高旭東，趙曉博，胡 玥，火 婷，邵士俊, 師彥平

(中國科學院 蘭州化學物理研究所，中國科學院 西北特色植物資源化學重點實驗室/ 甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

新喜樹堿衍生物的核磁共振譜分析與結(jié)構(gòu)鑒定

高旭東，趙曉博，胡 玥，火 婷，邵士俊, 師彥平

(中國科學院 蘭州化學物理研究所，中國科學院 西北特色植物資源化學重點實驗室/ 甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

以20(S)-喜樹堿(CPT)為起始原料，對其進行結(jié)構(gòu)修飾，合成了一種新的喜樹堿衍生物CPT-A.并利用1D(1H、13C和DEPT135)和2D(異核單量子相關(guān)譜和異核多碳相關(guān)譜)核磁共振(NMR)技術(shù)對該化合物進行了結(jié)構(gòu)確定，詳細歸屬了CPT-A1H和13C NMR譜的化學位移，喜樹堿骨架的指認結(jié)果與文獻報道基本一致，并發(fā)現(xiàn)喜樹堿骨架6位碳與取代基苯環(huán)3’位碳的化學位移相同，譜峰完全重疊，這在13C譜中是不常見的. 研究結(jié)果可為喜樹堿類天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)鑒定提供NMR數(shù)據(jù)支持和方法指引.

喜樹堿衍生物; CPT-A; 核磁共振; 譜圖解析; 結(jié)構(gòu)鑒定

喜樹堿(camptothecin，CPT)是從我國特有的珙桐科植物喜樹中分離得到的喹啉類生物堿,由Wall等[1]于1966年首次分離得到，其對惡性腫瘤具有良好的抑制作用. 但由于喜樹堿對消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)有較強的毒副作用，使得人們對喜樹堿的研究一度失去了興趣[2]. 直到1985年，Hsiang等[3]發(fā)現(xiàn)了喜樹堿是拓撲異構(gòu)酶I(topoisomerase I，Topo I)的特異性抑制劑，該化合物才重新引起了研究者的重視. 喜樹堿分子式為C20H16N2O4，分子量348.34，該分子為五環(huán)結(jié)構(gòu)：AB環(huán)為喹啉環(huán)，C環(huán)為吡咯環(huán)，D環(huán)是一個共軛的吡啶酮環(huán)，E環(huán)為α-羥基內(nèi)酯環(huán)，其中E環(huán)有一個不對稱中心(20S構(gòu)型). 構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)酯環(huán)和羥基20S構(gòu)型是喜樹堿抗腫瘤活性的關(guān)鍵部位[4]. 喜樹堿的主要缺點在于藥物本身的毒性較大、水溶性差以及在人體血漿中內(nèi)酯環(huán)開裂導(dǎo)致的失活[5]. 因此，對其結(jié)構(gòu)進行修飾，獲得高效低毒的喜樹堿衍生物顯得尤為重要. 目前的研究主要集中在A、B和E 環(huán)的修飾上，其中7、9、10 和20 位碳是研究最多的修飾位點[6]. 現(xiàn)代波譜儀器如超導(dǎo)核磁共振波譜儀對新型喜樹堿衍生物的結(jié)構(gòu)進行精準表征是提供開發(fā)喜樹堿類藥物的有效手段.

核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)現(xiàn)象是磁矩不為零的原子核在外磁場的作用下，自旋能級發(fā)生塞曼裂分，共振吸收某一定頻率的射頻輻射的物理過程[7]. 塞曼裂分的大小與分子結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系，處于不同環(huán)境的同一種自旋核會產(chǎn)生不同的NMR譜，因而能夠提供有關(guān)分子結(jié)構(gòu)的信息. 自從20世紀70年代以來，核磁共振技術(shù)在有機化合物結(jié)構(gòu)鑒定中發(fā)揮著極其重要的作用. 核磁共振可提供1D、2D以及3D數(shù)據(jù)，反映出大量的結(jié)構(gòu)信息. 對于解析結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，2D NMR技術(shù)具有簡單、高效和可靠的特點[8]. 異核單量子相關(guān)譜( heteronuclear singular quantum correlation，HSQC)可以提供一鍵相關(guān)的碳氫信息，對于解析甲基、亞甲基和次甲基的氫碳是非常有幫助的. 異核多碳相關(guān)譜(heteronuclear multiple bond correlation，HMBC)將1H核和遠程耦合的13C核關(guān)聯(lián)起來，HMBC提供的是相隔2個和3個鍵的碳氫之間的相關(guān)信息，對于解析季碳原子以及被雜原子隔開的碳原子與氫原子之間的相關(guān)非常有利.

