夏紅飛，陳志榮，賓毅，高峰，黃家風*

（石河子大學農(nóng)學院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室，新疆 石河子 832003）

大麗輪枝菌微菌核形成的影響因素研究

夏紅飛，陳志榮，賓毅，高峰，黃家風*

（石河子大學農(nóng)學院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室，新疆 石河子 832003）

為了研究大麗輪枝菌微菌核形成的影響因素及其與微菌核形成相關基因之間的關系，本研究通過微菌核形態(tài)觀察、重量測定及形成相關基因的表達測定，對不同溫度、光照、營養(yǎng)及寄主根系誘導條件下，棉花大麗輪枝菌V592菌株微菌核的形成進行了分析。結果表明：以PDA為基質(zhì)，26℃比22℃更有利于微菌核形成；連續(xù)黑暗的條件比自然光及連續(xù)光照更有利于微菌核形成；營養(yǎng)豐富的全營養(yǎng)PDA培養(yǎng)基比半營養(yǎng)PDA及水瓊脂平板更有利于微菌核形成；棉花根系及其提取物對微菌核的形成具有促進作用。通過qRT-PCR對7個微菌核形成相關基因的表達量進行測定，結果顯示，溫度、光照及營養(yǎng)條件改變后12 h，7個基因在26℃時的表達量明顯高于22℃時的表達量，6個基因在黑暗中的表達量明顯高于連續(xù)光照條件下的表達量，6個基因在全營養(yǎng)中的表達量明顯高于營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基中的表達量，表明大麗輪枝菌微菌核的產(chǎn)量與溫度、光照和營養(yǎng)條件改變后12 h各基因的表達量密切相關。而寄主根系對微菌核形成相關基因的表達在12 h時有短暫的抑制作用，但是48 h后各基因不斷被誘導表達。以上結果表明大麗輪枝菌微菌核的產(chǎn)量與微菌核形成相關基因的誘導表達密切相關。

大麗輪枝菌；微菌核；影響因素；基因表達

大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）是一種土壤傳播的植物病原真菌，通過根部侵染宿主微管組織引發(fā)植物黃萎病。其寄主范圍廣泛，危害200多種經(jīng)濟作物，成為世界性的嚴重植物病害[1]。大麗輪枝菌侵染寄主時，在植物體內(nèi)會形成由許多厚壁細胞組成的黑色近球形、長條形或不規(guī)則形的微菌核。依賴于這種休眠體結構，大麗輪枝菌能夠在土壤或者宿主殘體中存活10年以上[2]，土壤中微菌核的數(shù)量直接決定寄主的發(fā)病程度[3]。因此，了解大麗輪枝菌微菌核形成的影響因素及分子調(diào)控機理對深入研究黃萎病防治策略具有重要意義。

對于大麗輪枝菌微菌核形成的分子調(diào)控機理研究，目前已鑒定了多個基因與微菌核形成有關。VDH1基因編碼一個疏水蛋白，當VDH1基因敲除嚴重影響微菌核的形成[4-6]。VMK1和VdSNF1基因分別編碼細胞絲裂原活化蛋白（MAP）激酶和蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶，VMK1突變導致大麗輪枝菌微菌核形成明顯減少[7]，VdSNF1基因敲除導致大麗輪枝菌微菌核形成明顯減少[8]。VdGARP1基因編碼1個富含谷氨酸的蛋白，該基因突變后引起大麗輪枝菌微菌核形成延遲、致病力下降；在營養(yǎng)缺乏的條件下，該基因表達促進大麗輪枝菌從腐生階段進入微菌核形式的休眠階段[9]。而VdPR3基因敲除造成大麗輪枝菌微菌核形成完全受阻[6]。與上述4個基因不同的是，VdPKAC1和VGB分別是cAMP依賴信號途徑和G蛋白介導的信號途徑中的2個關鍵基因，分別敲除后能使大麗輪枝菌產(chǎn)生更多的微菌核[10-11]。綜上所述，微菌核形成可能是一個復雜的受很多基因交叉調(diào)控的過程，在這個基因網(wǎng)絡中，基因之間通過相互作用，顯著影響微菌核的形成。

