付強，程立坤，付石軍，苗立中，王艷，沈志強

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

一株牛源副干酪乳桿菌的分離與鑒定

付強，程立坤，付石軍，苗立中，王艷，沈志強

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

為了分離有研究價值的益生菌，從牛腸道中分離到1株疑似乳酸菌，通過對參考菌株的16S rRNA基因序列的歸納分析，證實存在種間特異性可變區(qū)，最終確定為副干酪乳桿菌，分離菌作為一種益生菌在飼料添加劑方面存在重要研究價值。

副干酪乳桿菌；分離鑒定；16S rDNA；序列分析

乳酸菌（Lactobacillus）是一類能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性菌的通稱，乳酸細(xì)菌現(xiàn)在主要包括2 3個屬，其中比較重要的有乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）等[1]。作為重要的益生菌，乳酸菌已被廣泛地應(yīng)用于食品、飲料和微生態(tài)制劑等行業(yè)中，是安全的食品級微生物[2]。因此乳酸菌的分離與鑒定對于后續(xù)的研究與應(yīng)用具有重要的作用。

目前乳酸菌的鑒定方法主要分為表型特征鑒定法和基因型鑒定法。其中16S rDNA鑒定是一種快速獲得細(xì)菌種屬信息的方法，但16S rDNA進化分析不適合物種內(nèi)或親緣關(guān)系很近的物種[3]。在乳酸菌分類研究領(lǐng)域，干酪乳桿菌群包括L.casei（干酪乳桿菌），L.paracasei（副干酪乳桿菌）和L.rhamnosus（鼠李糖乳桿菌），種群內(nèi)菌株生理生化特征相似。而16S rRNA基因序列同源性高，其命名和分類地位一直飽受爭議[4]，目前在副干酪乳桿菌鑒定中應(yīng)用最廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)是16S rDNA序列同源性分析[5]，也有研究者采用持家基因hsp60[6]、pheS[7]、recA[8]基因序列分析來揭示群內(nèi)相近菌株的差異。本試驗采用16S rDNA同源性分析以及可變區(qū)序列對比，對實驗室分離的1株乳酸菌進行鑒定，最終確定為副干酪乳桿菌，證明該方法具有一定的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種為從牛腸道中分離純化的一株乳酸菌，革蘭氏陽性，桿狀，命名為Ybj。

MRS肉湯培養(yǎng)基：北京路橋有限責(zé)任公司；Taq DNA酶、dNTP、10×PCR buffer、MgCl2：寶生物工程（大連）有限公司；溶菌酶：北京科博賽爾生物科技有限公司；DNA純化回收試劑盒（離心柱型）：天根生化科技（北京）有限公司；試驗所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；腸球菌菌屬生化鑒定管：杭州天和微生物試劑有限公司；化學(xué)試劑均為分析純。

圖1 乳酸菌基因組DNA 提取結(jié)果

1.2 主要儀器與設(shè)備

電泳儀：北京市六一儀器廠DYY 8C型；PCR儀：美國伯樂BIO-RAD PTC-220型；紫外凝膠成像系統(tǒng)：美國A1phaImager HP。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 DNA提取

DNA提取參照參考文獻[9]并進行適當(dāng)修改：將篩選出的供試菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16～17h，取1mL菌液加入到1.5mL離心管中，5 000 r/min離心10min，棄上清。加入50μL TE buffer、100μL（30mg/L）溶菌酶，37℃溫育2h，5 000r/min離心10min，棄上清。后續(xù)操作使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，對提取后的DNA溶液取樣進行瓊脂糖凝聚電泳，剩余DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 乳酸菌16S rDNA的擴增

以提取的基因組D N A為模板進行片段擴增，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物，正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR擴增采用20μL體系：2×Premix Taq (TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye) 10μL，DNA模板 1μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，滅菌蒸餾水7μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，循環(huán)30次；再72℃延伸10min，4℃保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的片段大小是否正確。

1.3.3 轉(zhuǎn)化與質(zhì)粒提取

采用生產(chǎn)的膠體金回收試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）將PCR產(chǎn)物進行回收與純化。將純化片段連接pMD-18T，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選出陽性菌后擴增提取質(zhì)粒并送大連寶生物工程有限公司測序。

1.3.4 16S rDNA同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

將所得基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知菌株的16S rDNA序列進行BLAST比對，比對結(jié)果用MEGA7.0軟件對目的菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.5 干酪乳桿菌群16S rDNA 保守序列分析

參考Ward 等[10,11]方法，選取干酪乳桿菌群內(nèi)6株標(biāo)準(zhǔn)株的16S rDNA序列，用軟件MEGA和MegAlign做序列比較，分析可變區(qū)核苷酸序列特點，并與待檢株Ybj做序列比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

