陸 躍 劉建紅 趙 暉 常佳慧 相陽陽 張秋霞*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069;2北京火箭軍醫(yī)院,北京 100840)

·基礎(chǔ)研究·

侯氏黑散對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)導(dǎo)向因子及RhoGTP酶的影響

陸 躍1劉建紅2趙 暉1常佳慧1相陽陽1張秋霞1*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069;2北京火箭軍醫(yī)院,北京 100840)

目的探討侯氏黑散對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)導(dǎo)向因子Netrin-1/DCC和分子開關(guān)Rac1/Cdc42/RhoA表達(dá)的影響。方法采取線栓法制備永久性大腦中動(dòng)脈栓塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMACO)模型。大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、侯氏黑散小劑量組、侯氏黑散中劑量組、金納多組。運(yùn)用Western blotting法和RT-PCR法檢測術(shù)后7d大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)Netrin-1、DCC、Rac1、Cdc42、RhoA蛋白和基因的表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，侯氏黑散中劑量組、金納多組大鼠Netrin-1蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.01)，侯氏黑散中劑量組大鼠Netrin-1基因的表達(dá)升高(P<0.05)；侯氏黑散小劑量組、侯氏黑散中劑量組、金納多組大鼠DCC、Rac1、Cdc42蛋白和基因的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；侯氏黑散小劑量組、侯氏黑散中劑量組、金納多組大鼠RhoA蛋白和基因的表達(dá)則明顯下降(P<0.01)。結(jié)論侯氏黑散通過對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)導(dǎo)向因子Netrin-1/DCC和分子開關(guān)Rac1/Cdc42/RhoA的調(diào)節(jié)促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能的修復(fù)。

腦缺血；侯氏黑散；Netrin-1；DCC；Rac1；Cdc42；RhoA

侯氏黑散是治療腦卒中的第一方?？计浞剿帲饕娠L(fēng)藥和補(bǔ)虛藥兩個(gè)單元組成。此方乃張仲景基于腦卒中“內(nèi)虛邪中”的病機(jī)理論所創(chuàng)制。本課題組[1]的前期研究顯示，侯氏黑散可以減少軸突再生，抑制信號(hào)通路Nogo-A/ NgR及其下游信號(hào)通路RhoA/Rock2的表達(dá)，從而減少腦缺血后軸突的損傷。軸突導(dǎo)向生長是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和有效修復(fù)的核心[2]。因此，腦缺血后激活軸突導(dǎo)向信號(hào)，是促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的關(guān)鍵原因。Netrin-1是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)導(dǎo)向因子，在成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)量低于胚胎期[3-4]。Netrin-1與其受體結(jié)腸癌缺失蛋白(deleted colorectal cancer,DCC)結(jié)合，并進(jìn)一步啟動(dòng)內(nèi)源性分子開關(guān)RhoA /Rac1/Cdc42，可以促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[5-7]。本部分實(shí)驗(yàn)在前期研究[1]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過Western blotting法和RT-PCR法檢測Netrin-1、DCC、Rac1、Cdc42、RhoA蛋白和基因表達(dá)的變化。探討侯氏黑散對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)導(dǎo)向因子Netrin-1/DCC和分子開關(guān)Rac1/Cdc42/RhoA表達(dá)的影響，為侯氏黑散促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及分組

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量320～350 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。大鼠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(京)2010-0020。本實(shí)驗(yàn)通過倫理審核(倫理編號(hào)：AEEI-2016-054)。將76只大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組12只，模型組、侯氏黑散5.25 g/kg組、侯氏黑散10.5 g/kg組以及金納多組各16只。

1.1.2 受試藥物

侯氏黑散由菊花、人參、細(xì)辛、防風(fēng)、白術(shù)、桂枝、干姜、川芎、當(dāng)歸以及茯苓組成。根據(jù)張仲景在《金匱要略》[8]中所記載的侯氏黑散原方劑量比例確定藥物劑量。所有中藥飲片均采購自北京同仁堂藥店。中藥飲片用30%(體積分?jǐn)?shù))乙醇回流提取[5]。采用金納多作為陽性藥，由德國威瑪舒培博士藥廠生產(chǎn)，藥品批號(hào)：5260613。

