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(1.卡尤迪生物科技有限公司，北京，100081；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)檢驗所；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所)

·技術(shù)與方法·

一步法人類CYP2C19基因分型檢測在臨床中的應(yīng)用及其意義

李響1，劉寧1，肖樂東2，張偉3，李清3，李智3，楊坤1，譚志榮3*

(1.卡尤迪生物科技有限公司，北京，100081；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)檢驗所；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所)

目的探索一步實時熒光PCR檢測CYP2C19基因分型的方法。方法采用人類CYP2C19基因分型檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)對全血或人基因組進行一步法實時熒光PCR檢測，同時采用焦磷酸測序和試劑盒進行對比。結(jié)果一步法檢測結(jié)果準(zhǔn)確性為100%。重復(fù)性檢測顯示，該法對各個基因型Ct值進行變異系數(shù)(CV值)的統(tǒng)計學(xué)分析，CV值均小于5%，對已知基因型的濃度的檢測范圍為0.2～125 ng，對雜合突變型基因組DNA(1 ng)和血液樣本(十倍稀釋)進行7次檢測，變異系數(shù)(CV值)均小于5%，對特異性樣品、EDTA抗凝樣本、枸櫞酸鈉抗凝樣本、乳糜血樣本、血紅素污染樣本的基因型都有較好的檢測效果。結(jié)論一步法檢測方法準(zhǔn)確性高，檢測范圍寬，重復(fù)性、特異性和靈敏度均能達到人基因組DNA樣本的檢測的水平，滿足臨床對人CYP2C19基因分型檢測的目的。

CYP2C19基因分型； 氯吡格雷； 一步法實時熒光PCR； 個體化用藥

近年來隨著人類基因組學(xué)(genomics)的發(fā)展，藥物基因組學(xué)(pharmacogenomics)領(lǐng)域得到了迅猛發(fā)展，越來越多的藥物基因組生物標(biāo)記物及其檢測方法相繼涌現(xiàn)。藥物基因組學(xué)已成為指導(dǎo)臨床個體化用藥、評估嚴重藥物不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險、指導(dǎo)新藥研發(fā)和評價新藥的重要工具，藥物反應(yīng)相關(guān)基因及其表達產(chǎn)物的分子檢測是實施個體化藥物治療(individualized treatment)的前提。目前美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和我國食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)都已批準(zhǔn)了一系列的個體化用藥基因診斷試劑盒。

氯吡格雷是一種抗血小板藥物，廣泛用于急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)、缺血性腦血栓(acute ischemic stroke,AIS)、閉塞性脈管炎(thromboangitisobliterans,TAO)和動脈硬化及血栓栓塞引起的并發(fā)癥。心臟支架手術(shù)后的患者需長期服用氯吡格雷以防止支架內(nèi)再梗[1-2]。氯吡格雷主要經(jīng)CYP2C19代謝活化后發(fā)揮抗血小板效應(yīng)[3-4]。2010年3月，美國(FDA)宣布氯吡格雷抵抗的“黑框警告”，提醒應(yīng)用氯吡格雷后出現(xiàn)心血管不良事件與CYP2C19功能缺失的等位基因有關(guān)。CYP2C19遺傳變異可導(dǎo)致酶活性的個體差異，使人群出現(xiàn)超快代謝者(ultrarapid metabolizer，UM)、快代謝者(extensive metabolizer，EM)、中間代謝者(intermediate metabolizer，IM)和慢代謝者(poor metabolizer，PM)4種表型。CYP2C19*2(rs4 244_285，c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4_986 893，c.636G>A)是中國人群中存在的2種導(dǎo)致CYP2C19酶缺陷的主要等位基因。美國FDA和美國心臟病學(xué)會建議，對于CYP2C19慢代謝基因型患者需考慮改變治療方案[5]。

用于個體化用藥基因檢測的方法包括PCR-直接測序法、PCR-焦磷酸測序法、熒光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-電泳分析、PCR-高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性PCR法、PCR-限制性片段長度多態(tài)性方法、原位雜交(ISH)等多種方法。其中，實時熒光PCR法靈敏度高，分型準(zhǔn)確，操作簡便快捷，所用儀器容易普及。目前CFDA已批準(zhǔn)CYP2C9、VKORC1等多種基因多態(tài)性檢測的PCR-熒光檢測試劑盒。已獲批的試劑盒大多采用全血基因組核酸提取，然后進行擴增檢測的方法。本文采用一步法實時熒光PCR檢測，對全血樣本免核酸提取，直接進行CYP2C19基因分型檢測，同時進行了同類試劑盒的對比驗證以及分析性能的驗證，為臨床實現(xiàn)快速便捷的床邊檢測提供了新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1檢測對象61例未知基因型的臨床全血樣本(EDTA或枸櫞酸鈉抗凝)，受試者選擇標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～75歲；(2)男女不限；(3)心腦血管以及外周動脈疾病患者；(4)無研究者認為的不宜參加本試驗的其他情況。

