王 一，李錦毅

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）位于世界惡性腫瘤的第6位[1]，其病死率居第3位。大部分肝癌患者就診時已是中晚期，而晚期HCC的預后較差[2]。索拉非尼是多靶點酪氨酸激酶抑制劑，是唯一被美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準的用于肝癌晚期患者的藥物[3]，然而索拉非尼治療晚期肝癌的中位生存期也僅有1年，治療效果仍不盡人意。阿帕替尼是酪氨酸激酶受體抑制劑，為我國自主研制的小分子抗血管生成靶向藥，其可通過抑制惡性腫瘤血管的生成，達到抗腫瘤作用[4]。本研究對比分析索拉非尼與阿帕替尼對人肝癌SMMC-7721細胞體外增殖、遷移及相關因子的作用，以對比兩者抑制作用的強弱。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備 人肝癌細胞株SMMC-7721由軍事醫(yī)學科學院提供。索拉非尼購自拜耳先靈醫(yī)藥公司，阿帕替尼購自江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胰蛋白酶購自Difco公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四甲基偶氮唑鹽[3-（4,5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]試劑盒購自美國Sigma公司，人-血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、人-腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA試劑盒、人-白介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒購自北京博凌科為生物科技有限公司。超凈工作臺、CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），手持式細胞計數(shù)儀（德國Millipore公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司），電子天平（上海精密儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細胞的培養(yǎng) 人肝癌SMMC-7721細胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰酶消化傳代。隔天換液1次，2～3 d 進行一次傳代。

1.2.2 MTT法檢測藥物抑制率 收集處于對數(shù)生長期細胞后進行細胞計數(shù)，5000個/100 μl接種于96孔板，置于37℃、含5% CO2細胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h后，分別加入索拉非尼（索拉非尼組）6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、50μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml，阿帕替尼（索拉非尼組）6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml，每個濃度設3～5個復孔，對照組加入完全培養(yǎng)基。分別于24、48、72、96 h時，MTT法檢測各組光密度（optical density，OD）值，以只加DMSO孔為調(diào)零孔，設3～5個復孔。細胞生長抑制率=[1－（實驗組平均OD值－調(diào)零孔平均OD值）/（對照組平均OD值－調(diào)零孔平均OD值）]×100%。

1.2.3 細胞劃痕實驗 收集對數(shù)期細胞計數(shù)后，每孔5×105個/ml鋪于6孔培養(yǎng)板中，置入37℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。用1 ml槍頭在每孔垂直畫線，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗3次，去除劃下的細胞，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)。加入索拉非尼、阿帕替尼各濃度藥物1 ml，使藥物終濃度為：6.25μg/ml、12.5 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml。對照組加入1 ml無血清培養(yǎng)基，每組設5個復孔，放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24、48、72 h后顯微鏡下觀察遷移情況并拍照；用Imag J軟件分析細胞的遷徙面積比率。

1.2.4 ELISA實驗檢測VEGF、TNF-α及IL-6含量收集對數(shù)期細胞計數(shù)后，每孔4×104個/500 μl接種于12孔培養(yǎng)板，置于37℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。24 h后加入索拉非尼、阿帕替尼各濃度藥物500 μl，使藥物終濃度為：6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml；對照組加入500 μl完全培養(yǎng)基，每組設置5個復孔，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。72 h后，收集細胞上清液，離心（500×g，5 min）去除雜質(zhì)，按照試劑盒說明進行ELISA實驗。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料以表示，方差齊時組間比較采用獨立樣本t檢驗，方差不齊時組間比較采用t'檢驗；三組間比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Tamhane檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 索拉非尼、阿帕替尼對SMMC-7721細胞增殖的影響 由圖1、圖2可見，隨著藥物濃度的增加，索拉非尼、阿帕替尼對細胞增殖的抑制能力增強。其中，200 μg/ml時抑制效果最好，所以后續(xù)細胞劃痕實驗和細胞因子比較均選擇藥物濃度200 μg/ml。由表1可知，每種藥物濃度下索拉非尼組細胞的生長抑制率均高于阿帕替尼組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 各濃度索拉非尼對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用

圖2 各濃度阿帕替尼對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用

表1 不同濃度索拉非尼和阿帕替尼對SMMC-7721細胞生長抑制率的比較（n=15，%

表1 不同濃度索拉非尼和阿帕替尼對SMMC-7721細胞生長抑制率的比較（n=15，%

組別 藥物濃度（μg/ml）6.25 12.5 50 100 200阿帕替尼組 7.02±3.3015.49±7.8634.47±1.0442.32±1.4050.25±0.75索拉非尼組 20.58±1.9245.38±4.1067.09±1.8380.77±1.8185.60±0.94 t/ t’值 －13.756 －13.058 －60.021 －65.079 －113.851 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 細胞劃痕實驗 由圖3A、圖3B、圖3C可見，對照組遷徙范圍最大，索拉非尼組最小。索拉非尼組、阿帕替尼組和對照組遷徙面積比率分別為（0.26±0.012）%、（0.46±0.011）%和（0.66±0.023）%，三組遷徙面積比率差異有統(tǒng)計學意義（F=746.020，P＜0.001），兩兩比較，索拉非尼組、阿帕替尼組細胞遷徙面積比率小于對照組（P＜0.05），索拉非尼組小于阿帕替尼組（P＜0.05），見圖3D。