黃萎病的發(fā)生主要是由土壤中的微菌核萌發(fā)所引起，大量研究表明，土壤中的溫度、濕度、pH和有機質(zhì)含量影響大麗輪枝菌微菌核的存活力和萌發(fā)率[12-15]，但對于微菌核形成因素研究的報道較少。Tjamos等[16]發(fā)現(xiàn)，棉花大麗輪枝菌18-30℃下2-5 d可形成微菌核；5℃下30 d才形成；32℃以上不形成微菌核，白應文等[17]研究表明，在基礎改良培養(yǎng)基（BMM）上，pH值為 9.5-11.5、溫度為 20℃時最有利于棉花黃萎病菌產(chǎn)生微菌核。對于不同的營養(yǎng)條件以及光照等因素是否對大麗輪枝菌微菌核形成有影響，以及不同條件下與微菌核形成相關基因的表達情況如何，目前尚不明確。為此，本研究以棉花黃萎病落葉型強致病力菌株V592為研究對象，通過從基因水平分析營養(yǎng)條件和環(huán)境條件對微菌核相關基因表達及微菌核形成進行研究，以期從微菌核形成的角度探索黃萎病防治的奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株棉花黃萎病落葉型強致病力菌株V592由本實驗室分離、純化、鑒定和保存。供試棉花根系所用的棉花品種為軍棉一號（cv.Junmian No.1），由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 溫度對微菌核形成的影響

將 200 μL（1×107cfu/mL）V592 孢子懸浮液均勻涂布在鋪有玻璃紙的PDA平板上，置于26℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，待孢子長出菌絲后，再分別轉(zhuǎn)至4、22、26、30、37℃的培養(yǎng)箱，每個溫度處理設 3個重復。在溫度條件改變后的第5天，拍照記錄微菌核形成情況，然后將玻璃紙上的微菌核刮至稱量紙上稱重，室溫過夜后，稱其晾干后的重量。

1.2.2 光照對微菌核形成的影響

將 200 μL（1×107cfu/mL）V592 孢子懸浮液均勻涂布在鋪有玻璃紙的PDA平板上，置于26℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，待孢子長出菌絲后，再分別置于連續(xù)光照、連續(xù)黑暗以及自然光條件下培養(yǎng)，在光照條件改變后的第5天，拍照記錄微菌核的形態(tài)。每個處理3個重復。

1.2.3 營養(yǎng)條件對微菌核形成的影響

將 200 μL（1×107cfu/mL）V592 孢子懸浮液分別均勻涂布在鋪有玻璃紙的PDA平板上，在26℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，待孢子萌發(fā)長出菌絲后，再將玻璃紙分別轉(zhuǎn)至全營養(yǎng)PDA（常規(guī)PDA培養(yǎng)基）平板上、半營養(yǎng) PDA平板（無菌水1 L，瓊脂 15 g，馬鈴薯100 g，葡萄糖7.5 g）上和水瓊脂平板（無菌水1 L，瓊脂15 g）上。于26℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，在營養(yǎng)條件改變后的第5天，拍照記錄微菌核的形態(tài)，并測定微菌核的濕重和干重。每個處理3個重復。

1.2.4 寄主對微菌核形成的影響

1.2.4.1 根提取物的制備

取棉花根15 g，用粉碎機粉碎，再用液氮磨碎，加入70 mL去離子水混勻，將混合物置于25℃搖床 150 r/min 振蕩 1 h，6000 r/min離心 10 min，然后將上清液用定性濾紙進行過濾。為保證根系提取物中的活性成分不被破壞，濾出液采用0.22 μm的無菌濾膜進行過濾除菌，碎根殘體121℃滅菌20 min，將除菌后的濾液及碎根殘體保存于-20℃冰箱備用[18]。

1.2.4.2 菌株的誘導培養(yǎng)

