王文靜，吳 巧，葛曉春

(1. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438；2. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

擬南芥多聚ADP-核糖化修飾蛋白的富集和鑒定

王文靜1,2，吳 巧1,2，葛曉春1,2

(1. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438；2. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

多聚ADP-核糖化修飾[poly(ADP-ribosyl)ation, PARylation]是一種可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，該修飾由多聚ADP-核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]催化．多聚ADP-核糖化修飾蛋白主要在動物中發(fā)現(xiàn)，在植物中少有報(bào)道．微生物來源的蛋白質(zhì)AF1521具有一個能結(jié)合多聚ADP-核糖[poly(ADP-ribose), PAR]的macro結(jié)構(gòu)域(macro domain)，其突變蛋白AF1521-G42E失去了結(jié)合PAR的活性．我們利用AF1521蛋白對PAR的親和作用來富集擬南芥中的PARylation蛋白質(zhì)底物并進(jìn)行質(zhì)譜分析，同時用AF1521-G42E作為富集過程的負(fù)對照．通過這種方法，我們得到多個ADP-核糖化修飾相關(guān)蛋白，并對其中一個蛋白GRP7進(jìn)行了驗(yàn)證．

AF1521； 擬南芥； AF1521-G42E； 多聚ADP-核糖化

多聚ADP-核糖化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，它調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的一系列生理生化過程，如DNA修復(fù)[1-2]、轉(zhuǎn)錄調(diào)控[3]、染色質(zhì)重塑[4]、細(xì)胞死亡[5]、細(xì)胞周期進(jìn)行[6]、RNA剪切[7]、胞內(nèi)運(yùn)輸[8]、蛋白質(zhì)降解[9]等．在植物中，多聚ADP-核糖化修飾則與多種生物與非生物脅迫應(yīng)答過程有關(guān)，例如抗病反應(yīng)、干旱、高溫、強(qiáng)光、氧化等非生物脅迫反應(yīng)[10-11]．

PAR修飾由多聚ADP-核糖聚合酶PARP催化[12]．PARP與斷裂DNA結(jié)合后被激活，催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NAD+)中帶負(fù)電荷的ADP-核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，PARP的反復(fù)催化使得靶蛋白上形成直鏈或帶有支鏈的多聚ADP-核糖分子，靶蛋白電化學(xué)性質(zhì)發(fā)生巨大改變[12-13]．靶蛋白上的PAR能夠被多聚ADP-核糖糖苷水解酶[poly(ADP-ribose)glycohydrolase, PARG]降解[14]．除酵母外，真核生物中都有多個PARP蛋白．?dāng)M南芥中有3個： PARP1、PARP2和PARP3[15]，其中PARP1和PARP2已被證明具有催化活性，它們被斷裂DNA激活后首先進(jìn)行自我ADP-核糖化修飾，形成PAR鏈，然后通過PAR鏈募集與之結(jié)合的蛋白并將PAR鏈轉(zhuǎn)移到靶蛋白上[16]．

到目前為止，被多聚ADP-核糖化修飾的蛋白質(zhì)多在動物中被發(fā)現(xiàn)，植物中除了PARP本身及其個別底物外，被報(bào)道的修飾蛋白質(zhì)很少．動物中PAR修飾底物主要包括組蛋白、PARP自身、腫瘤抑制因子p53、泛素連接酶、染色質(zhì)重塑相關(guān)酶、DNA連接酶等[17]．除了被PAR修飾的蛋白質(zhì)外，還有一些蛋白可與PAR結(jié)合，已知的PAR結(jié)合蛋白大多具有以下結(jié)構(gòu)域： macro域、PAR-結(jié)合鋅指(PBZ)、WWE域、PAR-結(jié)合基序(PBM)、FHA域或BRCT域等[17-19]．其中，macro域能夠識別PAR的末端ADP-核糖殘基，主要存在于組蛋白變體、PARP、PARG、染色質(zhì)重塑相關(guān)酶中[20]．大部分PAR結(jié)合蛋白也是PAR修飾的底物蛋白，底物蛋白首先結(jié)合到PAR上，然后PARP將PAR轉(zhuǎn)移到底物蛋白上．

