液體活檢技術(shù)在結(jié)直腸癌精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用與挑戰(zhàn)

楊盈赤 張忠濤

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院普外科，北京 100050)

·消化外科專題·

液體活檢技術(shù)在結(jié)直腸癌精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用與挑戰(zhàn)

楊盈赤 張忠濤*

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院普外科，北京 100050)

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療在腫瘤臨床領(lǐng)域中的廣泛開展，對腫瘤分子生物學(xué)特性進(jìn)行實(shí)時動態(tài)監(jiān)測的需求越來越高。近年來，液體活檢以簡便快捷、微創(chuàng)、實(shí)時、特異性高和克服時空異質(zhì)性等特點(diǎn)在腫瘤臨床診斷與治療中發(fā)揮著越來越重要的價值。本文圍繞液體活檢的兩種主要技術(shù)：循環(huán)腫瘤細(xì)胞和循環(huán)腫瘤DNA檢測技術(shù)的特點(diǎn)，介紹了其在結(jié)直腸癌精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，探討了面臨的挑戰(zhàn)和可行的解決方案。

液體活檢；結(jié)直腸癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；循環(huán)腫瘤DNA

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和精準(zhǔn)醫(yī)療的推進(jìn)，結(jié)直腸癌的治療模式也逐漸發(fā)展為以手術(shù)治療為主的綜合性治療[1]。在這項(xiàng)系統(tǒng)而精細(xì)的“醫(yī)學(xué)工程”中，從組織到細(xì)胞直至分子層面的關(guān)于腫瘤的全方位信息，為早期診斷、用藥指導(dǎo)、術(shù)后監(jiān)測和療效評估等臨床診療環(huán)節(jié)提供了保障。液體活檢(liquid biopsy,LB)作為精準(zhǔn)醫(yī)療新技術(shù)，因其可定性定量檢測腫瘤直接相關(guān)的腫瘤細(xì)胞和DNA，并具有非入侵性、取樣便捷、實(shí)時監(jiān)測等特點(diǎn)，逐步在腫瘤診療中發(fā)揮越來越重要的作用[2]。

其中檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC)和循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是液體活檢中最具代表性的兩種技術(shù)[3]。本文著重介紹液體活檢技術(shù)在結(jié)直腸癌診療中的應(yīng)用進(jìn)展和面臨的挑戰(zhàn)。

1 CTC和ctDNA技術(shù)簡介

CTC是指由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。1869年首次提出循環(huán)腫瘤細(xì)胞的概念[3]。CTC 的分離方法主要有兩類，一是物理學(xué)方法，如依據(jù)細(xì)胞直徑、密度、電荷及可塑性等，采用密度梯度離心法、膜過濾法、介電電泳等方法加以分選；二是免疫學(xué)方法，如基于細(xì)胞抗原表達(dá)、蛋白分泌及侵襲性等，根據(jù)其表面標(biāo)志物如 Ep CAM、CK等實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離富集[4]。分離富集得到的CTC可用于后續(xù)的鑒定分析，根據(jù)不同應(yīng)用目的而選擇不同的鑒定方法，目前臨床應(yīng)用較為成熟的是基于免疫熒光、原位雜交等方法[5]。

ctDNA指來自于腫瘤細(xì)胞的凋亡、壞死或分泌釋放到外周血的游離DNA(circulating free DNA,cfDNA)，因其攜帶了腫瘤的基因變異特征，如突變、插入、缺失、重排、拷貝數(shù)異常和甲基化等，這是檢測ctDNA的理論基礎(chǔ)。ctDNA的檢測可分為定性和定量兩個方面，前者主要檢測血漿中腫瘤特異性基因變異，后者則檢測血漿中ctDNA總量。這兩種方法均可以反映腫瘤的存在和嚴(yán)重程度，但目前ctDNA定性分析在臨床實(shí)踐中應(yīng)用較為成熟，如檢測基因突變、插入、缺失、融合、重排、拷貝數(shù)變異、甲基化、微衛(wèi)星不穩(wěn)定 (microsatellite instability，MSI) 和雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH) 等[6]。

