吳雄健+鄭虹+朱海燕+毛忠懿+謝軍

[摘要]目的 探討姜黃素對大鼠肝纖維化防治作用的機(jī)制，為臨床治療提供參考。方法 建立CCl4致大鼠實驗性肝纖維化的模型，同時每只大鼠按每100克體重分別給予20、10、5 mg姜黃素進(jìn)行灌胃處理，相應(yīng)設(shè)定為模型給藥組、模型組以及對照組，每組各10只大鼠。比色法檢測血清組織內(nèi)活性氧類物質(zhì)（ROS）水平；丙二醛（MDA）測定試劑盒（TBA法）檢測肝組織MDA含量；凝膠遷移實驗（EMSA）檢測肝組織NF-κB活性；免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中NF-κB表達(dá)、轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族（TGF-β1）、血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）、重組人結(jié)締組織生長因子（CTGF）水平；RT-PCR法檢測肝組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的mRNA水平。并對各組檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果 模型組大鼠的ROS、內(nèi)毒素、MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；模型給藥組大鼠的上述因子水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 姜黃素對血清中ROS及內(nèi)毒素水平，肝組織中MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA表達(dá)均有不同程度的抑制作用，其通過多種機(jī)制參與到預(yù)防肝纖維化的過程中。

[關(guān)鍵詞]姜黃素；大鼠；肝纖維化；肝星狀細(xì)胞；增殖；凋亡

[中圖分類號] R575.204 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）11（c）-0004-03

Study of Curcumin on hepatic stellate cells in rats

WU Xiong-jian1 ZHENG Hong2 ZHU Hai-yan1 MAO Zhong-yi1 XIE Jun1

1.Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China；2.Gannan Medical College，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China

[Abstract]Objective To explore the mechanism of Curcumin on the prevention and treatment of liver fibrosis in rats，so as to provide reference for clinical treatment.Methods The rat model of experimental liver fibrosis induced by CCl4 was established.At the same time，20 mg，10 mg and 5 mg Curcumin were in lavage in every 100 g body weight，the corresponding models were set as delivery model group，model group and control group respectively，10 rats in each group.The level of reactive oxygen species （ROS） in serum was detected by colorimetric method.Malondialdehyde （MDA） content in liver tissue was detected by MDA assay kit （TBA method）.By electrophoretic mobility shift assay （EMSA），the activity of NF-κB in liver tissue was detected.The levels of NF-κB expression，TGF-β1，platelet-derived growth factor-BB （PDGF-BB） and recombinant human connective tissue growth factor （CTGF） in liver tissue were detected by immunohistochemistry.The mRNA level of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in liver tissue was detected by RT-PCR.The results after detection were statistically analyzed.Results In the model group，the levels of ROS，endotoxin，MDA，NF-κB，TGF-β1，PDGF-BB，CTGF and TIMP-1mRNA were significantly higher than those in the normal group，and the differences were statistically significant （P<0.05）.The levels of above-mentioned factors in the delivery model group were all lower than those in the model group， and the differences were statistically significant （P<0.05）.Conclusion Curcumin presents with the inhibition of ROS and endotoxin levels in serum，MDA，NF-κB，TGF-β1，PDGF-BB，CTGF，and TIMP-1 mRNA expression in liver tissue to some extent and participants in the liver fibrosis prevention through a variety of mechanisms.endprint

[Key words]Curcumin；Rat；Hepatic fibrosis；Hepatic stellate cells；Proliferation；Apoptosis

肝纖維化是由多種原因引起的慢性肝損害所致的病理改變，表現(xiàn)為肝內(nèi)細(xì)胞外間質(zhì)成分過度、異常地沉積，并影響肝臟的功能，是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段。肝纖維化的形成和發(fā)生機(jī)制極為復(fù)雜，由于對這種復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制尚未認(rèn)識清楚，故肝纖維化的臨床治療一直未取得突破性進(jìn)展[1]。近年來，中醫(yī)藥在治療肝纖維化方面顯示了廣闊的前景，由于中藥具有多層次、多靶點的綜合藥理作用，對肝纖維化復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制有一定的針對性，已受到廣泛重視。姜黃素是從中藥姜黃根莖中提取的一種酚性色素，具有廣泛的藥理作用，包括抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等，尤其是可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，引起人們的研究興趣[2]。肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的失平衡是肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)，活化肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞外間質(zhì)，抑制其降解，使細(xì)胞外間質(zhì)大量沉積，肝纖維化發(fā)生。抑制其活化和誘導(dǎo)凋亡是治療肝纖維化的重要策略，通過肝星狀細(xì)胞凋亡，去除了細(xì)胞外間質(zhì)的來源，促進(jìn)了細(xì)胞外間質(zhì)的降解，肝纖維化得以恢復(fù)[3-5]。本研究在原有工作基礎(chǔ)上設(shè)想，姜黃素也可能通過誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，進(jìn)而在肝纖維化的治療中發(fā)揮作用，并進(jìn)行實驗研究，以期明確姜黃素抗肝纖維化的作用機(jī)制，為肝纖維化的防治提供新的途徑，現(xiàn)報道如下。

1對象與方法

1.1對象及試劑

雄性成年SD大鼠30只，合格證號：SCXK（渝）2010-2012，180～200 g。姜黃素購自Sigma公司，檢測試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

建立CCl4致大鼠實驗性肝纖維化的模型，同時每只大鼠按每100克體重分別給予20、10、5 mg姜黃素進(jìn)行灌胃處理，相應(yīng)設(shè)定為模型給藥組、模型組以及對照組，每組各10只大鼠。用二氯亞甲基二磷酸鹽處理SD大鼠后，以原位膠原酶灌注結(jié)合密度梯度離心法分離大鼠肝星狀細(xì)胞，并計算細(xì)胞得率和細(xì)胞活力，進(jìn)行細(xì)胞的鑒定和培養(yǎng)。