本文以20(S)-喜樹堿為起始原料，對喜樹堿的20位碳進行結(jié)構(gòu)修飾，得到一個新的喜樹堿衍生物CPT-A，并利用1D(1H、13C和無畸變極化轉(zhuǎn)移,distortionless enhancement by polarization transfer, DEPT135)和2D(HSQC和HMBC)NMR技術(shù)對其進行結(jié)構(gòu)鑒定，對CPT-A的1H和13C譜進行了詳細的指認歸屬，喜樹堿骨架的指認結(jié)果與文獻報道基本一致. 在譜圖解析中發(fā)現(xiàn)，喜樹堿骨架6位碳與取代基苯環(huán)3’位碳的化學位移相同，譜峰完全重疊，這在13C譜中是不常見的[9]. 本工作為喜樹堿類天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)鑒定提供了NMR數(shù)據(jù)支持和方法指引.

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE III HD 400 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀(Bruker Daltonics Inc.)；Bruker MicrOTOF-Q II高分辨飛行時間質(zhì)譜(Bruker Daltonics Inc.)；DMSO-d6(D，99.9%)：美國CIL(Cambridge Isotope Laboratories, Inc)公司；喜樹堿樣品(98%) ：成都元成生物科技有限公司; 甲氨基吡啶(98%)：上海麥克林生化科技有限公司；三光氣(98%)：梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；苯酚(98%)：武漢易泰科技有限公司上海分公司.

1.2 儀器條件

1.2.1 核磁條件

喜樹堿衍生物CPT-A在Bruker AVANCE III HD 400 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀上進行測試，溶劑為DMSO-d6，四甲基硅烷(tetramethylsilane, TMS)為內(nèi)標，其余測試條件如表1所列.

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源溫度：180 ℃；離子源：ESI源；離子模式：正離子；碰撞能量: 8.0 eV；碰撞電壓: 300 Vpp.

1.3 樣品制備方法

取喜樹堿樣品(200 mg，0.57 mmol)于干燥的圓底燒瓶內(nèi)，加入10 mL干燥的二氯甲烷，攪拌下加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，211 mg，1.73 mmol)，室溫攪拌5 min后，冰浴條件下加入三光氣(57 mg，0.19 mmol)，在冰浴下反應(yīng)2 h后，加入苯酚(64 mg，0.68 mmol)，反應(yīng)在室溫攪拌下過夜后停止反應(yīng). 經(jīng)過濾，收集濾液，減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，收集有機相，無水硫酸鎂干燥. 粗產(chǎn)品用硅膠柱色譜分離純化得淡黃色粉末(229 mg，產(chǎn)率89%).

2 結(jié)果與討論

2.1 CPT-A的結(jié)構(gòu)確定

參照文獻方法[10]，對天然產(chǎn)物喜樹堿的結(jié)構(gòu)進行修飾，合成了一種新的喜樹堿衍生物CPT-A，結(jié)果如圖1所示. 從1H和13C NMR譜(如圖2、3所示)可以看出，與喜樹堿的NMR譜圖相比，新增加了苯環(huán)區(qū)氫和碳的峰，高分辨飛行時間質(zhì)譜測得分子式為C27H20N2O6Na，計算值為[M + Na]+491.121 4，實測值為[M + Na]+491.121 0，通過上述試驗結(jié)果，初步掌握了喜樹堿衍生物CPT-A的結(jié)構(gòu).

表1 儀器主要參數(shù)Table1 MainparametersofNMR

圖1 CPT-A的合成Fig.1 Synthesis of CPT-A

圖2 CPT-A的1H NMR譜Fig.2 1H NMR spectra of CPT-A

圖3 CPT-A的13C /DEPT135 NMR譜Fig.3 13C /DEPT135 NMR spectra of CPT-A

在此基礎(chǔ)上，對喜樹堿衍生物CPT-A進行了詳細的NMR分析以及相應(yīng)1H和13C化學位移的指認歸屬，其結(jié)果如表2所列. 表2中的原子編號如圖1所示.

