.53±9.63%.ConclusionIn this study scDb is successfully established and expressed, which maintains good antitumor effect in vivo and vitro. A new thought is proposed with potential clinical application prospect.

epidermal growth factor receptor (EGFR); vascular endothelial growth factor (VEGF); ovarian carcinoma; bispecific single-chain diabody (scDb)

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.11.014

R711.7

A

1673-5293(2017)11-1357-05

2017-06-26

江 紅(1977—)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事婦科臨床工作。

毛小剛，副主任醫(yī)師。