關(guān)于動物中PARylation蛋白的篩選，目前已有多篇報(bào)道，他們利用的方法主要有以下幾種： 利用親和蛋白富集PAR相關(guān)蛋白[21-22]；標(biāo)記底物分子，檢測帶有相關(guān)信號的靶蛋白[23]；根據(jù)PAR結(jié)合結(jié)構(gòu)域保守序列利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行預(yù)測分析[24].植物中的研究進(jìn)展較慢，直到2016年，才有了第一篇報(bào)道，他們用擬南芥蛋白芯片的方法將10048個擬南芥蛋白進(jìn)行體外PARylation反應(yīng)，最后得到54個可能的PARP2的底物[25]，這個方法盡管較為直接，但對實(shí)驗(yàn)條件的要求較高，本實(shí)驗(yàn)室則采用另一種方法，即利用親和蛋白富集并結(jié)合MS分析的方法，來獲取PAR相關(guān)蛋白.

AF1521蛋白來源于嗜熱菌Archaeoglobusfulgidus，是macro域超家族中最簡單的分子，可以結(jié)合PAR，其大小約為22kDa[20]，能夠富集PAR底物蛋白以及PAR結(jié)合蛋白，其突變體AF1521-G42E為第42位的甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?，失去了結(jié)合PAR的能力．在動物中，已成功利用AF1521富集了多種ADP-核糖化相關(guān)蛋白[21-22]，但植物中尚未有過嘗試．本研究中，我們利用AF1521對擬南芥體內(nèi)的PAR修飾蛋白進(jìn)行富集實(shí)驗(yàn)(pull-down)并進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到一些PAR相關(guān)的蛋白，對其中一個進(jìn)行了驗(yàn)證，為深入了解多聚ADP核糖化修飾在植物體內(nèi)的功能奠定了基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株與質(zhì)粒

擬南芥(Arabidopsisthaliana)突變體parg1為Columbia生態(tài)型背景．將種子用70%乙醇消毒后，播撒在1/2 MS培養(yǎng)基上，并置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為： 22℃，光照16h/黑暗8h循環(huán).2周后幼苗用zeocin(Invitrogen公司)處理24h，收集材料液氮速凍待用．質(zhì)粒擴(kuò)增大腸桿菌：E.coliDH5α；原核表達(dá)大腸桿菌：E.coliOrigami(DE3)；中間載體： PCR-bluntⅡ；原核表達(dá)載體： pET-32a(+)、pGEX-4T-1；pET-32a(+)-AtPARP1；pGEX-4T-1-AF1521、pGEX-4T-1-G42E(初始AF1521以及AF1521-G42E編碼序列來自Ladurner實(shí)驗(yàn)室，參見其文章[21])．

pGEX-4T-1-GRP7(用帶有BamHⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物GRP7-BamHⅠ(5′-GGATCCATG-GCGTCCGGTGATGTTG-3′)和GRP7-SalⅠ(5′-GTCGACTTACCATCCTCCACCACCACC-3′)擴(kuò)增cDNA，回收大小正確的條帶，用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)連接到StuⅠ酶切后的PCR-bluntⅡ載體中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，挑取單菌落搖菌并抽提質(zhì)粒，測序．得到正確質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切，與帶有BamHⅠ和SalⅠ酶切粘性末端的pGEX-4T-1載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落并抽質(zhì)粒，酶切鑒定．

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)表達(dá)

將蛋白質(zhì)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliOrigami(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后將菌落刮至液體LB，37℃、220r/min搖至OD600為0.6～0.8時加入IPTG至終濃度0.2mmol/L．之后16℃繼續(xù)培養(yǎng)16h．離心收集菌體，重懸后用超聲波儀破碎，取上清SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)．