表2 CPT-A在DMSO-d6中的1H和13CNMR化學位移Table2 13Cand1HNMRdataofCPT-A (δinppm, JinHz) inDMSO-d6

2.2 CPT-A的1H NMR分析

圖2為喜樹堿衍生物CPT-A的1H NMR譜. 譜圖中有13種不同的氫，從左到右，積分面積比為1∶1∶1∶1∶1∶2∶1∶1∶2∶2∶2∶2∶3，喜樹堿衍生物CPT-A中共有20個氫，不同氫之間的比例代表了氫的個數(shù). 從高場到低場，化學位移在δH0.96處的三重峰為18位甲基氫，δH2.26處的四重峰為19位亞甲基氫. 化學位移在δH5.29處的單峰和δH5.55處的四重峰分別為5位連氮的亞甲基氫和17位連氧的亞甲基氫. 17位亞甲基氫出現(xiàn)四重峰是因為17位碳在六元環(huán)上，兩個質(zhì)子是磁不等價質(zhì)子，兩個質(zhì)子相互耦合. 對于芳香區(qū)的指認，最低場化學位移在δH8.70的7位單峰氫比較容易識別，δH7.22處的單峰為14位碳原子的氫. 此外，根據(jù)耦合裂分情況，化學位移在δH8.20和δH8.14的氫為12位或9位氫，δH7.88和δH7.73處的氫為11位或10位氫，這兩組氫的詳細歸屬需要結(jié)合二維HSQC和HMBC譜進行指認. 化學位移在δH7.20處的雙峰、δH7.41處的dd峰和δH7.28處的三重峰分別為2’、3’和4’位的氫. 化學位移在δH2.50處的峰為DMSO溶劑峰，δH3.33處的峰為水峰，δH3.08處的峰為雜質(zhì)峰.

2.3 CPT-A的13C/DEPT135 NMR分析

圖3為喜樹堿衍生物CPT-A的13C/DEPT135 NMR譜. 從13C譜中可以看出，共有24個碳峰，而化合物結(jié)構(gòu)中總共有27個碳原子，說明有化學位移相同的碳原子重疊在一起. DEPT135表明，有1個甲基、3個亞甲基和9個次甲基，其余為季碳. 甲基和亞甲基很容易指認(如表1所列)，在δC121.2和δC130.3處有兩個強度明顯高于其他峰的碳原子，這很明顯為衍生化結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上2’和3’位的碳原子. 其余次甲基的指認需要結(jié)合HSQC譜進行. 季碳原子中，化學位移在最低場δC167.4處的峰為21位酯基碳，δC156.9處的峰為16a位碳原子，化學位移在δC79.3處的峰為20位碳原子. 其余碳原子的指認需要結(jié)合HMBC譜進行.

2.4 CPT-A的HSQC分析

2D NMR技術(shù)(如HSQC和HMBC)對于解決1D NMR不能確定的氫和碳的化學位移以及譜峰重疊問題有明顯的優(yōu)勢. 圖4為喜樹堿衍生物CPT-A的HSQC譜，利用HSQC譜圖所提供的一鍵相關(guān)的碳氫信息，很容易指認尚未指認的一些氫和碳信息，如化學位移在δH7.22的14位氫原子所對應(yīng)的14位碳原子(δC94.6)，化學位移在δH7.28處的4’位氫所對應(yīng)的4’位碳原子(δC127.1)等. 從HSQC譜仍然無法確定12、9和10、11位氫的具體位置，暫且指認化學位移在δH8.20處的雙峰為12位氫，則化學位移在δH8.14處的雙峰為9位氫；指認δH7.73處的三重峰為10位氫，則δH7.88處的峰為11位氫. 這樣通過HSQC譜也就暫時指認了9、10、11、12位碳原子的峰. 指認結(jié)果需要HMBC的進一步確認.