2 CTC檢測在結(jié)直腸癌診療中的應(yīng)用

2.1 輔助診斷

許多研究[7-9]證實(shí)CTC可很好地反映結(jié)直腸癌患者的臨床病理特點(diǎn)并有助于輔助診斷。在臨床診斷階段可充分利用CTC檢測，聯(lián)合影像學(xué)檢查，在傳統(tǒng)TNM分期基礎(chǔ)上，輔助精準(zhǔn)分期，及時了解早期微轉(zhuǎn)移灶存在風(fēng)險，制定更為合理的個體化治療方案。CTC數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否密切相關(guān)，不僅淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的CTC數(shù)量明顯高于非轉(zhuǎn)移性患者，而且與患者是否有腹腔轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性[7]。同時CTC同腫瘤侵犯深度、是否血管侵犯及肝轉(zhuǎn)移等均具有明顯的相關(guān)性[8]。目前，美國癌癥聯(lián)合會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)乳腺癌系統(tǒng)分期中[9]，在臨床和(或)影像學(xué)未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移證據(jù)的情況下，如果在骨髓或循環(huán)血中發(fā)現(xiàn)播散腫瘤細(xì)胞(即CTC)，可作為一個新的M分期(遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移)-cM0(i+)標(biāo)準(zhǔn)，介于M0和M1之間，這種分期是否適合應(yīng)用于結(jié)直腸癌，將來在更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持下會成為指南更新的熱點(diǎn)。

2.2 預(yù)后評價和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測

胃腸道腫瘤中結(jié)直腸癌是首先被食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)適用于CTC檢測判斷預(yù)后[2]，目前關(guān)于CTC與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后相關(guān)性的研究數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他胃腸道腫瘤，多項(xiàng)研究[10-13]證實(shí)了CTC可以對結(jié)直腸癌患者的長期生存進(jìn)行很好的預(yù)判。術(shù)后高CTC數(shù)目明顯升高或持續(xù)升高均提示結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良[10]。對于術(shù)前接受過短期放射治療(以下簡稱放療)的直腸癌患者，雖然術(shù)前CTC水平不能評價預(yù)后，但術(shù)后 7 d的CTC濃度是局部轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)后因子[11]。另外有Meta分析[12]結(jié)果均顯示基線CTC計數(shù)是與結(jié)直腸癌患者無進(jìn)展生存期(progress free survival，PFS) 和總生存期(overall survival，OS)有關(guān)的獨(dú)立預(yù)后因素。目前CTC作為獨(dú)立預(yù)后因子評價結(jié)直腸癌患者生存期已經(jīng)成為一種共識，可以指導(dǎo)其他胃腸道腫瘤的臨床實(shí)踐。

結(jié)直腸癌伴有轉(zhuǎn)移的患者外周血中CTC數(shù)量明顯高于未轉(zhuǎn)移患者和健康志愿者。有研究者[13]發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTC陽性患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)的危險高于術(shù)后病理淋巴結(jié)陽性的患者，而兩者均陽性的患者發(fā)生復(fù)發(fā)的概率明顯增加。也有研究者[14]發(fā)現(xiàn)手術(shù)前后CTC均陰性的結(jié)直腸癌患者無復(fù)發(fā)生存期顯著高于術(shù)前后均陽性的對照組(P=0.000)。一項(xiàng)更加長期的研究[13]結(jié)果顯示，術(shù)前檢測到CTC的患者，其術(shù)后無轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)生存期明顯低于未檢測出 CTC的患者，而術(shù)后數(shù)周內(nèi)患者CTC數(shù)目與無復(fù)發(fā)生存期無顯著相關(guān)性，但術(shù)后 2～3 年內(nèi) CTC數(shù)目與無轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)生存期有相關(guān)性，提示不僅可以利用CTC檢測預(yù)測患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，還可在術(shù)后病程中動態(tài)跟蹤監(jiān)測，指導(dǎo)臨床根據(jù)患者情況及早介入診療等。

2.3 治療效果評估

臨床實(shí)踐中，除了手術(shù)治療方式外，各種治療手段如新輔助放療及化學(xué)藥物治療(以下簡稱放化療)、聯(lián)合化療、靶向治療和生物治療等也成為了結(jié)直腸癌綜合治療的重要組成部分。但不是所有的放化療等輔助治療都有利于延長生存期，如對于放化療無效的患者來說放化療不良反應(yīng)反而影響患者的生存質(zhì)量。Barbazán等[14]研究發(fā)現(xiàn)在治療后，通過常規(guī)影像學(xué)檢查判定為治療有效的患者中，仍有部分CTC陽性，而這部分患者具有較差的長期生存，該研究指出通過CTC的檢測可以鑒別出常規(guī)影像學(xué)檢查無法發(fā)現(xiàn)的對治療抵抗的患者，并且可以及時地給予針對性的治療。