將上述植物碎根以20 g/L的比例加入PDA培養(yǎng)基中，高壓滅菌，溫度冷卻至55℃時加入100 mL上述無菌根系濾液，制備添加了棉花根系及提取物的 PDA（CPDA）平板。先將 200 μL（1×107cfu/mL）V592孢子懸浮液均勻涂布在鋪有玻璃紙的PDA平板上，置于26℃培養(yǎng)48 h，待孢子萌發(fā)長出菌絲后，再將玻璃紙轉(zhuǎn)至CPDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)條件改變后第5天，拍照記錄微菌核形成情況，測定微菌核的濕重和干重。每個處理3個重復。

1.2.5 與微菌核形成相關基因表達量的測定

將上述各條件下培養(yǎng)的菌株，分別在培養(yǎng)條件改變后的12、48 h和第5天用Trizol法分別提取菌株總 RNA；cDNA第一條鏈的合成按照 M-MLV First Strand Kit系統(tǒng)進行，然后用作qRT-PCR模板。在目標基因外顯子區(qū)域設計引物（表1）進行qRT-PCR。

表1 qT-PCR所用引物Tab.1 Primers used for qT-PCR

反應程序為94℃ 30 s，60℃ 30 s，72 ℃15 s，45個循環(huán)。以β-tubline基因（DQ266153）作為內(nèi)參基因。根據(jù)相對表達法計算不同條件下與微菌核形成相關基因的表達水平。引物設計使用 Primer premier 5進行，由華大基因公司合成。

2 結果與分析

2.1 溫度對微菌核形成的影響

由圖1A可見，在22和26℃條件下，棉花黃萎病菌均產(chǎn)生大量黑色微菌核，4和30℃條件下僅有極少量微菌核產(chǎn)生，而在37℃的條件下無微菌核產(chǎn)生。26℃條件下微菌核的濕重和干重均明顯高于比22℃條件下的微菌核（圖1B），表明26℃更有利于微菌核形成。由圖1C可知，溫度條件改變12 h時，7個基因在26℃時的表達量均比在22℃時高，其中VDH1、VdPR3和VdGARP1基因在26℃時的表達量分別是22℃時的100、50和25倍，VGB和VMK1基因在26℃時的表達量是22℃時的12.5倍。溫度條件改變48 h時，7個基因26與22℃的表達量比值均明顯下降，其中VdPKAC1、VGB和VdPR3基因在22℃的表達量反而高于26℃時的表達量。溫度條件改變后的第5天，7個基因26與22℃的表達量比值更小，為0.36-2.78，表明7個基因在26℃的表達量與22℃的表達量差異減小。

以上結果說明，26℃的溫度條件更有利于微菌核形成及相關基因的表達，其表達量主要取決于溫度條件改變后12 h的表達量。

圖1 不同溫度條件對大麗輪枝菌V592微菌核形成的影響Fig.1 Effect of different temperature condition onV.dahliaemicrosclerotial development

2.2 光照對微菌核形成的影響

由圖2可見，連續(xù)黑暗的條件更有利于大麗輪枝菌產(chǎn)生黑色微菌核，自然光照的條件只能產(chǎn)生極少量的微菌核，連續(xù)光照的條件不能促使大麗輪枝菌產(chǎn)生微菌核。

圖2 不同光照條件下V592菌株形成的微菌核形態(tài)圖Fig.2 Microsclerotial morphology of V592 strain under different illumination

對大麗輪枝菌中7個微菌核形成相關基因在連續(xù)黑暗與連續(xù)光照條件下的相對表達量進行比較，結果（表2）顯示，光照條件改變后的12 h，除了VdPR3基因外，其他6個基因在黑暗中的表達量均比在連續(xù)光照條件下的表達量高，其表達量比值范圍為1.3-11.0，其中VdGARP1和VGB基因在黑暗中的表達量分別是光照條件下的11和7.7倍。光照條件改變后的48 h，除了VdSNF1和VdPR3基因依然保持原有的表達趨勢外，其它5個基因的表達都發(fā)生了劇烈變化，逆轉(zhuǎn)為光照下的表達量高于黑暗中的表達量，其中變化最大的是VdGARP1和VGB基因，連續(xù)光照下的表達量分別是黑暗中的10.2和7.0倍。在光照條件改變后的第5天，只有VdPKAC1和VGB基因的表達回復為黑暗條件下的表達量高于光照條件。

