何莉媛，吳 偉，吳曉娟，付旭恒，林親錄

(中南林業(yè)科技大學 食品科學與工程學院，稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，長沙 410004)

米糠貯藏時間對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化性質及其消化產物抗氧化性的影響

何莉媛，吳 偉，吳曉娟，付旭恒，林親錄

(中南林業(yè)科技大學 食品科學與工程學院，稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，長沙 410004)

米糠貯藏；米糠蛋白；蛋白質氧化；體外消化；抗氧化性

米糠是稻米加工的副產物，我國米糠年產量在1 000萬t以上，米糠營養(yǎng)價值豐富，其中蛋白質含量14%～20%[1]。米糠蛋白擁有過敏性低、營養(yǎng)價值高、功能性質好等優(yōu)點，是食品工業(yè)中極有潛力的蛋白質資源[2]。米糠富含脂質和活性較強的脂肪水解酶和脂肪氧化酶，在糙米碾白過程中，米糠脂質在脂肪水解酶的作用下快速形成游離脂肪酸，使得米糠酸值迅速升高[3]。在貯藏和運輸過程中，米糠內源脂肪氧合酶催化游離脂肪酸發(fā)生氧化反應，導致米糠氧化酸敗[4]。米糠氧化酸敗產物具有較強的生物活性，能夠誘導米糠蛋白氧化，改變米糠蛋白的結構和功能性質[5-6]。因此，米糠在綜合利用之前需要進行及時有效的穩(wěn)定化處理，但米糠穩(wěn)定化設備投資較高，而我國稻米加工企業(yè)分布較為分散，且大部分產能和投資較低，無法及時有效地對米糠進行穩(wěn)定化處理，大部分米糠在穩(wěn)定化之前已經發(fā)生了不同程度的酸敗，其中米糠蛋白也發(fā)生了不同程度的氧化[5-7]。

蛋白質氧化是蛋白質分子在活性氧或次生氧化產物作用下發(fā)生的共價結構修飾[7]。蛋白質氧化不僅改變蛋白質的結構，而且影響其功能性質和營養(yǎng)品質[8]。大量研究表明蛋白質營養(yǎng)品質受氧化影響的程度與蛋白質氧化環(huán)境[9]、氧化程度[10]以及氧化蛋白質的種類[11]有關，并且大多數(shù)研究圍繞肉類蛋白[8]和大豆蛋白[12-15]展開，鮮有研究關注米糠酸敗引起的蛋白質氧化對米糠蛋白營養(yǎng)品質的影響。本文以新鮮米糠為原料，在一定條件下貯藏不同時間得到不同酸敗程度的米糠，穩(wěn)定化和脫脂后制備米糠蛋白，研究米糠貯藏時間對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化性質及其消化產物抗氧化性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮米糠：湖南糧食集團有限責任公司；胃蛋白酶(800 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)：Biosharp公司；1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、高硫酸鉀、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：美國 Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

Sorvall LYNX 6000高速落地離心機：美國Thermo Fisher公司；DSI Z-300A水浴恒溫振蕩器；BlueStar紫外可見分光光度計；RV10旋轉蒸發(fā)儀：德國IKA公司；FMHE36-24雙螺桿擠壓機。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠預處理

參考蔡勇建[7]米糠預處理方法。以新鮮米糠為原料粉碎過40目篩，在室溫下分別貯藏0、1、3、5、10 d得到不同酸敗程度的米糠，采用雙螺桿擠壓機穩(wěn)定化處理，穩(wěn)定化條件：喂料量15 kg/h，水分含量16%，雙螺桿擠壓機二區(qū)至六區(qū)溫度依次為70、120、120、70、60℃；隨后干燥、粉碎過40目篩備用。室溫條件下將不同貯藏時間米糠與正己烷按1∶4料液比混合脫脂，振蕩30 min后抽濾得到濾餅，濾液旋轉蒸發(fā)回收正己烷，收集米糠毛油，濾餅重復脫脂3次。將濾餅置于通風櫥中風干后得脫脂米糠。米糠毛油酸值測定參考GB/T 5530—2005，過氧化值測定參考GB/T 5538—2005。