1.2.2 植物總蛋白抽提

在液氮中研磨zeocin處理的植物材料20g，加入4℃預(yù)冷的30mL裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，5mmol/L MgCl2，100mmol/L NaCl，1mmol/L DTT,10% Glycerol，0.1% NP40，cocktail 蛋白酶抑制劑)，冰上抽提20min，然后4℃，12000×g離心取上清．

1.2.3 蛋白質(zhì)親和富集PAR結(jié)合蛋白

將表達(dá)AF1521以及AF1521-G42E蛋白的菌體各200mL用PBS緩沖液重懸，超聲破碎后離心取上清，菌液上清各與30μL Glutathione Sepharose(Amersham Bioscience公司)室溫旋轉(zhuǎn)孵育30min(介質(zhì)使用前用PBS清洗3次)．孵育后用PBS清洗3次．向植物總蛋白抽提物中加入外源NAD+至1mmol/L，超聲斷裂的擬南芥總DNA 500nmol/L，室溫孵育20min以激活PARP活性，提高蛋白質(zhì)底物的多聚ADP-核糖化修飾程度．在孵育后的蛋白質(zhì)樣品中加入結(jié)合了AF1521-G42E的Glutathione Sepharose介質(zhì)，再次室溫旋轉(zhuǎn)孵育1h，之后離心取上清，然后再與結(jié)合了AF1521的介質(zhì)室溫孵育1h，用PBS清洗介質(zhì)3次，流程如圖1所示．

圖1 pull-down流程Fig.1 Procedure of pull-down experiments植物材料破碎后，可溶性蛋白首先與結(jié)合了GST-AF1521-G42E的介質(zhì)孵育去除非特異性蛋白，再與結(jié)合了GST-AF1521的介質(zhì)孵育以富集PAR結(jié)合蛋白，然后利用質(zhì)譜分析pull-down的蛋白質(zhì)．

1.2.4 Western blot分析

向pull-down實(shí)驗(yàn)后的介質(zhì)中加入1×SDS-PAGE樣品緩沖液，煮沸10min后離心取上清，取5 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后轉(zhuǎn)至PVDF膜上．轉(zhuǎn)膜后，用少量TBST緩沖液(20mmol/LTris-HCl pH7.5, 150mmol/L NaCl, 0.05% Tween 20)清洗2次，5%牛奶封閉1h，PAR抗體(Abcam公司)室溫孵育1h，TBST緩沖液洗滌4次，各10min，此后二抗室溫孵育1h，TBST洗滌4次，各5min，最后利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(CLiNX公司，上海)進(jìn)行熒光信號分析．

1.2.5 LC-MS/MS分析

pull-down所得到的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，待考馬斯亮藍(lán)染料進(jìn)入分離膠約1cm停止電泳，染色，然后割膠進(jìn)行質(zhì)譜分析．質(zhì)譜分析由復(fù)旦大學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的蛋白質(zhì)分析平臺提供技術(shù)服務(wù)，利用LTQ-Orbitrap Elite質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific，德國)完成．