圖3 各組癌細胞遷徙面積

2.3 兩藥物組中VEGF 、TNF-α、IL-6的水平 三組間 VEGF（F=605.850，P＜0.001）、TNF-α（F=758.072，P＜0.001）及IL-6（F=822.000，P＜0.001）的含量差異均有統(tǒng)計學意義，進一步兩兩比較顯示：索拉非尼組、阿帕替尼組的VEGF、TNF-α及IL-6的含量均小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；索拉非尼組的VEGF、TNF-α及IL-6的含量均小于阿帕替尼組，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2）。

表2 對照組、索拉非尼組和阿帕替尼組SMMC-7721細胞相關因子濃度比較

表2 對照組、索拉非尼組和阿帕替尼組SMMC-7721細胞相關因子濃度比較

注：VEGF，血管內(nèi)皮生長因子；TNF-α，腫瘤壞死因子α；IL-6，白介素6；與對照組比較，①P＜0.05；與阿帕替尼組比較，②P＜0.05

組別 例數(shù) VEGF TNF-α IL-6對照組 15 154.25±3.31 110.18±4.64 71.41±1.45阿帕替尼組 15 130.31±2.10① 83.31±2.44① 60.84±1.46①索拉非尼組 15 109.14±4.74①② 62.07±2.65①② 51.60±1.07①②

3 討 論

HCC大多數(shù)發(fā)現(xiàn)時已是進展期，約1/3能進行潛在性的根治治療，如切除術及肝移植[5]。HCC的進展是一個多階段過程，涉及大量基因突變。目前，已知幾個關鍵的分子途徑參與其中，包括血小板衍生生長因子受體（plateletderived growth factor receptor，PDGFR）、VEGF、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth facto，F(xiàn)GF），表皮生長因子受體（epidermalgrowth factor receptor，EGFR），RAS /RAF /MEK /ERK和PI3K/ AKT /mTOR途徑等[6]。

目前，HCC的治療方法一般依據(jù)巴薩羅那分期[7]制定，對于巴塞羅那分期為B期的患者，經(jīng)動脈化療栓塞術（trans arterial chemoembolization，TACE）可以提高其中位總生存期[8]；晚期HCC的患者（巴塞羅那分期為C的患者）預后較差，中位生存期僅有6.6個月。

近年來，抗腫瘤血管生成藥成為治療的熱點，并研制出一批抗血管生成藥物。肝臟是富血供的器官，肝癌細胞的生長繁殖、浸潤、擴散均與腫瘤富血供有關[9]。因此，抗血管生成成為肝癌治療研究的一個重要方向，成為腫瘤治療的新策略。VEGF是體內(nèi)最強的血管生長因子[10]。VEGF與其受體（VEGFR）相結(jié)合可誘導腫瘤血管生成、促進腫瘤生長，還能誘導生存素的表達而保護腫瘤內(nèi)皮細胞逃避化療引起的凋亡[11]。TNF-α和IL-6是炎性反應的因子之一，參與細胞微環(huán)境的改變[12-14]，對肝癌腫瘤細胞有著直接細胞毒作用。因此，本研究選取VEGF、TNF-α和IL-6作為反映細胞因子抑制作用的指標。

多靶點酪氨酸激酶抑制劑索拉非尼能夠抑制VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3，是唯一被美國FDA批準用于肝癌晚期患者的藥物，且在治療晚期肝癌上取得了突破性進展。阿帕替尼是我國自主研制的抗血管生成靶向藥，是酪氨酸激酶受體抑制劑，通過結(jié)合細胞內(nèi)VEGFR-2的腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）位點，阻斷下游細胞信號傳導來抑制惡性腫瘤血管生成[15]。阿帕替尼被證實在晚期胃癌患者中安全有效[16]。目前已被我國食品藥品監(jiān)督管理總局批準用于治療二線化療失敗的晚期胃癌患者。

本實驗中，MTT檢測兩藥物對肝癌細胞的生長抑制率結(jié)果顯示：每種藥物濃度下，索拉非尼組生長抑制率高于阿帕替尼組，由此可知索拉非尼對細胞增殖能力的抑制作用強于阿帕替尼。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示：索拉非尼組、阿帕替尼組的細胞遷徙面積比率均小于對照組，索拉非尼組的遷徙面積小于阿帕替尼組，同樣說明索拉非尼對肝癌細胞遷移的抑制作用大于阿帕替尼。ELISA實驗檢測結(jié)果顯示索拉非尼組、阿帕替尼組的VEGF、TNF-α及IL-6的含量均小于對照組；索拉非尼組的VEGF、TNF-α及IL-6的含量均小于阿帕替尼，表明索拉非尼對細胞因子的抑制能力強于阿帕替尼，在抗血管活性方面，索拉非尼較阿帕替尼有明顯的優(yōu)勢。綜上所述，索拉非尼、阿帕替尼都對人肝癌SMMC-7721細胞的增殖、遷移、細胞因子有抑制作用，索拉非尼作用強于阿帕替尼。