1.1.3 主要試劑

Netrin-1、DCC、Rac1、Cdc42抗體購自美國Abcam公司；RhoA抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體購自欣博盛生物科技有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司。RNAprepPure Tissue Kit、RNase-Free DNaseⅠ試劑盒、FastQuant RT Kit、SuperRealPreMix Plus、GeneGreen Nucleic Acid Dye、loading buffer、MarkerⅢ購自天根生化科技有限公司；瓊脂糖購自法國Biowest公司；β-巰基乙醇、無水乙醇購自北京化工廠。

1.1.4 主要儀器

電子天平(美國Adrenturer公司)；酶標(biāo)儀(美國Moiecular Devices公司)；臺(tái)式離心機(jī)(德國Sartorius公司)；脫色搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；渦旋混勻器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；超速冷凍離心機(jī)、梯度PCR儀(德國Eppendorf公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國GE Healthcare公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(法國Vilber公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

參照文獻(xiàn)[6]方法將線栓法略加改進(jìn)，制備大鼠腦缺血模型。將大鼠麻醉后仰臥固定，分離并結(jié)扎右側(cè)頸總和頸外動(dòng)脈，在頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈分叉處作一切口，插入尼龍線(直徑0.265 mm)約18 mm，感覺有阻力時(shí)停止進(jìn)線，扎緊動(dòng)脈殘端，縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠麻醉后，僅暴露頸內(nèi)外動(dòng)脈分支，不閉塞大腦中動(dòng)脈。

1.2.2 給藥及取材

假手術(shù)組、模型組灌服與給藥組同體積的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液；侯氏黑散小、中劑量組及金納多組的給藥劑量按體表面積折算，其等效劑量分別為5.25 g/kg、10.5 g/kg和2.8 g/kg。各給藥組于術(shù)后6 h給藥1次，之后每24 h給藥1次。腦缺血7d取腦組織，進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.2.3 Western blotting法檢測Netrin-1、DCC、Rac1、Cdc42、RhoA蛋白

取各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)組織，冰上裂解30 min，4 ℃下10 000 r/min離心20 min，BCA法蛋白定量。每組均取6 μL蛋白樣品進(jìn)行10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)50 min，將PVDF膜放置于5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉中室溫封閉1h，分別加入Netrin-1(兔源，1∶2 000)、DCC(兔源，1∶5 000)、Rac1(兔源，1∶15 000)、Cdc42(兔源，1∶5 000)，RhoA(兔源，1∶15 000)和GAPDH(小鼠源，1∶40 000)一抗中，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗4×5 min后，放入對(duì)應(yīng)的山羊抗兔(IgG，1∶20 000)和山羊抗小鼠(HRP，1∶20 000)二抗中，室溫孵育1 h，TBST漂洗4×5 min次，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。

1.2.4 RT-PCR檢測Netrin-1、DCC、Rac1、Cdc42、RhoA基因

電子天平稱取25～30 mg的大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)組織，勻漿，冰上作業(yè)。使用RNAprepPure Tissue Kit從腦組織提取總RNA。用SoftMax Pro6.2.1軟件檢測樣本在260 nm和280 nm波長下的A值。使用FastQuant RT Kit從總RNA合成cDNA。引物由大連TakaRa公司合成，選擇β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。合成的引物相關(guān)情況見表1。將樣本放入BIO-RAD實(shí)時(shí)熒光定量儀，打開軟件，選擇β-actin作為內(nèi)參。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 15 min變性，95 ℃ 10 s，52 ℃ 31 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。參照文獻(xiàn)[7]分析數(shù)據(jù)，以基因β-actin為內(nèi)參對(duì)照，2-△△Ct(Ct代表循環(huán)閥值)表示Netrin-1、DCC、Rac1、Cdc42、RhoA基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Sequences of primers for RT-PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Netrin-1、DCC蛋白和基因表達(dá)的比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠Netrin-1、DCC蛋白的表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。與模型組大鼠相比，侯氏黑散中劑量組、金納多組大鼠Netrin-1蛋白以及侯氏黑散小劑量組、侯氏黑散中劑量組大鼠DCC蛋白的表達(dá)均顯著上升(P<0.01)，金納多組大鼠DCC蛋白的表達(dá)明顯上升(P<0.05)。