經(jīng)檢測，提取的基因組DNA為一條亮帶，證明DNA提取成功（圖1）。

2.2 細(xì)菌通用引物的16S rDNA PCR產(chǎn)物檢測

圖2 乳酸菌基因組DNA 16S rDNA PCR擴增結(jié)果

用細(xì)菌通用引物對Ybj株基因組DNA進行擴增驗證，擴增產(chǎn)物在約1 500bp處均有條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，說明菌株目標(biāo)片段擴增成功（圖2）。

2.3 分離菌與參考株16S rRNA同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及分析

測序結(jié)果經(jīng)chromas軟件雙向拼接，Ybj株P(guān)CR產(chǎn)物全長1 531bp，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對，乳酸菌Ybj與Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei的相似度均達到99.0%以上。說明它們具有很近的親緣關(guān)系，初步認(rèn)定乳酸菌Ybj為（副）干酪乳桿菌。

參考《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》[1]，及標(biāo)準(zhǔn)株數(shù)據(jù)庫（http∶//www.straininfo.net/），共選取乳桿菌屬18個代表菌株的16S rDNA基因序列，將其16S rDNA序列通過MEGA7.0軟件分析，采用Clustral W進行多序列匹配排列，用neighbor-joining獲得發(fā)育系統(tǒng)樹，比較它們之間的進化距離。結(jié)果顯示，待測菌Ybj與L.casei、L.paracasei的同源性分別為99.8%、99.7%（圖3），從系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）可以直觀地看出分離菌Ybj與干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌處于同一分支，但無法確定屬于哪一種。

圖3 乳桿菌屬 16S r DNA 序列比對相似度結(jié)果

圖4 分離菌16S rDNA與18個同屬代表序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 干酪乳桿菌群16S rDNA 可變區(qū)序列分析

研究發(fā)現(xiàn)16S rDNA有10個可變區(qū)(V1～V10)，其中V1～V3區(qū)含有種屬特異性序列，可用于種內(nèi)鑒定[12]。選取與干酪乳桿菌群親緣關(guān)系最近的8株代表株（D79212、D86517、AF469172、KP326371、AB008211、D16552、KT630827、D86516），與分離株Ybj的16S rDNA序列用MegAlign軟件進行比對，尋找可變區(qū)，結(jié)果見圖5，以ATCC 334株為參考，其核苷酸序列的第46～84bp存在一明顯可變區(qū)。

圖5 群內(nèi)代表株16S rDNA可變區(qū)核苷酸序列比對分析

如圖5所示，分離株Ybj與L.paracaseiJCM 8130株的可變區(qū)部分完全符合，與L.caseiATCC 334株的可變區(qū)部分也完全符合，但ATCC 334株現(xiàn)已歸類于L.paracasei[13]，其他菌株均有其種特異性核苷酸序列，與最近的文獻報道[11]相符（原文獻種特異性反向引物有1堿基有誤，應(yīng)為5'-CCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'），由此可以確定分離株Ybj為副干酪乳桿菌。

3 討論

目前不僅在飼料添加劑上還是在表達載體構(gòu)建上，益生菌的研究方興未艾，而篩選及分離鑒定是這些工作的基礎(chǔ)。由于干酪乳桿菌群存在一種間特異性可變區(qū)，本研究僅通過16S rRNA基因序列的歸納分析，即可快捷地鑒定出一株副干酪乳桿菌。當(dāng)前隨著分子技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了隨機擴增DNA多態(tài)性分析（RAPD）、擴增片段長度多態(tài)技術(shù)（AFLP）、變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）等多種新技術(shù)[5,14]，甚至可以達到批量檢測，但是實驗要求較高，不太適合一般實驗室應(yīng)用，因此16S rDNA序列分析的靈活應(yīng)用也不失為一種簡便的鑒定方法。（副）干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)作為益生菌廣泛應(yīng)用于酸奶、干酪、保健食品和飼料等領(lǐng)域。因此所鑒定出的分離菌具有一定的應(yīng)用潛力。

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Isolation and Identification of a Strain of Lactobacillus casei from Bovine

FU Qiang, CHENG Li-kun, FU Shi-jun, MIAO Li-zhong, WANG Yan
(Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy, Binzhou 256600)

One strain ofLactobacilluswas isolated from bovine intestine in order to separate the valuable probiotics.Followed by 16S rRNA gene sequences analysis, the existence of species specific variable region was con firmed.This strain was eventually identified asLactobacillus paracasei, which may have important research and application in the feed additive industry.

Lactobacillus; Isolation and identification; 16S rDNA; Sequence analysis

S823.4

A

1004-4264（2017）12-0018-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.12.005

2017-03-22

山東省科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新工程-畜禽健康養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)研究（CXGC2017B02）。

付強（1980-），男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事生物制品研究。