1.2.2 米糠蛋白的制備

參考蔡勇建[7]制備米糠蛋白方法。將脫脂米糠與去離子水以1∶10混合，40℃下用2 mol/L NaOH將pH調節(jié)至9.0，攪拌4 h后將懸浮液在4℃條件下8 000 r/min離心20 min，上清液用2 mol/L HCl調pH至4.0，靜置30 min后在4℃條件下8 000 r/min離心15 min，水洗沉淀3次后分散于去離子水中，并用2 mol/L NaOH調pH至7.0，冷凍干燥得到米糠蛋白。

1.2.3 米糠蛋白體外胃蛋白酶消化程度的測定

參考Chen等[13]的方法。將米糠蛋白溶解于去離子水中配制質量分數(shù)為2%的米糠蛋白溶液，用2 mol/L HCl調pH 2.0，加入4 U/mg胃蛋白酶，37℃下保溫酶解90 min，隨后沸水浴5 min終止消化，10 000 r/min離心10 min后取上清液，取部分上清液用凱氏定氮法測定氮含量，剩余上清液配制0.6 mg/mL的待測液，用于測定米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物的抗氧化性。

1.2.4 米糠蛋白體外胃蛋白酶消化進程的測定

參考Bax等[9]的方法。將米糠蛋白溶解于去離子水中配制質量分數(shù)為2%的米糠蛋白溶液，用2 mol/L HCl調節(jié)pH 2.0，加入4 U/mg胃蛋白酶，37℃下保溫酶解，分別在酶解0、5、10、20、30、40、60、90 min后加入終質量分數(shù)為15%的三氯乙酸終止反應，冰浴1 h后4℃下8 000 r/min離心15 min，取上清液在280 nm處測定吸光值。

1.2.5 米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物抗氧化性的測定

2 結果與討論

2.1 米糠貯藏時間對米糠毛油酸值、過氧化值以及米糠蛋白體外胃蛋白酶消化率的影響(見表1)

表1 米糠貯藏不同時間米糠毛油的酸值、過氧化值以及米糠蛋白體外胃蛋白酶消化率

注：數(shù)值為“平均值±標準偏差”，同一列肩標中不同字母表示在5%水平上差異顯著，下同。

由表1可知，隨著新鮮米糠貯藏時間延長到10 d，米糠毛油的酸值(KOH)和過氧化值分別從4.31 mg/g和1.42 mmol/kg增加到38.72 mg/g和7.79 mmol/kg，表明米糠貯藏期間米糠脂質發(fā)生了水解酸敗和氧化酸敗。蔡勇建[7]在相同條件下貯藏新鮮米糠，發(fā)現(xiàn)米糠貯藏時間由0 d延長到10 d時，米糠蛋白羰基含量從2.12 nmol/mg增至13.80 nmol/mg，表明米糠酸敗氧化產物導致米糠蛋白氧化。隨著新鮮米糠貯藏時間的延長，米糠蛋白在體外胃蛋白酶作用下的消化率先上升后下降，在米糠貯藏3 d時達到最大值，為39.73%，較新鮮米糠蛋白增加了30.65%，米糠貯藏10 d時的體外胃蛋白酶消化率已顯著低于新鮮米糠(Plt;0.05)。Zhou等[10]研究氧化亞油酸濃度對豬肌原纖維蛋白體外消化率影響時發(fā)現(xiàn)，低濃度亞油酸導致豬肌原纖維蛋白胃蛋白酶消化率上升，高濃度亞油酸使得豬肌原纖維蛋白胃蛋白酶消化率下降，并認為蛋白質適度氧化可使得蛋白質結構展開，暴露出更多的胃蛋白酶作用位點，促進胃蛋白酶消化；蛋白質過度氧化導致蛋白質聚集，使得胃蛋白酶的作用位點減少，抑制胃蛋白酶消化。Chen等[12]研究丙二醛氧化修飾對大豆分離蛋白體外消化率影響時發(fā)現(xiàn)，丙二醛氧化大豆分離蛋白形成的聚集體是導致氧化大豆分離蛋白體外消化率下降的原因。研究[5,7]發(fā)現(xiàn)新鮮米糠較長時間的貯藏(5 d和10 d)可導致米糠蛋白形成氧化聚集體，米糠蛋白氧化聚集體主要由二硫鍵結合，少量非二硫鍵的共價鍵也參與米糠蛋白氧化聚集體的形成。由此可見，在新鮮米糠貯藏的前期，米糠酸敗程度和米糠蛋白氧化程度都較低，適度氧化導致米糠蛋白結構展開，有利于胃蛋白酶酶解；在米糠貯藏的后期(5 d和10 d)，米糠酸敗程度和米糠蛋白氧化程度都較高，米糠蛋白氧化形成的共價交聯(lián)氧化聚集體使得胃蛋白酶作用位點減少，從而抑制胃蛋白酶的酶解。