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠Netrin-1、DCC基因的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與模型組大鼠相比，侯氏黑散中劑量組大鼠皮質(zhì)Netrin-1 基因的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；侯氏黑散小、中劑量組以及金納多組大鼠皮質(zhì)DCC基因的表達(dá)顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖 1)。

圖1 侯氏黑散對(duì)腦缺血大鼠皮質(zhì)Netrin-1和DCC表達(dá)的影響Fig.1 Effects of HSHS on Netrin-1 and DCC signaling expression in cortex of pMCAO rats

A：Western blotting results;B：protein level；C：mRNA level;Sham:Sham group;pMCAO: pMCAO group;HSHS：Houshihensan;HSHS5.25: low dose of Houshiheisan；HSHS10.5: middle dose of Houshiheisan;Positive: Ginaton group;#P<0.05，##P<0.01vsSham group；*P<0.05，**P<0.01vspMCAO group.

2.2 各組大鼠Rac1、Cdc42、RhoA蛋白和基因表達(dá)的比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠Rac1、Cdc42蛋白和基因的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，RhoA蛋白和基因的表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與模型組大鼠相比，侯氏黑散小、中劑量組以及金納多組大鼠Rac1、Cdc42蛋白和基因的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，RhoA蛋白和基因的表達(dá)顯著下降(P<0.01)(圖2)。

圖2 侯氏黑散對(duì)腦缺血大鼠皮質(zhì)Rac1、Cdc42和RhoA表達(dá)的影響Fig.2 Effects of HSHS on Rac1,Cdc42 and RhoA signaling expression in cortex of pMCAO rats

A：Western blotting results;B：protein level；C：mRNA level;Sham:Sham group;pMCAO: pMCAO group;HSHS5.25: low dose of Houshiheisan；HSHS10.5: middle dose of Houshiheisan;Positive: Ginaton group.##P<0.01vsSham group；**P<0.01vspMCAO group.

3 討論

侯氏黑散出自東漢·張仲景的《金匱要略》[8]，主治“大風(fēng)四肢煩重，心中惡寒不足”。對(duì)于卒中的病因病機(jī)，唐宋以前的醫(yī)家認(rèn)為是風(fēng)邪外犯，主“內(nèi)虛邪中”之說。分析侯氏黑散，本方主要由風(fēng)藥和補(bǔ)虛藥兩部分藥物組成。風(fēng)藥具有搜剔風(fēng)邪治其標(biāo)的作用，補(bǔ)虛藥可以溫振中陽治其本，侯氏黑散符合“內(nèi)虛邪中”的病因病機(jī)理論。唐宋以降，百家爭鳴，醫(yī)家多從“內(nèi)風(fēng)”角度出發(fā)，提出了“心火暴盛”、“正氣自虛”、“陰虛痰熱”、“氣虛血瘀”、“肝陽上亢”等諸多卒中病的病因病機(jī)學(xué)說[9-10]。與此同時(shí)，基于“外風(fēng)”之說創(chuàng)制的侯氏黑散等方劑逐漸被醫(yī)家摒棄。