[1]Fong Z V, Tanabe K K. The clinical management of hepatocellular carcinoma in the United States, Europe, and Asia: a comprehensive and evidence-based comparison and review [J]. Cancer, 2014, 120（18）: 2824-2838. DOI:10.1002/cncr.28730.

[2]LencioniR, Petruzzi P, Crocetti L. Chemoembolization of hepatocellular carcinoma [J]. Semin Intervent Radiol, 2013,13（9 pt 2）: S211-S221.

[3]Bruix J, Raoul J L, Sherman M, et al. Efficacy and safety of sorafenib in patients with advanced hepatocellular carcinoma:subanalyses of a phase III trial [J]. J hepatol, 2012, 57（4）:821-829. DOI: 10.1016/j.jhep.2012.06.014.

[4]Zhang H. Apatinib for molecular targeted therapy in tumor[J]. Drug Des Devel Ther, 2015, 9（11）: 6075-6081. DOI:10.2147/DDDT.S97235.

[5]Meinhardt G, Bruix J, Llovet J, et al. Analysis of tumor growth rate for advanced hepatocellular cancer patients receiving placebo or sorafenib in the phase 3 SHARP and Asia Pacific trials [J]. Ann Oncol, 2016, 27（suppl 6）: 704P.

[6]Okita K, Kumada H, Ikeda K, et al. Phase Ⅰ/Ⅱ study of E7080（lenvatinib）, a multitargeted tyrosine kinase inhibitor, in patients（ pts） with advanced hepatocellular carcinoma（ HCC）:initial assessment of response rate [J]. J Clin Oncol, 2012, 30（4_suppl）: 320. DOI: 10.1200/jco.2012.30.4_suppl.320.

[7]Romano F, Nespoli S, Garancini M, et al. Critical aspects in the management of HCC: Indications to hepatic resection according to BCLC system [J]. HPB, 2016, 18（2）: e702.DOI: 10.1016/j.hpb.2016.01.108.

[8]Cheng A L, Guan Z, Chen Z, et al. Efficacy and safety of sorafenib in patients with advanced hepatocellular carcinoma according to baseline status: subset analyses of the PhaseⅢsorafenib Asia–Pacific trial [J]. Eur J Cancer, 2012, 48（10）:1452-1465. DOI: 10.1016/j.ejca.2011.12.006.

[9]祝普利,尹 超,馮建龍.原發(fā)性肝癌綜合治療進展[J].臨床肝膽病雜志, 2015, 31（6）: 965-968. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2015.06.034.

[10]Peng H, Zhang Q, Li J, et al. Apatinib inhibits VEGF signaling and promotes apoptosis in intrahepatic cholangiocarcinoma [J].Oncotarget, 2016, 7（13）: 17220-17229. DOI: 10.18632/oncotarget.7948.

[11]Peng S, Zhang Y, Peng H, et al. Intracellular autocrine VEGF signaling promotes EBDC cell proliferation, which can be inhibited by Apatinib [J]. Cancer Lett, 2016, 373（2）: 193-202. DOI: 10.1016/j.canlet.2016.01.015.

[12]Zhu Y, Cheng Y, Guo Y, et al. Protein kinase D2 contributes to TNF-α-induced epithelial mesenchymal transition and invasion via the PI3K/GSK3β/β-catenin pathway in hepato cellular carcinoma [J]. Oncotarget, 2016, 7（5）: 5327-5341.DOI: 10.18632/oncotarget.6633.

[13]Ikeda K, Kudo M, Kawazoe S, et al. Phase 2 study of lenvatinib in patients with advanced hepatocellular carcinoma[J]. J Gastroenterol, 2017, 52（4）: 512-519. DOI: 10.1007/s00535-016-1263-4.

[14]Li J, Qin S, Xu J, et al. Apatinib for chemotherapy-refractory advanced metastatic gastric cancer: results from a randomized,placebo-controlled, parallelarm, phase Ⅱ trial [J]. J Clin Oncol，2013, 31（26）: 3219-3225. DOI: 10.1200/JCO.2013.48.8585.

[15]Hu X, Cao J, Hu W, et al. Multicenter phase Ⅱ study of Apatinib in non-triple-negative metastatic breast cancer [J]. BMC Cancer,2014, 7（14）: 820. DOI: 10.1186/1471-2407-14-820.

[16]秦叔逵，李 進.阿帕替尼治療胃癌的臨床應用專家共識[J]. 臨床腫瘤學雜志，2015（9）: 841-847.