2.2 米糠貯藏時間對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化進程的影響(見圖1)

圖1 米糠貯藏時間對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化進程的影響

由圖1可知，米糠蛋白體外模擬消化進程中，OD280變化趨勢與Bax等[9]研究氧化豬肌原纖維蛋白體外胃蛋白酶模擬消化進程變化趨勢相似。為了更好地表征胃蛋白酶消化進程，引入擬合指數(shù)曲線方程：

1/OD=1/ODmax×eβ(1/t)

式中：ODmax為消化完全時穩(wěn)定的最大OD；β為描述曲線形狀的系數(shù)。

參考Bax等[9]研究，引入半衰期(t1/2)表征達到0.5倍ODmax所需的消化時間，半衰期由方程推導而得：

t1/2=β/ln2

以半衰期對應的OD280計算初始消化速率。以米糠貯藏10 d為例，擬合曲線如圖2所示，不同貯藏時間下的擬合曲線參數(shù)見表2。

圖2 貯藏10 d時米糠蛋白體外胃蛋白酶消化擬合曲線

貯藏時間/d1/ODmaxODmaxβt1/2/minR204．580．21814．3420．690．9614．270．23413．9620．140．9733．690．27113．3419．250．9854．680．21414．1220．370．99106．750．14814．7021．210．99

由表2可知，隨著米糠貯藏時間的延長，ODmax的變化趨勢與消化率一致，最大值出現(xiàn)在新鮮米糠貯藏3 d。半衰期隨米糠貯藏時間的延長先下降后上升，且大致位于20 min左右，與Bax等[9]研究胃蛋白酶消化進程的半衰期落在20 min左右結果相似。

米糠貯藏時間對米糠蛋白體外胃蛋白酶初始消化速率的影響如圖3所示。

注：圖中不同字母表示在Plt;0.05水平上差異顯著。

圖3米糠貯藏時間對米糠蛋白體外胃蛋白酶初始消化速率的影響

由圖3可知，隨著米糠貯藏時間的延長，米糠蛋白初始消化速率先增大后減小。在米糠貯藏初期，半衰期逐漸減小，初始消化速率逐漸增大，兩者均在米糠貯藏3 d時達到極值，分別為19.25 min和0.381 h-1。Bax等[9]研究熱處理對豬肌原纖維蛋白體外胃蛋白酶消化進程的影響時發(fā)現(xiàn)，隨著熱處理溫度的升高，豬肌原纖維蛋白氧化程度增加，豬肌原纖維蛋白在胃蛋白酶中的初始消化速率先增大后減小，當熱處理溫度超過100℃時，初始消化速率、半衰期和ODmax逐漸趨于穩(wěn)定，并認為適度熱處理引發(fā)的適度氧化使得蛋白質暴露出更多的疏水區(qū)域，提高胃蛋白酶催化效率；過度熱處理引發(fā)的蛋白質過度氧化可形成蛋白質共價交聯(lián)聚集體，從而抑制胃蛋白酶的消化。在新鮮米糠貯藏的前期，米糠酸敗程度不高，米糠蛋白適度氧化后有利于暴露出更多的疏水區(qū)域，增加胃蛋白酶酶解位點，使得初始消化速率上升、半衰期下降，提高了胃蛋白酶酶解速率，促進了米糠蛋白的消化；在米糠貯藏的后期(5 d和10 d)，米糠酸敗程度急劇增加，米糠蛋白劇烈氧化后形成大量的共價交聯(lián)氧化聚集體，掩蓋了米糠蛋白氧化初期暴露的胃蛋白酶位點，使初始消化速率下降、半衰期上升，從而減緩胃蛋白酶消化進程，抑制了米糠蛋白的消化。