清代葉天士[11]提出卒中源于“肝陽偏亢，內(nèi)風(fēng)時(shí)起”，民國·張錫純等基于此提出“肝陽化風(fēng)”。馬萌[9]認(rèn)為卒中的本質(zhì)是氣機(jī)病，肝陽上亢，肝升太過，肺降不及，腑氣不降，大便不暢。考侯氏黑散，菊花質(zhì)輕而用量獨(dú)重，占全方總重量的四成，是本方的主藥?！独坠谥扑幮越狻穂10]“丹溪云：菊花屬金，而有土于水，大能補(bǔ)陰。宜入肺肝等經(jīng)，……得此補(bǔ)陰，則水盛而火自熄矣。”清代葉天士《本草經(jīng)解》[11]謂菊花“味苦清火，火抑金勝，發(fā)花于秋，其稟秋金之氣獨(dú)全，故為制風(fēng)木之上藥也?！逼甙妗吨兴帉W(xué)》[12]教材中記載菊花“歸肝、肺經(jīng)。功效：疏散風(fēng)熱，平抑肝陽，清肝明目，清熱解毒?！笨傊?，菊花可以清熱平肝，潛陽熄風(fēng)。肝平肺降，則津液得布，腑氣得通。侯氏黑散重用菊花，又假礬石、牡蠣之力，具有平肝熄風(fēng)的作用，不悖于唐宋以后的“內(nèi)風(fēng)”說。

風(fēng)藥一詞，首見于金代張?jiān)氐摹夺t(yī)學(xué)啟源》。其弟子李東垣提出了“高顛之上，惟風(fēng)可到”的理論，進(jìn)一步深化了對(duì)風(fēng)藥的認(rèn)識(shí)[12]。清代徐大椿《神農(nóng)本草經(jīng)百種錄》[13]“凡藥之質(zhì)輕而氣盛者，皆屬風(fēng)藥”，首次提出了風(fēng)藥的概念，將菊花、桂枝等藥納入風(fēng)藥范疇。《本草再新》認(rèn)為桂枝可“溫中行血”，《藥品化義》則謂其可“除肢節(jié)間痰凝血滯”[14]。現(xiàn)代多認(rèn)為卒中病的主要病理產(chǎn)物之一是瘀血，桂枝等風(fēng)藥可溫散瘀血亦可驅(qū)內(nèi)風(fēng)[15]。當(dāng)代研究[16-17]基于臨床實(shí)踐提出了“風(fēng)藥增效”[16]、“風(fēng)藥活血”[17]等理論?，F(xiàn)代藥理研究顯示侯氏黑散可以提高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的表達(dá)，調(diào)控軸突生長抑制因子(Nogo-A)的表達(dá)[5]，激活內(nèi)源性神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)，控制星形膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活[18]，抑制淀粉樣前體蛋白質(zhì)(amyloid presurosor protein,APP)沉積[19]，調(diào)節(jié)腦缺血后炎性反應(yīng)[20]，從而保護(hù)腦缺血后神經(jīng)功能。

銀杏葉制劑有廣泛的腦保護(hù)作用，其作用機(jī)制主要有清除自由基，擴(kuò)張血管，增加腦血流量，改善腦缺血、缺氧，減輕腦水腫，拮抗血小板活化因子，影響神經(jīng)介質(zhì)和改善學(xué)習(xí)記憶等[21]。本課題所使用的陽性藥物金納多為第4代銀杏制劑，目前在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療腦缺血[22]。

軸突導(dǎo)向生長是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和有效修復(fù)的核心，腦缺血后軸突導(dǎo)向生長因子表達(dá)下降是導(dǎo)致軸突再生障礙的關(guān)鍵原因[2]。本研究通過侯氏黑散小、中計(jì)量組以及陽性藥物組與模型組相對(duì)比，探究經(jīng)方侯氏黑散對(duì)腦缺血大鼠皮質(zhì)軸突導(dǎo)向生長因子Netrin-1/DCC和分子開關(guān)Rac1/Cdc42/RhoA的影響。