肝星狀細(xì)胞與姜黃素孵育后，以MTT比色法檢測姜黃素對肝星狀細(xì)胞增殖的影響，用流式細(xì)胞術(shù)分析姜黃素對肝星狀細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，并用流式細(xì)胞術(shù)、透射電鏡和瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡。

比色法檢測血清ROS水平；TBA法檢測肝組織MDA含量；EMSA檢測肝組織NF-κB活性；免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中NF-κB表達(dá)、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF水平；RT-PCR法檢測肝組織TIMP-1的mRNA水平。并對各組檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

MTT比色法操作流程：①收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 μl，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000～1 0000孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。②5%CO2， 37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5～7個梯度，每孔100 μl，設(shè)3～5個復(fù)孔，建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實情況。③5%CO2，37℃孵育16～48 h，倒置顯微鏡下觀察。④每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2～3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。⑤終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。⑥每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。⑦同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。

RT-PCR法操作流程：從細(xì)胞或特定組織中提取總RNA；逆轉(zhuǎn)錄實驗；擴(kuò)增內(nèi)參和目的基因并比較基因表達(dá)差異。檢驗操作所需試劑盒均購自上海居里生物科技有限公司。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

模型組大鼠的ROS、MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。模型給藥組的上述因子水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

3討論

肝星狀細(xì)胞在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中，發(fā)揮了十分重要的作用，研究證實，肝星狀細(xì)胞的增殖與凋亡失衡，為肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)，肝纖維化治療的策略主要是抑制活化、誘導(dǎo)凋亡[6-7]。肝星狀細(xì)胞參與了肝纖維化的啟動，此時肝星狀細(xì)胞會轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，合成大量ECM，在肝臟內(nèi)，ECM會大量沉積，最終誘發(fā)肝纖維化的形成[8]。肝星狀細(xì)胞活化后，會促進(jìn)纖維化的生成，被活化的肝星狀細(xì)胞能夠阻止ECM發(fā)生降解，對肝臟免疫功能也會產(chǎn)生一定程度的影響。有研究結(jié)果提示，在肝損傷后，肝星狀細(xì)胞被激活，大量增殖，同時產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，利用其收縮功能，參與了門靜脈高壓的形成，最終誘發(fā)肝纖維化[9]。因肝星狀細(xì)胞在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中所扮演的重要角色，使得其受到學(xué)者們的高度重視，近幾年，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡在肝纖維化治療研究中，已經(jīng)成為熱點和重點[10]。通過誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，能夠使膠原合成來源減少，有效促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，這對于肝纖維化的恢復(fù)十分有利[11]。

姜黃素是中藥姜黃中所提取出的酚類色素，主要藥理作用是抗氧化、抗炎、降血脂、降血壓、保護(hù)肝功能等[12-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化可產(chǎn)生明顯治療效果[15]。曾有文獻(xiàn)報道，姜黃素不但能夠?qū)Ω涡菭罴?xì)胞增殖進(jìn)行抑制，并誘導(dǎo)死亡，體內(nèi)外實驗中還發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠?qū)Ω涡菭罴?xì)胞由靜止表型向活化表型轉(zhuǎn)化進(jìn)行有效抑制，有效降低活化標(biāo)志物α-SMA表達(dá)水平，體外肝星狀細(xì)胞合成Ⅰ型膠原降低，肝內(nèi)膠原沉積減少，由此可知，姜黃素在體內(nèi)外均能夠?qū)Ω涡菭罴?xì)胞的合成進(jìn)行抑制[16-18]。現(xiàn)階段，肝纖維化的治療尚無特效藥物，目前臨床上應(yīng)用的抗肝纖維化藥物中，或作用不強(qiáng)，或毒性太大，因此臨床應(yīng)用受到明顯限制。姜黃素在應(yīng)用過程中，并未發(fā)生明顯不良反應(yīng)，經(jīng)人體實驗證實，即便是劑量為8 g/d，持續(xù)用藥3個月，也未見患者出現(xiàn)不良反應(yīng)。由此可見，姜黃素在抗肝纖維化治療中，安全有效。endprint

本研究中，以對姜黃素對大鼠肝纖維化防治作用的機(jī)制進(jìn)行分析探討為目的，建立了CCl4誘導(dǎo)肝纖維化的大鼠模型，并展開了分組實驗，對比觀察了模型組、模型加姜黃素組與正常對照組大鼠的ROS、MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA水平，結(jié)果提示，模型組大鼠的ROS、內(nèi)毒素、MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA水平均高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。給予姜黃素干預(yù)后的模型給藥組的上述因子水平均不同程度低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)[19-21]報道結(jié)果類似，由此證實，姜黃素對血清中ROS及內(nèi)毒素水平，肝組織中MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA表達(dá)均有不同程度的抑制作用，其通過多種機(jī)制參與到預(yù)防肝纖維化的過程中。

綜上所述，本研究在動物實驗水平觀察姜黃素抑制肝內(nèi)HSC內(nèi)NF-κB的激活，降低肝組織中TIMP-1的mRNA的表達(dá)水平，減少肝組織中TGF-β1、PDGF、CTGF的表達(dá)，進(jìn)而抑制HSC的活化，達(dá)到預(yù)防肝纖維化的作用，這對于日后研究與實踐均具有重要指導(dǎo)性意義，值得關(guān)注。

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（收稿日期：2017-08-21 本文編輯：孟慶卿）endprint