米糠貯藏時間對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物抗氧化性的影響見表3。

表3 米糠貯藏時間對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物抗氧化性的影響

由表3可知，隨著米糠貯藏時間的延長，米糠蛋白在胃蛋白酶酶解90 min后產物的抗氧化性先上升后下降，并且各項抗氧化性指標均在米糠貯藏3 d時最佳。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質氧化可降低大豆分離蛋白體外消化產物的抗氧化性，并認為氧化修飾形成蛋白質氧化聚集體是造成大豆蛋白消化產物抗氧化性下降的原因。Zhou等[10]研究氧化亞油酸濃度對豬肌原纖維蛋白體外消化產物抗氧化性的影響時發(fā)現(xiàn)，隨著氧化亞油酸濃度增加，豬肌原纖維蛋白氧化程度加深，而豬肌原纖維蛋白體外消化產物自由基吸收能力先上升后下降，并認為輕微氧化使蛋白質結構展開，暴露出更多抗氧化性好的氨基酸，有助于消化產物抗氧化性的提升；過度氧化不僅會造成蛋白質形成共價聚集體，還會帶來氨基酸損失，尤其是擁有良好抗氧化性的氨基酸，從而極大降低消化產物的抗氧化性。由此可見，米糠貯藏期間，米糠蛋白消化產物抗氧化性的變化主要取決于米糠蛋白氧化后結構的變化。在新鮮米糠貯藏的前期(1、3 d)，米糠酸敗程度較低，適度氧化導致米糠蛋白結構展開，有利于胃蛋白酶消化產物抗氧化性的增加；在米糠貯藏的后期(5 d和10 d)，米糠酸敗程度較高，米糠蛋白氧化程度加深，進一步形成共價交聯(lián)氧化聚集體，將適度氧化后米糠蛋白結構展開的優(yōu)勢掩蓋，使得胃蛋白酶消化產物抗氧化性降低。

還原能力是評估抗氧化劑提供氫或電子的能力。在新鮮米糠貯藏期間，米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物的還原能力先上升后下降，在米糠貯藏3 d時，還原能力達到最大值。在新鮮米糠貯藏的前期(1、3 d)，米糠酸敗程度較低，米糠蛋白適度氧化后結構展開，提升了米糠蛋白提供電子的能力，有利于胃蛋白酶消化產物還原能力的增加；在米糠貯藏的后期(5 d和10 d)，米糠酸敗程度較高，米糠蛋白過度氧化后形成共價交聯(lián)氧化聚集體，使米糠蛋白提供電子的能力下降，從而降低米糠蛋白胃蛋白酶消化產物的還原能力。

3 結 論

將新鮮米糠在室溫下貯藏0、1、3、5、10 d，穩(wěn)定化和脫脂后得到不同酸敗程度的米糠，并以此制備不同氧化程度的米糠蛋白，通過體外胃蛋白酶消化，研究米糠貯藏時間對米糠蛋白消化性質及消化產物抗氧化性的影響。結果發(fā)現(xiàn)：隨著米糠貯藏時間的延長，米糠毛油酸值和過氧化值迅速升高，米糠蛋白的胃蛋白酶消化率、初始消化速率以及消化產物的抗氧化性都先上升后下降，且均在貯藏3 d時達到最佳。表明新鮮米糠的短期貯藏可一定程度上改善米糠蛋白的消化性質和消化產物的抗氧化性，有助于米糠蛋白營養(yǎng)品質的提升；但長期貯藏對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化有顯著的負面影響，貯藏10 d后米糠蛋白體外胃蛋白酶消化率、初始消化速率以及消化產物的抗氧化性已顯著低于新鮮米糠，極大地降低了米糠蛋白的營養(yǎng)品質和利用價值。

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Effectsofricebranstoragetimeoninvitropepsindigestibilityofricebranproteinandantioxidantactivityofricebranproteinhydrolysates

HE Liyuan, WU Wei, WU Xiaojuan, FU Xuheng, LIN Qinlu

(National Engineering Laboratory for Rice and By-Product Deep Processing, College of Food Science and Engineering, Center South University of Forestry and Technology, Changsha 410004，China)

rice bran storage; rice bran protein; protein oxidation; in vitro digestibility; antioxid-ant activity

TS210.9;TQ932

A

1003-7969(2017)11-0070-05

2017-02-02；

2017-07-20

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303071)；糧油深加工與品質控制2011湖南省協(xié)同創(chuàng)新項目(湘教通[2013]448號)；國家自然科學基金面上項目(31771918)

何莉媛(1992)，女，碩士研究生，研究方向為糧油加工(E-mail)hly9271@163.com。

通信簡介：吳 偉，副教授，博士(E-mail)foodwuwei@126.com。