1.2.6 GRP7與PARP1以及自我修飾的PARP1互作驗(yàn)證

利用PBS緩沖液重懸?guī)в衟GEX-4T-1空載體或pGEX-4T-1-GRP7表達(dá)載體的宿主菌E.coliOrigami(DE3)，超聲破碎，12000×g，4℃離心，取上清，分別與Glutathione Sepharose介質(zhì)室溫輕柔旋轉(zhuǎn)孵育30min，使得GST和GST-GRP7結(jié)合到介質(zhì)上，然后PBS洗滌3次，將介質(zhì)用于pull-down實(shí)驗(yàn)．結(jié)合了GST tag的介質(zhì)可作為結(jié)合了GST-GRP7介質(zhì)的對照．超聲破碎轉(zhuǎn)化了pET-32a(+)空載體和pET-32a(+)-AtPARP1表達(dá)載體的宿主菌E.coliOrigami(DE3)，12000×g，4℃離心取上清．表達(dá)PARP1的菌液上清分作兩部分，一部分用于PARP1的激活，在上清中加入終濃度為1mmol/L的NAD+，以及500nmol/L的斷裂DNA，室溫溫育10min；另一部分加入抑制PARP1活性的3-AB(3-Aminobenzamide)抑制劑．此后，帶有GST以及GST-GRP7的介質(zhì)先與表達(dá)His tag的pET-32a(+)空載體菌液上清室溫孵育1h，PBS洗滌后一部分介質(zhì)取樣，另一部分則分別與激活以及未激活的PARP1菌液上清室溫孵育1h．兩種孵育后的介質(zhì)用PBS洗滌4次，然后所有取樣的介質(zhì)等量在SDS-PAGE上樣緩沖液中煮沸，離心后電泳，進(jìn)行Western blot分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 GST-AF1521的原核表達(dá)

微生物來源的AF1521蛋白具有macro域，能夠特異性結(jié)合PAR末端的ADP-核糖殘基(圖2)，其突變蛋白AF1521-G42E失去了結(jié)合活性．我們將AF1521基因及突變基因AF1521-G42E分別連入pGEX-4T-1表達(dá)載體，并在宿主菌E.coliOrigami(DE3)中表達(dá)，得到大量帶有GST標(biāo)簽的AF1521蛋白以及突變蛋白AF1521-G42E(圖3(a)，見第406頁)，并且Glutathione Sepharose純化后的重組蛋白中雜蛋白較少(圖3(b))．

圖2 AF1521蛋白能夠識別PAR末端ADP-核糖殘基(方框表示macro domain識別位點(diǎn))Fig.2 AF1521 protein can recognize the terminal ADP-ribose residue of PAR(The box indicates the recognition site of macro domain)

圖3 GST-AF1521以及GST-AF1521-G42E重組蛋白表達(dá)及純化產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression and purified products of GST-AF1521 and GST-AF1521-G42E(a) 重組蛋白表達(dá); 1,3為IPTG誘導(dǎo)前蛋白; 2,4為IPTG誘導(dǎo)后蛋白; 1,2為GST-AF1521; 3,4為GST-AF1521-G42E. (b) 純化后蛋白; 1. GST-AF1521; 2. GST-AF1521-G42E．

2.2 AF1521富集PAR相關(guān)蛋白

將蛋白GST-AF1521及GST-AF1521-G42E結(jié)合在GST親和介質(zhì)上，同時抽提經(jīng)過zeocin處理的parg1突變體總蛋白．突變體parg1是PARG1基因的T-DNA插入突變體，其中PARG1基因突變，PARG1活性喪失，不能水解PAR，從而可使得體內(nèi)的PAR修飾蛋白質(zhì)水平升高[26]，有利于PAR修飾蛋白質(zhì)的富集；zeocin為基因斷裂劑，zeocin處理可誘導(dǎo)體內(nèi)PARP1以及PARP2的表達(dá)水平升高并激活其活性，也使得細(xì)胞內(nèi)的PAR修飾蛋白增多．此外，我們在提取植物蛋白后加入PARP活性的限速底物NAD+，以便潛在的PAR修飾蛋白不會因受到NAD+量的限制而失去激活的可能性．利用結(jié)合了突變蛋白AF1521-G42E的介質(zhì)去除一些可能產(chǎn)生非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，同時也對該介質(zhì)上結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，以作為野生型AF1521蛋白所pull-down到的蛋白質(zhì)的對照．利用PAR抗體進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明AF1521相對于對照AF1521-G42E確實(shí)富集了大量被PAR修飾的蛋白(圖4(a))．其中包括了ADP-核糖化修飾的PARP2(圖4(b))．此后，將富集的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳并割膠進(jìn)行LC-MS/MS分析，得到PAR相關(guān)蛋白(表1)，一共有14個蛋白質(zhì)特異性存在于AF1521拉下的蛋白質(zhì)譜中而沒有出現(xiàn)在突變體AF1521-G42E蛋白富集的蛋白質(zhì)中．

圖4 Western blot分析pull-down結(jié)果Fig.4 Western blot analysis of the pull-down results(a) 一抗為PAR抗體;(b) 一抗為PARP2抗體;星號表示PARP2條帶.