3 ctDNA在胃腸道腫瘤診療中的應(yīng)用

3.1 早期篩查

ctDNA甲基化與早期結(jié)直腸癌腫瘤相關(guān)性的研究[15-17]較多。一項(xiàng)大規(guī)模、多中心、前瞻性結(jié)直腸癌臨床篩查試驗(yàn)[15]從定期行結(jié)腸鏡檢查的患者中招募了超過7 900例志愿者，其中53例檢查發(fā)現(xiàn)患有結(jié)直腸癌，血漿ctDNA中SEPT9基因異常甲基化在無癥狀CRC患者中作為篩查診斷試驗(yàn)的敏感度為48.2%，特異度為91.5%。雖然兩項(xiàng)研究敏感度差別較大，但兩研究均表明ctDNA中SEPT9基因異常甲基化檢測在結(jié)直腸癌篩查或診斷中的價值。但是，目前采用ctDNA檢測技術(shù)對早期患者的診斷依然處于科研探索階段,作為一些熱點(diǎn)突變的初篩和腫瘤組織檢測的補(bǔ)充，更加廣泛的臨床應(yīng)用還需更多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的支持。

3.2 靶向治療指導(dǎo)

以ctDNA中基因變異信息為基礎(chǔ)的腫瘤分子分型能夠極大地方便腫瘤個體化治療的靶點(diǎn)選擇，所以目前ctDNA最直接的臨床應(yīng)用是鑒定特異的基因突變指導(dǎo)靶向治療的選擇。部分對ctDNA的KRAS突變的研究[16-17]表明ctDNA能夠進(jìn)行相關(guān)體細(xì)胞突變分析用于腫瘤分子分型，然后選擇個體化靶向治療。Arena等[16]探索性使用一個能結(jié)合上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)胞外區(qū)域(extracellular domain，ECD) 多個位點(diǎn)的寡克隆抗體 MM-151 治療西妥昔單抗和帕尼單抗耐藥的結(jié)腸癌患者后，檢測 ctDNA發(fā)現(xiàn)EGFR-ECD突變率降低。

靶向藥物的使用往往會面臨著耐藥的出現(xiàn)，而KRAS、BRAF基因突變往往是轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌三線治療原發(fā)抵抗的主要原因。Diaz等[17]選取KRAS野生型的轉(zhuǎn)移性CRC患者，予以帕尼單抗靶向治療，部分患者仍有耐藥發(fā)生，ctDNA檢測發(fā)現(xiàn)，KRAS突變在治療前以低頻亞克隆的形式存在(之前組織未檢出)；隨訪5～6月，該人群中ctDNA中KRAS突變檢出率為38%，同時9例發(fā)生新BRAF突變。研究提示ct DNA檢測可突破組織檢測限制，更好反映腫瘤基因變異全貌。

3.3 預(yù)后評價和動態(tài)監(jiān)測

目前已有研究[15-16，18]證實(shí)ctDNA的突變頻率與結(jié)直腸癌的預(yù)后具有相關(guān)性。Lecomte等[18]對37例結(jié)直腸癌患者生存分析(平均隨訪22個月)，結(jié)果顯示KRAS突變及CDKN2A啟動子超甲基化的陽性患者2年整體生存率僅為48%，而無上述基因變異的患者2年整體生存率可達(dá)100%。研究提示ctDNA中KRAS突變或CDKN2A啟動子超甲基化可能是結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素。

ctDNA半衰期短，僅允許在幾個小時的間隔內(nèi)動態(tài)評估腫瘤狀態(tài)，所以ctDNA檢測可以更加精確地監(jiān)測腫瘤患者治療過程中的腫瘤動態(tài)和負(fù)荷變化。

系統(tǒng)性研究[15-16]顯示，肺癌、結(jié)腸癌等發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移時，ctDNA含量明顯增高。另外，ctDNA中微衛(wèi)星改變也用作監(jiān)測治療反應(yīng)的指標(biāo)和治療后隨訪指標(biāo)，在患者分類和監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)研究中已體現(xiàn)出潛在價值。