1.2方法

1.2.1 檢測方法 采用人類CYP2C19基因分型檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)[卡尤迪生物科技(北京)有限公司]，取49.8 μL PCR反應(yīng)液分裝到0.2 μL PCR管，然后加入0.2 μL待測樣本(全血或人基因組)，放入實時熒光定量PCR儀(Mini8 Plus)[卡尤迪生物科技(北京)有限公司]進行檢測。

1.2.2 對照方法 焦磷酸法測序(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)檢驗所)及已獲cFDA批準(zhǔn)的人類CYP2C19基因多態(tài)性檢測試劑盒(武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司)。取臨床全血樣本(約200 μL)進行人基因組提取，然后進行濃度測定，調(diào)整核酸濃度至說明書要求的范圍內(nèi)，取20 ng基因組DNA進行焦磷酸測序及實時熒光定量PCR檢測。全部檢測時間約4～5 h。

1.3性能分析

1.3.1 準(zhǔn)確性分析 對54例未知基因型的臨床樣品同時進行一步法檢測，以及焦磷酸測序(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)檢驗所)和已獲cFDA批準(zhǔn)的人類CYP2C19基因多態(tài)性檢測試劑盒(武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司)的檢測，對檢測結(jié)果進行準(zhǔn)確性分析。

1.3.2 重復(fù)性分析 對三個已知基因型(分別為野生型、雜合突變型及純合突變型)的血液樣本，一例雜合突變型的基因組DNA樣本分別進行5次重復(fù)性檢測，對各位點進行CV值的統(tǒng)計分析。

1.3.3 檢測范圍分析 對一個雜合突變型的基因組DNA進行梯度稀釋，濃度分別為125、25、5、1、0.2 ng，分別進行檢測分析。

1.3.4 靈敏度分析 對雜合突變型基因組DNA(1 ng)和血液樣本(十倍稀釋)，對每個樣本進行7次檢測，然后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.5 特異性分析 對三個已知基因型(分別為野生型、雜合突變型及純合突變型)的基因組DNA樣本進行檢測分析。

1.3.6 抗干擾性分析 對4個未知基因型的血液樣本，分別為EDTA抗凝樣本，枸櫞酸鈉抗凝樣本，乳糜血樣本，血紅素污染樣本，進行一步法檢測及對比方法的檢測，對檢測結(jié)果進行分析。

2 結(jié) 果

準(zhǔn)確性分析結(jié)果顯示，三種方法的檢測結(jié)果完全符合，包含了CYP2C19*2/*3的三種基因型，一步法檢測結(jié)果準(zhǔn)確性為100%。重復(fù)性分析結(jié)果見表1，CV值均小于5%。對已知基因型的不同濃度的檢測范圍參考品(*2/*3均為GA基因型)進行檢測后，從0.2～125 ng每個濃度的樣品都能被正確的檢測出來(表2)。雜合突變型基因組DNA檢測其CYP2C19*2的G/A基因型的CV值分別為4.06%/4.04%，CYP2C19*3的G/A基因型的CV值分別為0.33%/0.33%。血液樣本CYP2C19*2的G/A基因型的CV值分別為2.46%/2.48%，CYP2C19*3的G/A基因型的CV值分別為3.56%/3.51%。CV值均小于5%。對特異性樣品進行檢測后，每個樣品的基因型都能被正確的檢測出來。對EDTA抗凝樣本，枸櫞酸鈉抗凝樣本，乳糜血樣本，血紅素污染樣本進行檢測后，每個樣品的基因型都能被正確的檢測出來，且與對照試劑盒檢測結(jié)果一致。但對于血紅素污染參考品，其CT值超過43，視為檢測失敗。故初步認為本試劑盒不適用于發(fā)生嚴重溶血的血紅素污染樣本。由于樣本量小，還需進一步增加血紅素污染樣本檢測數(shù)量，來判斷本方法是否適用于溶血樣本。