其中多個蛋白屬于細(xì)胞內(nèi)高豐度的蛋白或者是與代謝有關(guān)的酶，如At1g12900.2(3-磷酸甘油醛脫氫酶,GAPDH)、At5g38410.2(核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶)、At3g03780.1(甲硫氨酸合成酶)，這些蛋白質(zhì)可能自身被修飾，也可能因某種原因而被富集．而其他一些蛋白質(zhì)，不屬于組成性存在的蛋白質(zhì)，它們是At3g09840.1(CDC48A)、At2g21660.2(GRP7)、At5g20010.1(RAN1)、At1g02740.1(MRG1)．特別是這些蛋白均存在于細(xì)胞核中，與負(fù)責(zé)PAR修飾的PARP主要位于細(xì)胞核中、大部分PAR修飾蛋白均屬于細(xì)胞核蛋白的預(yù)期相符．當(dāng)然，macro域也能夠結(jié)合單ADP-核糖殘基，但由于植物中尚未發(fā)現(xiàn)單-ADP核糖化催化酶，我們也采用了體內(nèi)孵育以提高蛋白質(zhì)底物多聚ADP-核糖化修飾程度的實(shí)驗(yàn)條件，因此，本實(shí)驗(yàn)所富集到的蛋白主要為多聚ADP-核糖相關(guān)蛋白，但不排除有單ADP-核糖化相關(guān)蛋白的可能．

表1 質(zhì)譜結(jié)果Tab.1 The results of LC-MS/MS

圖5 GST-GRP7重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the expression proteins of E.coli1,4分別為16℃時，誘導(dǎo)后的可溶蛋白與不溶蛋白；2,5分別為37℃時，誘導(dǎo)后的可溶蛋白與不溶蛋白；3.IPTG誘導(dǎo)前蛋白；星號表示GST-GRP7條帶．

2.3 蛋白GST-GRP7的誘導(dǎo)表達(dá)

質(zhì)譜鑒定到的蛋白質(zhì)中，GRP7(表1中At2g21660.2)是已經(jīng)證實(shí)的單ADP-核糖化的底物[27]，推測GRP7也有可能被多聚ADP核糖化修飾，因此我們進(jìn)一步擴(kuò)增了擬南芥中GRP7的cDNA并構(gòu)建帶有GST tag的載體pGEX-41-1-GRP7，在不同條件下表達(dá)目標(biāo)蛋白，通過SDS-PAGE電泳比較細(xì)菌裂解液上清與沉淀中GST-GRP7蛋白含量．結(jié)果表明，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37℃，誘導(dǎo)時間為2.5h時，上清中有較多的目的蛋白(圖5)．

2.4 GRP7與PARP1及被PAR修飾的PARP1體外互作驗(yàn)證

GRP7有可能發(fā)生多聚ADP核糖化修飾、或者結(jié)合PAR修飾蛋白，我們將GST-GRP7與His-PARP1孵育，以觀察GST-GRP7是否可能被PARP1修飾，但未得到預(yù)期結(jié)果．原因有可能是GRP7沒有被PAR修飾而僅僅被單ADP核糖化修飾，或者實(shí)驗(yàn)條件不合適以至于不能觀察到被PAR修飾的GRP7．GRP7被AF1521富集的另一個原因也有可能是它通過結(jié)合PAR或者被PAR修飾的蛋白從而被富集．我們檢測了GRP7與PARP1以及被PAR修飾的PARP1的結(jié)合活性，Western blot結(jié)果顯示，GRP7與PARP1以及發(fā)生自我修飾的PARP1有相互作用(圖6(a))，且GRP7與PARP1的互作明顯強(qiáng)于與自我修飾的PARP1的互作(圖6(b))．PAR修飾使得PARP1帶有大量負(fù)電荷，改變了PARP1的帶電性從而可能減弱了GRP7與PARP1的互作．