Netrin-1是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)導(dǎo)向因子，其廣泛存在于體內(nèi)多個(gè)部位，胚胎時(shí)期其主要存在于脊髓、延髓、中腦等部位的底板處，成熟期在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)和周圍組織中也有存在，但總體表達(dá)量低于胚胎期[3]。DCC是Netrin-1的吸引性受體，兩者結(jié)合可精準(zhǔn)地調(diào)控軸突生長錐的生長方向，通過吸引作用來調(diào)節(jié)靶向生長[23-24]。黃歡[25]發(fā)現(xiàn)，Netrin-1與其受體結(jié)合后還可以促進(jìn)軸突及其分支形成和生長、引導(dǎo)和促進(jìn)血管的生成以及維持細(xì)胞存活。提示腦缺血后激活內(nèi)源性Netrin-1/DCC可以促進(jìn)軸突再生和導(dǎo)向生長，有利于神經(jīng)功能恢復(fù)。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)Netrin-1、DCC蛋白和基因表達(dá)明顯上調(diào)，腦缺血激活了Netrin-1、DCC的表達(dá)，提示機(jī)體自身對(duì)腦缺血后神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能損傷有一定的修復(fù)作用。本研究各用藥組的結(jié)果顯示，侯氏黑散中劑量組、金納多組大鼠Netrin-1蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.01)，侯氏黑散中劑量組大鼠Netrin-1基因的表達(dá)升高(P<0.05)；侯氏黑散小、中劑量組以及金納多組大鼠皮層DCC 蛋白和基因的表達(dá)較模型組明顯上調(diào)(P<0.05)。提示侯氏黑散可以加強(qiáng)機(jī)體對(duì)腦缺血后神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能損傷的修復(fù)作用，且侯氏黑散中劑量組效果優(yōu)于侯氏黑散小劑量組以及陽性藥物組。

Netrin-1所引起的軸突導(dǎo)向生長作用不僅需要與其受體DCC結(jié)合，還需要通過影響Rho族GTP酶(Rho GTPases)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，促使軸突內(nèi)細(xì)胞骨架的重排[26]。Rac1、Cdc42和RhoA是Rho GTPases家族中研究最多、作用機(jī)制最清楚的3個(gè)分子開關(guān)[27-28]。Rac1、Cdc42是吸引性分子開關(guān)，受Netrin-1等吸引性導(dǎo)向信號(hào)調(diào)控。Rac1通過促進(jìn)細(xì)胞邊緣層板狀偽足絲狀偽足的形成推動(dòng)細(xì)胞遷移，Cdc42參與細(xì)胞極性建立，指導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向，兩者協(xié)同作用可以調(diào)節(jié)肌調(diào)蛋白促進(jìn)軸突生長和穩(wěn)定[4]。RhoA是斥向性分子開關(guān)，受Nogo-A等多種排斥信號(hào)的調(diào)控，其活化可以促進(jìn)應(yīng)力纖維和黏著斑的形成，導(dǎo)致軸突的回縮以及生長錐的塌陷[29]。Rac1、Cdc42和RhoA共同作用促使細(xì)胞骨架重排，引起神經(jīng)元的導(dǎo)向遷移，軸突導(dǎo)向生長和神經(jīng)環(huán)路的重塑，干擾神經(jīng)元Rho GTPases的活性明顯影響神經(jīng)元突起的生長、側(cè)枝形成以及定向生長[30-31]。因此，調(diào)控Rac1、Cdc42和RhoA的表達(dá)是促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[32]。本研究結(jié)果顯示，侯氏黑散可以上調(diào)Rac1、Cdc42的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)RhoA的表達(dá)，且侯氏黑散中劑量組效果最優(yōu)。結(jié)果提示，侯氏黑散可明顯上調(diào)Rac1、Cdc42的表達(dá)，下調(diào)RhoA的表達(dá)，從而激活分子開關(guān)，有助于腦缺血后神經(jīng)纖維的修復(fù)和再生。

[1] 陸躍，趙暉，姚曉泉，等.侯氏黑散中風(fēng)藥、補(bǔ)虛藥對(duì)腦缺血大鼠軸突生長抑制信號(hào)通路Nogo-A/NgR與RhoA/Rock2的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2016,39(12): 1017-1021.

