豬圓環(huán)病毒2型體外刺激豬髖動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄分析

汪偉　胡屹屹　何孔旺　溫立斌　倪艷秀　王小敏　劉傳敏

摘要：通過PCV2病毒感染豬髖動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（PIEC）后炎癥相關(guān)細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化，探討PCV2感染誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生的免疫機(jī)制。將PCV2病毒體外接種PIEC，感染不同時(shí)間后，收集樣品，熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β、IL-8及IL-18 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果顯示，PCV2感染PIEC后，對(duì)促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-18及趨化因子IL-8主要起上調(diào)表達(dá)作用。由此推測(cè)細(xì)胞因子在體內(nèi)的綜合效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致PCV2感染早期機(jī)體產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng)，并趨化中性粒細(xì)胞，引發(fā)機(jī)體免疫抑制，影響機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，為PCVD的發(fā)病創(chuàng)造條件。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；豬髖動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞；炎癥相關(guān)細(xì)胞因子；熒光定量PCR；mRNA轉(zhuǎn)錄分析；免疫機(jī)制；促炎癥細(xì)胞因子

中圖分類號(hào)： S8582853文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0032-03[

收稿日期：2016-11-16

基金項(xiàng)目：國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（編號(hào)：201303046）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（14）2045]；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)-重大成果培育類[編號(hào)：ZX（15）1003]。

作者介紹：汪偉（1988—），男，安徽廬江人，碩士，助理研究員，主要從事獸用生物制品研究。Tel：（025）84391226；E-mail：weiwang054@126com。

通信作者：何孔旺，研究員。E-mail：kwh2003@263net。

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，為無囊膜、單鏈負(fù)股DNA病毒，于1982年由Tischer等首次發(fā)現(xiàn)[1]，是目前發(fā)現(xiàn)最小的病毒之一，病毒顆粒直徑為12～23 nm[2]，其中豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）對(duì)豬群具有致病性。目前，PCV2已成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)最重要的疾病之一，是豬圓環(huán)病（PCVD）的主要病原[3]。PCV2單獨(dú)感染豬群很少引起臨床發(fā)病[4]，而使豬群處于亞臨床感染狀態(tài)[5]；臨床上常與豬呼吸與繁殖綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）及豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）混合感染[6-7]。

在PCVD中PCV2影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能的發(fā)揮，從而產(chǎn)生免疫抑制[8]，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。在PMWS豬中存在肉芽腫性炎癥和多核巨細(xì)胞，表明細(xì)胞因子分泌及其他免疫相關(guān)信號(hào)分子在該過程中發(fā)揮著重要作用。目前，在基因、蛋白水平上，通過在體內(nèi)體外研究發(fā)現(xiàn)PCV2感染后對(duì)各種細(xì)胞因子產(chǎn)生影響，特別是炎癥相關(guān)細(xì)胞因子如IL-1β、IL-8、IL-18、TNF-α等，以及免疫調(diào)節(jié)因子IL-10、IFN-γ等；PCV2與其他病原共感染后對(duì)組織細(xì)胞的細(xì)胞因子也產(chǎn)生影響。通過PCV2對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生影響的研究，來闡明PCV2感染對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響及引起免疫抑制的相關(guān)機(jī)理。

PCV2感染豬體后，可引起病毒血癥[10]；PCV2在血液內(nèi)通過血液循環(huán)與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，并引起血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，極少量的細(xì)胞因子即可在體內(nèi)發(fā)揮重要的免疫作用。因此，研究PCV2與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用引起的細(xì)胞因子變化具有重要的意義。本研究旨在探討PCV2病毒感染豬髖動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（pig iliac endothelial cells，PIEC）后對(duì)部分炎癥相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響。

1材料與方法

11試劑與儀器

1640細(xì)胞培養(yǎng)液（Invitrogen公司），豬髖動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（PIEC）（中國科學(xué)院生化細(xì)胞所細(xì)胞庫），2×SYBR Premix Ex Taq（大連TaKaRa公司），細(xì)胞RNA提取試劑盒（北京天恩澤科技公司），DNase Ⅰ（大連TaKaRa公司），5×qRT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Biouniquer Technology公司）、ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

12病毒

PCV2病毒為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自行分離并鑒定，并在 PK-15細(xì)胞體外傳代58代后收獲的細(xì)胞毒，間接免疫熒光法（IFA）測(cè)定其TCID50為10-625 mL。

13PIEC的培養(yǎng)

PIEC培養(yǎng)于含10%血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，長至單層細(xì)胞。將已長滿單層的細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為50×105 mL）接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔 2 mL。置37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h。

14病毒感染細(xì)胞

將6孔板上的細(xì)胞用1640培養(yǎng)液（無血清）清洗2次后，每孔接種病毒液2000 μL，補(bǔ)加1640維持液（5%血清）18 mL，共3個(gè)重復(fù)。另3孔只加20 mL 1640維持液（5%血清），作為細(xì)胞因子自然轉(zhuǎn)錄對(duì)照組。置37 ℃、5% CO2下分別作用24、48、72、96 h。

15細(xì)胞總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

在各時(shí)間點(diǎn)分別取出細(xì)胞板，按細(xì)胞RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，得到的RNA按照DNase Ⅰ說明書進(jìn)行基因組去除，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。200 μL 反轉(zhuǎn)錄體系：5×qRT SuperMix 40 μL，總RNA 80 μL，RNase free ddH2O 80 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：250 ℃ 10 min，420 ℃ 30 min，850 ℃滅活5 min。獲得cDNA，置 -20 ℃ 冰箱備用。

16熒光定量PCR法檢測(cè)樣品各細(xì)胞因子的cDNA拷貝數(shù)

用已經(jīng)建立好的檢測(cè)各細(xì)胞因子（IL-1β、IL-18、IL-8）的熒光定量PCR方法[11]檢測(cè)各細(xì)胞因子的cDNA拷貝數(shù)。Real-time PCR經(jīng)優(yōu)化，250 μL反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex Taq 125 μL，上、下游引物（10 μmolL）各 05 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）05 μL，cDNA模板 10 μL，ddH2O 100 μL。最佳反應(yīng)程序：950 ℃ 30 s；950 ℃ 5 s，600 ℃ 34～60 s（表1），40個(gè)循環(huán)。每一循環(huán)結(jié)束時(shí)讀取熒光信號(hào)，總循環(huán)結(jié)束后，加入熔解曲線分析步驟。將各細(xì)胞因子基因的拷貝數(shù)除以同1樣本中β-actin基因的拷貝數(shù)，獲得1個(gè)相對(duì)比值，即為細(xì)胞因子mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。endprint