表2 V592菌株7個基因在連續(xù)黑暗與連續(xù)光照下相對表達量的比值Tab.2 Fold changes in relative transcript abundance of seven genes involved in microsclerotial development in V592 strain under different illumination

以上結果說明，光照明顯影響微菌核的形成及相關基因的表達，微菌核的產(chǎn)量可能與光照條件改變后12 h微菌核形成相關基因的表達量密切相關。連續(xù)光照48 h微菌核形成相關基因即使表達量劇增也不能促使大麗輪枝菌產(chǎn)生更多的微菌核。

2.3 營養(yǎng)條件對微菌核形成的影響

由圖3A可見，3種營養(yǎng)條件均可使大麗輪枝菌產(chǎn)生微菌核。微菌核稱重結果（圖3B）顯示，全營養(yǎng)培養(yǎng)基上微菌核產(chǎn)生最多，其次為半營養(yǎng)培養(yǎng)基，水瓊脂平板上形成的微菌核最少，說明營養(yǎng)豐富更有利于微菌核形成。對7個基因在全營養(yǎng)條件與半營養(yǎng)條件下的相對表達量進行比較，由圖3C可見，營養(yǎng)條件改變12 h時，除了VdPR3基因外，其他6個基因在全營養(yǎng)中的表達量均比在半營養(yǎng)中的表達量高，其中VDH1基因全營養(yǎng)/半營養(yǎng)的比值高達50倍；營養(yǎng)條件改變后的48 h，除VMK1基因外，其它6個基因的表達均發(fā)生明顯變化，其中VdPKAC1、VGB和 VdSNF1基因在半營養(yǎng) PDA上的表達量反而高于在全營養(yǎng)PDA上的表達量；營養(yǎng)條件改變后的第5天，從全營養(yǎng)/半營養(yǎng)的比值來看，VdPR3基因表達發(fā)生逆轉(zhuǎn)，VdPKAC1、VGB和VdSNF1基因表達回復到全營養(yǎng)中的表達量高于半營養(yǎng)中的表達，7個基因在全營養(yǎng)中的表達量均比在半營養(yǎng)中的表達量高。

對7個基因在全營養(yǎng)條件與水瓊脂作為營養(yǎng)條件的相對表達量進行比較，結果（圖3D）顯示，營養(yǎng)條件改變12 h時，除了VdPKAC1基因外，其他6個基因在全營養(yǎng)中的表達量均比在水瓊脂中的表達量高，其中VdGARP1基因在全營養(yǎng)中的表達量是水瓊脂中的20倍，VMK1和VGB基因在全營養(yǎng)中的表達量均是水瓊脂中的11倍；營養(yǎng)條件改變48 h時，除了VDH1基因的表達變化不大外，其他5個基因的表達均發(fā)生明顯變化，其中VGB、VdSNF1和VdPR3基因在水瓊脂中的表達量反而高于在全營養(yǎng)PDA上的表達量；營養(yǎng)條件改變后的第5天，從全營養(yǎng) /水瓊脂的比值來看，VGB、VdSNF1和 VdPR3基因表達回復到在全營養(yǎng)中的表達量高于在水瓊脂中的表達，除了VDH1基因外，其他6個基因在全營養(yǎng)中的表達量均比在水瓊脂中的表達量高。

以上結果說明，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)條件更有利于微菌核的形成，微菌核的產(chǎn)量與營養(yǎng)條件改變后12 h微菌核形成相關基因的表達量密切相關，營養(yǎng)條件改變后的48 h，雖然營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)條件誘導了微菌核形成相關基因的表達，但并不影響大麗輪枝菌最終的菌核量。

圖3 不同營養(yǎng)條件對大麗輪枝菌V592微菌核形成的影響Fig.3 Effect of different nutrient condition onV.dahliaemicrosclerotial development