表1 一步法檢測重復(fù)性分析

表2 不同濃度CYP2C19*2和CYP2C19*3檢測的Ct值

3 討 論

本文發(fā)現(xiàn)，采用實時熒光PCR方法，對臨床全血樣本直接進行人CYP2C19*2/*3基因分型一步法檢測準(zhǔn)確性高，檢測范圍寬，重復(fù)性、特異性和靈敏度均能達到人基因組DNA樣本的檢測的水平，滿足臨床對人CYP2C19基因分型檢測的目的。與對比試劑盒相比，一步法檢測免除了核酸提取，一方面縮短了臨床樣本的檢測時間，減少檢測成本，有利于檢測報告的及時快速的發(fā)出，另一方面減少了臨床檢驗人員的操作步驟，避免了操作誤差和污染的引入，方便臨床應(yīng)用的推廣，提高檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。一步法檢測所需樣本量少(僅需0.2 μL血液)，靜脈血及指尖血均可以滿足檢測的需要，患者接受度高，臨床檢驗人員操作方便。綜上所述一步法個體化用藥分子診斷因為耗時短，且操作簡單，免去了對人員過高經(jīng)驗和專業(yè)的要求，因此可以應(yīng)用于在醫(yī)院科室的床旁檢測(POCT)。該方案的可靠性和有效性已經(jīng)經(jīng)過實驗驗證。參照本文的操作和質(zhì)控規(guī)范，即可較好地保證一步法檢測在床旁檢測方面的順利開展。

Mega等[6]研究結(jié)果顯示，至少攜帶1個CYP2C19功能缺失型等位基因的受試者(CYP2C19*2或*3攜帶者)，導(dǎo)致氯吡格雷藥物活性代謝物水平降低，容易出現(xiàn)氯吡格雷抵抗，PCI術(shù)后支架內(nèi)血栓形成風(fēng)險增高。對于PCI高危患者，CYP2C19基因檢測是有必要的。對于“氯吡格雷抵抗”臨床上可采用增加劑量或同類藥物替代或聯(lián)合用藥的治療策略[7-8]。因此，通過對CYP2C19基因檢測基礎(chǔ)上指導(dǎo)PCI術(shù)后氯吡格雷抗血小板治療是減少血栓形成事件發(fā)生的有效途徑之一，特別對冠心病高危人群具有特殊意義[9]。

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[9] Zhang HZ,Kim MH,Guo LZ,et al.CYP2C19 but not CYP2B6,CYP3A4,CYP3A5,ABCB1,PON1 or P2Y12 genetic polymorphism impacts antiplatelet response after clopidogrel inKoreans [J].Blood Coagul Fibrinolysis,2017,28(1):56-61.

Clinicalapplicationandsignificanceofone-stephumanCYP2C19genotypedetection

LI Xiang，LIU Ning，XIAO Ledong，et al

(CoyoteBioscienceCo,Ltd,Peking,Beijing100081,China)

ObjectiveTo verify the analysis capabilities of one-step real-time PCR method in the directly detect CYP2C19 gene classification.MethodsUsing one-step real-time fluorescent PCR detection with human CYP2C19 genotyping kit (Coyotebio) to detect whole blood or genome,and compared with the pyrosequencing method and other qPCR kit.

ResultsAccuracy of one-step real-time PCR is 100%.The coefficient of variation (CV) of repeatability for all genotypesare was less than 5%.To detect known genes of different concentration,each sample can be detected correctly.Genomic DNA of hybrid mutation type (1 ng) and blood samples (10 times dilution),7 times repeating detection,the coefficient of variation (CV) of sensitivity are less than 5%.For EDTA anticoagulant samples,the samples of sodium citrate anticoagulation,chyle blood samples,heme pollution samples,each sample genotypes can be correctly detected.ConclusionOne-step detection method is of high accuracy and wide detection range,repeatability,sensitivity and specificity all can reach the level of genome DNA test samples.So one-step detection method could meet the clinical CYP2C19 gene classification testing purpose.

CYP2C19 genotyping; clopidogrel; One-step real-time fluorescent PCR; personalized medicine

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.04.024

2016-11-05；

2017-05-01

長沙市科技局一般平臺項目(K1403075-61)；中南大學(xué)研究生創(chuàng)新課題(2016zzts522)；湖南省科技廳省重點研發(fā)計劃應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點項目(2016JC2063).

*通訊作者，E-mail:tanzr@163.com.

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蔣湘蓮)