圖6 GRP7與PARP1以及自我修飾的PARP1體外互作驗(yàn)證Fig.6 GRP7 associates with PARP1 and activated PARP1 in vitro(a) Anti-His抗體雜交結(jié)果，黑色星號表示PARP1條帶;(b) Anti-GST抗體雜交結(jié)果，黑色和白色星號分別表示GST和GST-GRP7．

3 討 論

在富集多聚ADP核糖化修飾蛋白時，PARP1和PARP2是植物體內(nèi)已知的可被多聚ADP-核糖化修飾的蛋白，它們可以進(jìn)行自我修飾連上多聚ADP-核糖鏈，因此，如果我們所采用的方法可行的話，應(yīng)該能在富集到的底物中發(fā)現(xiàn)PARP1和PARP2，它們可作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的內(nèi)參．

通過對比野生型AF1521蛋白與突變體蛋白AF1521-G42E分別作為餌(bait)時拉下的蛋白質(zhì)譜，排除那些同時出現(xiàn)的蛋白質(zhì)，從質(zhì)譜結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)PARP1以及PARP2確實(shí)被野生型AF1521蛋白特異性富集，說明該方法富集PAR相關(guān)蛋白的方法是可行的．pull-down實(shí)驗(yàn)中得到的蛋白可能是PAR修飾或結(jié)合蛋白，也可能是與這些蛋白質(zhì)互作的蛋白．我們進(jìn)一步選取了GRP7進(jìn)行體外驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)GRP7與PARP1以及自我修飾的PARP1都可互作，但GRP7與PARP1的互作明顯強(qiáng)于與被修飾的PARP1的互作，說明PAR修飾可能抑制了GRP7與PARP1的互作，PAR修飾可能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的相互作用．GRP7是hnRNP-like的富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白，能夠調(diào)控pre-mRNA的剪切，還能夠直接結(jié)合pri-miRNAs從而阻礙它們的加工[28]．PARP1如何參與GRP7的調(diào)控，值得進(jìn)一步研究．

質(zhì)譜分析得到的蛋白中，RAN1是一種小的GTPase，參與核內(nèi)外物質(zhì)運(yùn)輸，可能參與細(xì)胞周期調(diào)控[29]．CDC48A是一種Ⅱ型AAA-ATPase，對于細(xì)胞分裂、增殖、分化有著至關(guān)重要的作用[30]．MRG1是MRG家族的染色質(zhì)重塑因子[31]．已知在動物中，PAR修飾確實(shí)參與了細(xì)胞周期調(diào)控、RNA的剪切以及表觀遺傳學(xué)調(diào)控[4,6-7]．我們推測植物中PAR修飾確有可能通過與不同蛋白質(zhì)互作來參與調(diào)控這些過程．此外，突變體grp7、mrg1mrg2及多聚ADP-核糖水解酶缺失的突變體parg1都具有早花表型[31-33]；而RAN1的過表達(dá)則是晚花的[29]，這可能意味著PAR修飾可能參與調(diào)控開花．