2.4 寄主根系對微菌核形成的影響

由圖4A可見，在PDA和CPDA平板上均能產(chǎn)生大量的黑色微菌核，濕重和干重的稱重結果（圖4B）顯示，棉花根系誘導產(chǎn)生的微菌核比對照產(chǎn)生的微菌核多，由此說明棉花根系能促進大麗輪枝菌微菌核的形成。7個基因的相對表達量的比較結果（圖4）顯示，棉花根系誘導培養(yǎng)12 h（圖4C），從PDA/CPDA的比值來看，除了VdPR3基因外，其它6個基因在PDA上的表達量均比在CPDA上的表達量高，其中VDH1、VMK1和VdGARP1基因在PDA上的表達量分別是CPDA上的14.3、25和25倍。誘導培養(yǎng)48 h（圖4D），除了VMK1和VdGARP1基因外，其它5個基因（VDH1、VdPKAC1、VGB、VdSNF1 和 VdPR3）的表達發(fā)生逆轉(zhuǎn)，在CPDA上的表達量高于在PDA上的表達量，并且這種狀況一直持續(xù)到誘導培養(yǎng)的第5天，大部分基因 （VDH1、VGB、VdPR3、VMK1 和 VdGARP1）在CPDA上的表達量依然高于在PDA上的表達量。該結果表明，寄主根系對微菌核形成相關基因的表達在最初的12 h有短暫的抑制作用，但是隨著培養(yǎng)時間的延長，與微菌核形成相關基因不斷被誘導表達。

圖4 寄主根系對大麗輪枝菌V592微菌核形成的影響Fig.4 Effect of cotton root induction condition onV.dahliaemicrosclerotial development

3 討論與結論

（1）本研究通過分析溫度對棉花大麗輪枝菌微菌核形成的影響，結果表明26℃最有利于微菌核形成，22℃次之，4和30℃條件下僅有極少量微菌核產(chǎn)生，37℃的條件下無微菌核產(chǎn)生。這與Tjamos等[16]的研究結果一致，棉花大麗輪枝菌18-30℃下2-5 d可形成微菌核；5℃下30 d才形成；32℃以上不形成微菌核。本研究通過qRT-PCR對7個微菌核形成相關基因的相對表達量進行測定，結果顯示，大麗輪枝菌在改變溫度條件培養(yǎng)12 h時，7個基因在26℃時的表達量明顯高于22℃時的表達量；48 h及5 d后，7個基因在26℃的表達量與22℃的表達量差異減少。這表明改變溫度條件培養(yǎng)12 h時，26℃的溫度條件更有利于微菌核形成相關基因的表達，這與26℃條件下產(chǎn)生了更多的微菌核的結果一致。

（2）通過分析光照對棉花大麗輪枝菌微菌核形成的影響，結果表明，連續(xù)黑暗的條件有利于大麗輪枝菌產(chǎn)生黑色微菌核，自然光只能產(chǎn)生極少量的微菌核，連續(xù)光照的條件不能使大麗輪枝菌產(chǎn)生微菌核。Tjamos等[16]的研究表明，白光和紫外光抑制或延遲微菌核形成[16]，與本研究結果一致。Gao等[9]的研究表明，在近紫外光下VdGARP1基因隨著時間的延長表達量逐漸增加，14 d后表達量明顯高于黑暗條件下的表達量，但是明顯延遲和抑制微菌核的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，棉花大麗輪枝菌在連續(xù)光照12 h時，包括VdGARP1基因在內(nèi)的6個微菌核形成相關基因的相對表達量明顯低于連續(xù)黑暗條件下的表達量；連續(xù)光照48 h及5 d后，大部分基因（包括VdGARP1基因）的表達量逆轉(zhuǎn)為光照下的表達量高于黑暗中的表達量，表現(xiàn)出隨著光照時間的延長表達量逐漸增加的趨勢，與Gao等[9]研究結果一致，但是光照抑制微菌核產(chǎn)生與微菌核形成相關基因表達量之間的互作機制還需進行深入解析。