4 CTC和ctDNA在結(jié)直腸癌診療中的聯(lián)合應(yīng)用

ctDNA所攜帶的腫瘤基因變異信息較為全面，能克服腫瘤異質(zhì)性問題，并且檢測方法較為統(tǒng)一;而CTC作為完整的細(xì)胞，不僅包含DNA信息，還有RNA、蛋白質(zhì)信息等，而且基于多樣的分析方法，可以在細(xì)胞和亞細(xì)胞層次作分子功能研究，更能全方位揭示腫瘤特征。目前，CTC在腫瘤的臨床應(yīng)用多集中于輔助診斷與預(yù)后判斷，ctDNA則多集中于靶向藥的使用指導(dǎo)及耐藥情況的監(jiān)測；而兩者都與腫瘤負(fù)荷、治療療效、病情進(jìn)展等相關(guān)，因此，兩者相互結(jié)合聯(lián)合應(yīng)用，臨床的指導(dǎo)意義更大，CTC和ctDNA技術(shù)對比見表1。2015年美國臨床腫瘤學(xué)會(American Society of Clinical Oncology，ASCO)會議提出，腫瘤整個疾病周期中，液體活檢CTC與ctDNA應(yīng)當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用的建議，例如，早期CTC檢測到循環(huán)腫瘤細(xì)胞，提示人體內(nèi)可能存在腫瘤細(xì)胞；進(jìn)一步結(jié)合ctDNA基因測序提示可能患有癌癥，就可以經(jīng)傳統(tǒng)影像學(xué)檢測進(jìn)一步確診；然后，新一代測序技術(shù)(new generation of sequencing,NGS)全基因測序提示癌癥特性，并提供對應(yīng)個性化用藥指導(dǎo)，治療后利用CTC進(jìn)行定期的監(jiān)測等具體方案。

5 問題與展望

綜合以上臨床應(yīng)用研究，CTC和ctDNA作為液體活檢的兩個重要組成部分，在結(jié)直腸癌的個體化診療的臨床實(shí)踐的不同階段和方面發(fā)揮著越來越重要的作用。但就像任何一種新生事物一樣，在發(fā)展的初期同樣要面對很多質(zhì)疑和挑戰(zhàn)，還有很多問題需要解決。

首先，技術(shù)層面上，液體活檢檢測技術(shù)方法種類眾多，但是缺乏行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；而臨床中對于任何一項(xiàng)面向患者的檢測技術(shù)，無論在特異度、敏感度和檢測穩(wěn)定性都有較高要求。第二，現(xiàn)有液體檢測收費(fèi)相對比較昂貴，如何不斷改進(jìn)技術(shù)，降低成本，減輕腫瘤患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，仍需要各方面的共同努力。第三，科研層面上，在將液體活檢全面應(yīng)用到臨床的過程中，還有一些科學(xué)問題值得探究，并加以驗(yàn)證，例如液體活檢如何能夠敏感特異的應(yīng)用到腫瘤早期篩查和診斷中；液體活檢在手術(shù)、放化療前后檢測時間點(diǎn)如何設(shè)置更加合理；CTC本身活性狀態(tài)或基因變異情況與患者預(yù)后狀態(tài)的關(guān)系等。

表1 CTC和ctDNA技術(shù)應(yīng)用對比Tab.1 Comparison of using of CTC and ctDNA

NGS: new generation of sequencing;FDA:Food and Drug Administration；CFDA：China Food and Drug Administration；CTC：circulating tumor cell；ctDNA:circulating tumor DNA.

最后，期待通過臨床醫(yī)師、技術(shù)專家和政府部門三方共同推動液體活檢技術(shù)在醫(yī)療臨床實(shí)踐中的應(yīng)用，使每一位腫瘤患者能夠真正在精準(zhǔn)醫(yī)療的時代中享受到個體化診療的益處。

[1] Ryuk J P,Choi G S,Park J S,et al.Predictive factors and the prognosis of recurrence of colorectal cancer within 2 years after curative resection [J].Ann Surg Treat Res,2014,86(3): 143-151.

[2] Ignatiadis M,Lee M,Jeffrey S.Circulating tumor cells and circulating tumor DNA: challenges and opportunities on the path to clinical utility [J].Clin Cancer Res,2015,21(21): 4786-4800.

[3] Lowes L E,Bratman S V,Dittamore R,et al.Circulating tumor cells (CTC) and Cell-free DNA (cfDNA) Work Shop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation [J].Int J Mol Sci,2016,17(9): pii: E1505.