在動物中，Poirier實(shí)驗(yàn)室也用該方法富集到了95個蛋白質(zhì)[22]，其中也包括了PARP蛋白，其他還包括RAD50、XRCC1、MSH3蛋白，這些都與DNA損傷響應(yīng)有關(guān)，但在我們富集到的蛋白質(zhì)中，未發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)的存在，可能是因?yàn)楸痉椒╬ull-down的靈敏度還不夠，只富集到了少部分高豐度的PAR相關(guān)蛋白，又或者在植物中，PARP調(diào)節(jié)生理過程的分子機(jī)制與動物中有差異，這些蛋白質(zhì)被修飾狀態(tài)存在時間可能很短．但是，在動、植物中共同富集到了GAPDH、actin、cell division cycle protein等，說明在動、植物中，這些蛋白質(zhì)可能具有相同的多聚ADP核糖化調(diào)節(jié)機(jī)制．另外，我們所得到的蛋白質(zhì)，與2016年Feng等報(bào)道的PARP2的底物蛋白質(zhì)不一樣[25]，他們的方法中并沒有得到植物中已知的多聚ADP核糖化蛋白質(zhì)底物PARP1和PARP2，而在我們的方法中，這兩個蛋白作為內(nèi)參照，確實(shí)被富集，引起差別的原因可能是，我們的方法采用了植物材料進(jìn)行體內(nèi)蛋白的pull-down，而他們采用的是利用蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行體外反應(yīng)的方法．

目前關(guān)于動物的研究報(bào)道中，幾個不同實(shí)驗(yàn)室利用不同方法都篩選到了一些多聚ADP核糖化修飾相關(guān)蛋白，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)．以[32P]-NAD+為底物的體外標(biāo)記PAR相關(guān)蛋白的方法可以較靈敏地檢測到目的蛋白，但是同位素昂貴且操作要求高，該方法未能廣泛使用．Gagne等人用小鼠的單克隆抗體成功富集到PAR相關(guān)蛋白，但是局限性在于單克隆抗體對短鏈的PAR(少于20個核糖殘基)親和性很低[22]．Gagne實(shí)驗(yàn)室還利用失活的PARG-DEAD進(jìn)行pull-down得到了561個PAR結(jié)合蛋白[22]．我們采用的方法相對于單克隆抗體和PARG-DEAD富集方法而言，AF1521表達(dá)量高、蛋白質(zhì)小，容易純化，pull-down流程操作簡單，耗資較少，可操作性較高．

植物中，多聚ADP-糖化修飾參與了晝夜節(jié)律調(diào)控[33]、生物脅迫[34-35]和干旱、氧化脅迫等非生物脅迫調(diào)節(jié)[36-38]．抑制或者沉默PARP可以提高植物對逆境脅迫的抗性[38]，除了催化酶本身外，我們對PARP所修飾的蛋白質(zhì)底物以及它們?nèi)绾握{(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)的功能了解并不多，需要更多的手段來尋找PAR修飾相關(guān)底物從而研究PAR修飾在體內(nèi)的調(diào)節(jié)功能，本研究在這方面提供了有價(jià)值的信息．

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Identificationofpoly(ADP-ribosyl)atedProteinsinArabidopsis

WANGWenjing1,2,WUQiao1,2,GEXiaochun1,2

(1.SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China;2.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

poly(ADP-ribosyl)ation is a type of reversible posttranslational modification catalyzed by enzymes known as poly(ADP-ribose) polymerases(PARP). The protein substrates are mostly found in animals and there are rare reports in plants so far. AF1521 protein originated from microorganism possesses a macrodomain, which can recognize and interact selectively with the terminal residue of poly(ADP-ribose)(PAR), whereas the mutant protein AF1521-G42E loses the PAR-binding activity. In our study, we used AF1521 as a selective bait for enriching poly(ADP-ribosyl)ated protein substrates or proteins that interact with them inArabidopsis. In the meantime, AF1521-G42E was used as a control of the experiment. LC-MS/MS was used to analyze the pull-down proteins. In this way,we identified a couple of possible protein substrates of poly(ADP-ribosyl) ation or proteins that related with poly(ADP-ribosyl)ated proteins, and one protein of them, GRP7, was verified byinvitropull-down assay.

AF1521;Arabidopsis; AF1521-G42E; poly(ADP-ribosyl)ation

0427-7104(2017)04-0403-09

2017-02-06

國家自然科學(xué)基金(31170169,31070232)

王文靜(1990—)，女，碩士研究生；葛曉春，女，教授，通信聯(lián)系人，E-mail: xcge@fudan.edu.cn.

Q943.2

A