圖4 CPT-ACPT-A的HSQC譜Fig.4 HSQC spectrum of CPT-ACPT-A

2.5 CPT-A的HMBC分析

通過以上HSQC譜初步指認了次甲基的碳原子，現(xiàn)在需要結(jié)合HMBC所提供的二鍵及三鍵相關(guān)的碳氫信息，歸屬季碳和尚未完全指認的其他氫碳的信息. 圖5為喜樹堿衍生物CPT-A的HMBC譜，從譜圖中可以看出，化學位移在δC152.7處的碳與7、14和5位氫都有相關(guān)，這說明此處的峰為2位碳原子. 而化學位移在δC152.0處的峰與任何氫都沒有相關(guān)，說明為衍生化結(jié)構(gòu)中的a位碳原子. 以此類推，通過HMBC譜圖，可以確定1’、3、15、16位季碳原子的位置. 對于碳原子的歸屬，只剩下6位碳原子以及與9、10、11、12位氫相關(guān)的8和13位碳原子. 13位碳的化學位移大于8位碳原子，所以化學位移在δC148.4的峰為13位碳原子，與它相關(guān)的氫為7、9、11、12位，10位氫不與13位碳原子相關(guān)，可以確定化學位移在δH7.73 處的三重峰為10位氫，δH7.88處的峰為11位氫. 從HMBC譜中還可以發(fā)現(xiàn)，化學位移在δC132.1處的7位碳與δH8.14處的氫有相關(guān)，說明此處的氫為9位氫，則δH8.20處的峰為12位氫. 化學位移在δC128.5處的季碳與7、12以及10位氫有相關(guān)，說明此碳為8位碳原子.

圖5 CPT-A的HMBC譜Fig.5 HMBC spectrum of CPT-A

通過對1H、13C、DEPT135 NMR以及二維HSQC和HMBC的分析，歸屬了所有氫和碳的峰以及對應(yīng)的化學位移. 但是在譜圖中沒有6位季碳的峰，在HMBC譜圖中，化學位移在δC130.3處的3’位碳原子與5位氫原子有相關(guān)，觀察13C和NMR譜圖發(fā)現(xiàn)，3’碳原子峰高于2’碳原子，這些現(xiàn)象說明6位碳原子與3’位碳原子完全重合了，6位碳原子的化學位移(δC130.3)與文獻值[11-12](δC130.74 /δC129.7)基本一致.

3 結(jié)論

本文對具有抗癌活性的天然產(chǎn)物喜樹堿進行了結(jié)構(gòu)修飾，合成了一種新的喜樹堿衍生物CPT-A. 利用1H、13C、DEPT135 NMR以及二維HSQC和HMBC技術(shù)，對新喜樹堿衍生物CPT-A進行了結(jié)構(gòu)鑒定，并指認歸屬了1H和13C化學位移. 利用2D NMR技術(shù)，解決了喜樹堿骨架6位碳與取代基團苯環(huán)3’位碳譜峰重疊的解析問題. 該工作為喜樹堿類天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)鑒定提供了NMR數(shù)據(jù)支持和方法指引.

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StructureIdentificationofNewCamptothecinDerivativesbyNuclearMagneticResonanceSpectrometry

GAO Xu-dong, ZHAO Xiao-bo,HU Yue, HUO Ting, SHAO Shi-jun, SHI Yan-ping*

(CASKeyLaboratoryofChemistryofNorthwesternPlantResourcesandKeyLaboratoryforNaturalMedicineofGansuProvince,LanzhouInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences(CAS),Lanzhou730000,China)

A new camptothecin(CPT) derivative CPT-A was synthesized by modifying camptothecin, one of the most important natural products. Its chemical structure was identified using 1D and 2D nuclear magnetic resonance(NMR) techniques. Both1H and13C chemical shifts of CPT-A were exactly assigned. The results of the identification of camptothecin skeleton are basically consistent with those reported in the literature. In this study, the number 6 carbon of camptothecin skeleton and the number 3’ carbon of benzene are completely overlapped. This phenomenon is seldom seen in the13C NMR spectra. NMR data support for the discovery and structural identification of natural products of camptothecin derivatives can be obtained in the study. Furthermore, a methodology was involved in the analysis of NMR spectra.

camptothecin derivative; CPT-A; NMR; analysis of spectrum; structure identification

研究報告(208～213)

2017-11-24;

2017-11-30.

中國科學院儀器設(shè)備功能開發(fā)技術(shù)創(chuàng)新項目(項目編號：lg201509)資助

高旭東(1987-)，男，工程師，主要從事核磁共振譜儀的分析檢測工作，E-mail: sunshinegung@126.com

師彥平(1965-)，男，研究員，《分析測試技術(shù)與儀器》主編，研究方向：分離分析、分析方法和藥物活性成分的分離鑒定, Tel: 0931-4968208，E-mail: shiyp@licp.cas.cn.

O657.3

A

1006-3757(2017)04-0208-06

10.16495/j.1006-3757.2017.04.002