[4] Galatea K,Eleni P,Saad A,et al.Evaluation of isolation methods for circulating tumor cells (CTCs) [J].Cell Physiol Biochem,2016,40: 411-419.

[5] Dive C,Brady G.Snap shot: circulating tumor cells [J].Cell,2017,169(1):176.

[6] Newman A M,Bratman S V,To J,et al.An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage [J].Nat Med,2014,20(5): 548-554.

[7] Wong S C,Chan C M,Mab B,et al.Clinical significance of cytokeratin 20-positive circulating tumor cells detected by a refined immunomagnetic enrichment assay in colorectal cancer patients [J].Clin Cancer Res,2009,15(3): 1005-1012.

[8] Sastre J,Maestro M L,Puente J,et al.Circulating tumor cells in colorectal cancer: correlation with clinical and pathological variables [J].Ann Oncol,2008,19(5): 935-938.

[9] Amin M B,Edge S,Greene F,et al.AJCC cancer staging manual[M].8th.New York: Springer,2017.

[10] Galizia G,Gemei M,Orditura M,et al.Postoperative detection of circulating tumor cells predicts tumor recurrence in colorectal cancer patients [J].J Gastrointest Surg,2013,17 (10): 1809-1818.

[11] Nesteruk D,Rutkowski A,Fabisiewicz S,et al．Evaluation of prognostic significance of circulating tumor cells detection in rectal cancer patients treated with preoperative radiotherapy:prospectively collected material data [J].Biomed Res Int,2014,2014:712827.

[12] Rahbari N N,Aigner M,Thorlund K,et al.Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer [J].Gastroenterology,2010,138(5): 1714-1726.

[13] Van Dalum G,Stam G J,Scholten L F,et al.Importance of circulating tumor cells in newly diagnosed colorectal cancer [J].Int J Oncol,2015,46(3):1361-1368.

[14] Barbazán J,Muinelo-Romay L,Vieito M,et al.A multimarker panel for circulating tumor cells detection predicts patient outcome and therapy response in metastatic colorectal cancer [J].Int J Cancer,2014,135(11): 2633-2643.

[15] Church T R,Wandell M,Lofton-Day C,et al.Prospective evaluation of methylated SEPT9 in plasma for detection of asymptomatic colorectal cancer [J].Gut,2014,63(2): 317-325.

[16] Arena S,Siravegna G,Mussolin B,et al.MM-151 overcomes acquired resistance to cetuximab and panitumumab in colorectal cancers harboring EGFR extracellular domain mutations [J].Sci Translat Med,2016,8(324): 314-324.

[17] Diaz L J,Williams R T,Wu J,et al.The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers [J].Nature,2012,486(7404) : 537-540.

[18] Lecomte T,Berger A,Zinzindohou F,et al.Detection of free-circulating tumor-associated DNA in plasma of colorectal cancer patients and its association with prognosis [J].Int J Cancer,2002,100(5): 542-548.

Clinicalapplicationandchallengeofliquidbiopsyintheprecisionmedicineofcolorectalcancer

Yang Yingchi,Zhang Zhongtao*

(DepartmentofGeneralSurgery,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China)

With the rapid development of precision medicine in cancer，the demand for dynamic monitoring of tumor molecular characteristic has been increased.In recent years,liquid biopsy is currently playing a more and more important role in diagnosis and treatment of cancer in clinical practice due to its convenience,non-invasiveness,high specificity and overcoming temporal-spatial heterogeneity.This review introduces circulating tumor cell (CTC) and circulating tumor DNA (ctDNA) as the most important technique in liquid biopsy,mainly focusing on their technological feature,especially recent research progress in colorectal cancer.Further,the challenge and possible solution are discussed in the clinic application of liquid biopsy.

liquid biopsy;colorectal cancer；circulating tumor cells;circulating tumor DNA

國家科技支撐計劃課題(2015BAI13B)，北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)計劃資助項(xiàng)目(2015-3-005)。This study was supported by National Science and Technology Support Program(2015BAI13B),Beijing Municipal Health System High-level Health Technician Training Program(2015-3-005).

*Corresponding author，E-mail：zhongtaozt@hotmail.com.

時間：2017-12-13 21∶09

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2109.028.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.001]

R735.3

2017-10-16)

編輯 慕 萌