[2] Tsuchiya A,Hayashi T,Deguchi K,et al.Expression of netrin-1 and its receptors DCC and neogenin in rat brain after ischemia[J].Brain Res,2007,1159: 1-7.

[3] Izzi L,Charron F.Midline axon guidance and human genetic disorders[J].Clin Genet,2011,80(3): 226-234.

[4] Sakumura Y,Tsukada Y,Yamamoto N,et al.A molecular model for axon guidance based on cross talk between rho GTPases[J].Biophy J,2005,89 (2): 812-822.

[5] Chang J,Yao X,Zou H,et al.BDNF/PI3K/Akt and Nogo-A/RhoA/ROCK signaling pathways contribute to neurorestorative effect of houshiheisan against cerebral ischemia injury in rats[J].J Ethnopharmacol,2016,194: 1032-1042.

[6] Long E Z,Weinstein P R,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1): 84-91.

[7] Vezzani A.VEGF as a target for neuroprotection[J].Epilepsy Curr,2008,8(5):135-137.

[8] 范永升． 全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材(第十版)·金匱要略[M]．北京：中國中醫(yī)藥出版社,2016：57．

[9] 馬萌.有關(guān)中風(fēng)病痰熱腑實(shí)問題的商榷[J].中華中醫(yī)藥雜志,2016,31(2): 559-561.

[10] 王艷紅,關(guān)楓,楊曉秋．《雷公炮制藥性解》詳注[M]．北京：人民軍醫(yī)出版社,2011：234．

[11] 葉天士． 本草經(jīng)解[M]．北京：學(xué)苑出版社,2011：89．

[12] 高學(xué)敏． 新世紀(jì)(第二版)全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材·中藥學(xué)[M]．北京：中國中醫(yī)藥出版社,2007：74．

[13] 徐大椿． 神農(nóng)本草經(jīng)百種錄[M]．北京：學(xué)苑出版社,2011：67.

[14] 張澤金.基于古今藥方縱橫的桂枝應(yīng)用及配伍研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué),2009.

[15] 趙乾龍.淺談外風(fēng)說在中風(fēng)病治療中的意義[J].中醫(yī)學(xué)報(bào),2015,30(11): 1627-1629.

[16] 王明杰,黃淑芬.風(fēng)藥增效論[J].新中醫(yī),2006,38(1):1-4.

[17] 鄭國慶,王艷.風(fēng)藥治血與中風(fēng)病證治[J].中國醫(yī)藥學(xué)報(bào),2001,16(1):13-17.

[18] Zhang Q,Zhao H,Wang L,et al.Effects of wind-dispelling drugs and deficiency-nourishing drugs of Houshiheisan compound prescription on astrocyte activation and inflammatory factor expression in the corpus striatum of cerebral ischemia rats[J].Neural Regen Res,2012,7(24): 1851-1857.

[19] Wang H,Wang L,Zhang N,et al.Houshiheisan compound prescription protects neurovascular units after cerebral ischemia[J].Neural Regen Res,2014,9(7): 741-748.

[20] 常佳慧，趙暉，王蕾，等.侯氏黑散化學(xué)成分對(duì)脂多糖誘導(dǎo)BV2細(xì)胞活化中炎性反應(yīng)因子分泌平衡的影響[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2017,38(2): 213-219.

[21] 朱衛(wèi)，張曉彪.銀杏葉制劑對(duì)腦血管病治療的概況[J].國外醫(yī)學(xué)：腦血管疾病分冊(cè),1998，6(4): 43-46.

[22] 張鴻，趙冬雪，鄭東明，等.金納多注射液對(duì)局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)影響[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004，33(6): 27-29.