（3）通過分析營養(yǎng)條件對棉花大麗輪枝菌微菌核形成的影響，結果表明，營養(yǎng)豐富的全營養(yǎng)PDA培養(yǎng)基更有利于微菌核形成，其次為半營養(yǎng)PDA培養(yǎng)基，水瓊脂平板上形成的微菌核最少。白英文等[16]的研究表明，BM培養(yǎng)基中葡萄糖的用量減半，可使大麗輪枝菌的微菌核產(chǎn)生量提高3.7倍。本研究將馬鈴薯及葡萄糖含量減半?yún)s不能提高微菌核產(chǎn)量，其原因可能與BM和PDA兩種基本培養(yǎng)基所含的碳源種類不同有關。Klimes等[5]的研究表明，VDH1基因分別在缺葡萄糖和缺硝酸鈉的培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，其表達量均明顯高于對照[5]。本研究發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)條件改變后的第5天，VDH1基因在水瓊脂上的表達量比在全營養(yǎng)PDA上表達量高，表現(xiàn)出營養(yǎng)缺乏更促進其表達的趨勢，與Klimes等[5]的研究結果一致。

（4）通過分析寄主根系對棉花大麗輪枝菌微菌核形成的影響，結果表明，寄主根系能促進大麗輪枝菌微菌核的形成。棉花根系及其提取物對大麗輪枝菌微菌核形成相關基因的表達在最初的12 h具有短暫的抑制作用，但是在48 h至第5天，大多數(shù)微菌核形成相關基因不斷被誘導表達。Gao等[9]研究表明，VdGARP1基因受寄主根系誘導后，其表達量是隨著誘導時間延長而不斷增加，與本研究結果一致。

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Influence factors on microsclerotial formation inVerticillium dahliae

Xia Hongfei,Chen Zhirong,Bin Yi,Gao Feng,Huang Jiafeng*
(College of Agriculture,Shihezi University/Key Laboratory at Universities of Xinjiang Uygur Autonomous Region for Oasis Agricultural Pest Management and Plant Protection Resource Utilization,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

This research aimed to analyze influence factors on microsclerotial development inVerticillium dahliaeand the correlation between influence factors and the transcript levels of seven genes involved in microsclerotial formation.Effects of different temperature,illumination and nutrient condition on microsclerotial development inV.dahliaeisolate V592 from infected cotton were measured by morphologic observation and weight of microsclerotia.The results showed that V592 produced more microsclerotia under 26℃ than under 22℃,more microsclerotia under continuous dark than under natural light and continuous illumination,and more microsclerotia on full nutrition PDA medium than on half of nutrition PDA medium and on agar medium.V592 produced more microsclerotia on PDA medium with cotton root extract than on PDA medium,indicating that microsclerotial production by V592 was stimulated by cotton root.The transcript levels of seven genes involved in microsclerotial formation in V592 were determined by qRT-PCR.When the temperature,illumination and nutrition conditions were changed,the transcript levels of seven genes were higher under 26℃than under 22℃during the first 12 hours;the transcript levels of six genes were higher under continuous dark than under continuous illumination,and the transcript levels of six genes were higher on full nutrition PDA medium than on half of nutrition PDA medium and on agar medium,indicating that microsclerotial production by V592 was associated with transcript levels of genes involved in microsclerotial formation within 12 hours.The transcript of six genes within 12 hours were suppressed transiently by cotton root extract,but transcript of genes involved in microsclerotial formation after 48 hours were induced continuously by cotton root extract.In conclusion,microsclerotial production byV.dahliaewas associated with inducible expression of genes involved in microsclerotial formation.

Verticillim dahliae;microsclerotium;influence factor;gene expression

S435.62

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.05.016

1007-7383(2017)05-0618-07

2017-04-13

國家自然科學基金項目（31160351、31560494、31460451）

夏紅飛（1992-），女，碩士研究生，專業(yè)方向為植物病理學，e-mail:1519447477@qq.com。

*通信作者：黃家風（1970-），女，教授，從事分子植物病理學研究，e-mail:jiafeng_huang@163.com。