[23] Bradford D,Cole S J,Cooper H M.Netrin-1: diversity in development[J].Int J Biochem Cell Biol,2009,41(3): 487-493.

[24] Dun X P,Parkinson D B.Role of netrin-1 signaling in nerve regeneration[J].Int J Mol Sci,2017,18(3).

[25] 黃歡.跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)腦缺血損傷大鼠netrin-1及其受體DCC、Unc5B表達(dá)的影響[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué),2011.

[26] Stephenson R E,Miller A L.Tools for live imaging of active Rho GTPases in Xenopus[J].Genesis,2017,55(1-2).

[27] Haga R B,Ridley A J.Rho GTPases: Regulation and roles in cancer cell biology[J].Small GTPases,2016,7(4): 207-221.

[28] Sit S T,Manser E.Rho GTPases and their role in organizing the actin cytoskeleton[J].J Cell Sci,2011,124 (5): 679-83.

[29] Karnoub A E,Symons M,Campbell S L,et al.Molecular basis for Rho GTPase signaling specificity[J].Breast Cancer Res Treat,2004,84(1): 61-71.

[30] Norris A D,Sundararajan L,Morgan D E,et al.The UNC-6/Netrin receptors UNC-40/DCC and UNC-5 inhibit growth cone filopodial protrusion via UNC-73/Trio,Rac-like GTPases and UNC-33/CRMP[J].Development: Engl,2014,141 (22): 4395-4405.

[31] Liu X,Lu Y,Zhang Y,et al.Slit2 regulates the dispersal of oligodendrocyte precursor cells via Fyn/RhoA signaling[J].J Biol Chem,2012,287 (21): 17503-17516.

[32] DeGeer J,Lamarche-Vane N.Rho GTPases in neurodegeneration diseases[J].Exp Cell Res,2013,319 (15): 2384- 2394.

InfluenceofHoushiheisanontheexpressionofaxonguidancefactorandRhoGTPases

Lu Yue1,Liu Jianhong2,Zhao Hui1,Chang Jiahui1,Xiang Yangyang1,Zhang Qiuxia1*

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2.TheGeneralHospitalofThePLARocketArmy,Beijing100840,China)

ObjectiveTo investigate the influence of Houshiheisan on the expression of axon guidance factor Netrin-1/DCC and molecular switch Rac1/Cdc42/RhoA in cerebral ischemia injury rats.MethodsThe permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO) model was made by the intraluminal suture method.Rats were randomly divided into sham group,model group,low dose of Houshiheisan group,middle dose of Houshiheisan group and Ginaton group.Western blotting and RT-PCR were employed to detect the expression of Netrin-1,DCC,Rac1,Cdc42 and RhoA in ischemic cerebral cortex of rats 7 days after operation.ResultsCompared with the model group,in the middle dose of Houshiheisan group and Ginaton groups,the expression of Netrin-1 protein was elevated significantly(P<0.01),middle dose of Houshiheisan group,the expression of Netrin-1 in mRNA was significantly increased(P<0.05);in the low dose of Houshiheisan,middle dose of Houshiheisan and Ginaton groups,the expression of DCC,Rac1 and Cdc42 protein and mRNA (P<0.05,P<0.01)was significantly increased;but the expression of RhoA protein and mRNA was decreased significantly (P<0.01).ConclusionThe findings demonstrated that Houshiheisan could accelerate the recovery of neurological impairment after celebral ischemia by regulating the expression of axon guidance factors like Netrin-1/DCC and molecular switch Rac1/Cdc42/RhoA.

cerebral ischemia;Houshiheisan;Netrin-1;DCC;Rac1;Cdc42;RhoA

國家自然科學(xué)基金(81373526)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81373526).

*Corresponding authors，E-mail：zqx26@163.com,jhliuluan@sina.com

時(shí)間：2017-12-13 20∶53

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2053.016.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.022]

R289.5

2017-10-16)

編輯 慕 萌