陳曉龍，李耀，陳光靜，金新開，闞建全,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶，400715) 3(西南大學 園藝園林學院，重慶，400715)

花椒麻味物質分子印跡固相萃取柱的制備及其應用

陳曉龍1，李耀1，陳光靜1，金新開3，闞建全1,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶，400715) 3(西南大學 園藝園林學院，重慶，400715)

以α-(羥基)-山椒素分子結構類似物為模板分子、2-乙烯基吡啶(2-vinylpyridine,2-Vpy)為功能單體、二甲基丙烯酸乙二醇酯(ethyleneglycol dimethacrylate,EDMA)為交聯(lián)劑,按1∶4∶20的摩爾比合成了花椒麻味物質硅膠表面分子印跡聚合物，并以合成的硅膠表面分子印跡聚合物為固相萃取柱填料，制備了花椒麻味物質分子印跡固相萃取柱，確定了該固相萃取柱的最佳上樣溶劑、淋洗溶劑及洗脫溶劑，用此固相萃取柱對花椒油樹脂中的花椒麻味物質進行分離純化。結果表明，該固相萃取柱對花椒麻味物質表現(xiàn)出優(yōu)異的特異性吸附效果，可以分離純化出相對純度為93.66 %的花椒麻味物質。

花椒；分子印跡聚合物；分子印跡固相萃取柱；高效液相色譜；氣相-質譜聯(lián)用儀

花椒(ZanthoxylumL.)是蕓香科花椒屬植物，又稱為大椒、秦椒、蜀椒、川椒或山椒。在我國分布廣泛，北起東北南部，南至五嶺北坡，東南至江浙沿海，西南至西藏東南部，從平原至海拔較高的山地均有栽種[1]?；ń肥且环N特色的，有2 000多年歷史的香辛料和中藥材，被譽為“八大調味品”之一，具有溫中祛寒、殺蟲止痛、健胃止瀉、祛濕等功效[2]?；ń分泻卸喾N化學成分，如揮發(fā)油、生物堿、酰胺、香豆素、甾醇和三萜類等[3]，其中酰胺類物質是花椒中具有麻味作用的主要成分，具有鎮(zhèn)痛[4]、麻醉[5]、殺蟲抑菌[6]、抗腫瘤[7-8]等藥理作用。目前對花椒麻味物質的分離提純方法主要有水提法[9]、有機溶劑提取法[10-11]、超臨界CO2萃取法[12-13]、逆流干柱層析法[14]、制備型液相色譜法[15]等，但這些分離提純方法存在一定缺陷，如水提法、有機溶劑提取法提取效率低、雜質含量高，超臨界CO2萃取法、逆流干柱層析法、制備型液相色譜法等提取步驟繁瑣。

分子印跡固相萃取柱(molecularly imprinted solid-phase extraction,MISPE)是以具有高選擇性的分子印跡聚合物為吸附劑，能選擇性分離富集復雜樣品中痕量分析物，有效去除雜質干擾，進而提高分析的準確度和靈敏度[16]。與傳統(tǒng)的固相萃取柱相比，分子印跡固相萃取克服了試樣體系復雜、預處理繁瑣等不利因素，提高了分析準確性[17]。目前，分子印跡固相萃取柱在藥物、食品、環(huán)境以及生物等領域已得到了廣泛應用[18]。

本實驗以α-(羥基)-山椒素分子結構類似物(分子結構式見圖1)為模板分子、2-Vpy為功能單體、EDMA為交聯(lián)劑合成了花椒麻味物質硅膠表面分子印跡聚合物，并以合成的硅膠表面分子印跡聚合物為固相萃取柱填料，制備了花椒麻味物質分子印跡固相萃取(HJMS-MISPE)，為花椒中花椒麻味物質的分離、提純提供了更加快速、經濟、高效的方法。

圖1 α-(羥基)-山椒素分子結構類似物Fig.1 Molecular structure of the α-(OH)-sanshool

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-(羥基)-山椒素分子結構類似物：實驗室自備，純度(95%)；硅膠(100目)，青島海洋化工有限公司；γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)，阿拉丁試劑；丙烯酰氯，阿拉丁試劑；三乙胺，成都市科龍化工試劑廠；二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)，上海國藥集團；偶氮二異丁腈(AIBN)，成都市科龍化工試劑廠；2-乙烯基吡啶(2-Vpy)，上海國藥集團；甲醇、乙腈、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、石油醚(沸程30～60 ℃)、二氯甲烷、甲苯均為分析純，購自成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

真空干燥箱(DZF-6020)，上海齊欣科學儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)器(R-215)，瑞士步琦公司；高效液相色譜(Aligent-1260)，安捷倫公司；氮吹儀(UGC-12C)，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；恒流泵(HL-1B)，上海滬西分析儀器廠有限公司；氣相-質譜聯(lián)用儀(GC-MS)，日本島津。

1.3 實驗方法

1.3.1 表面分子印跡聚合物的制備

硅膠的活化[19]：稱取硅膠10 g，置于500 mL平底燒瓶中，加入6 mol/L的HCl溶液300 mL，常溫磁力攪拌 24 h后過濾并用大量的去離子水洗滌硅膠直至中性，再用丙酮洗滌，洗滌后的硅膠于110 ℃烘干備用。

活化硅膠的?；痆20-23]：稱取活化后的硅膠5 g，于500 mL的圓底三口燒瓶中，加入無水甲苯150 mL，常溫磁力攪拌條件下緩慢加入30 mL的APTS，再緩慢加入10 mL的吡啶，氮氣保護下95 ℃磁力攪拌反應24 h。將所得固體過濾，依次用甲苯、丙酮、乙醚、甲醇分別洗滌3次，110 ℃干燥12 h，得氨基化硅膠。稱取氨基化硅膠4 g于250 mL圓底三口燒瓶中，加入無水甲苯100 mL，磁力攪拌15 min后，緩慢加入8 mL丙烯酰氯，磁力攪拌10 min后，再緩慢添加5 mL的三乙胺作為反應催化劑，滴加完畢后于氮氣保護下室溫磁力攪拌24 h，產物依次用50 mL甲苯、純水、乙醇洗滌3次，于110 ℃干燥后備用。

稱取271 mg(1 mmol)花椒麻味物質的替代模板分子于100 mL圓底燒瓶中，依次加入80 mL乙腈，4 mmol功能單體2-Vpy，800 mg酰基化硅膠，超聲30 min，使其充分溶解分散后，加入20 mmol交聯(lián)劑EDMA和40 mg引發(fā)劑AIBN，向混合液中通氮氣20 min，并在氮氣保護下用封口膜密封燒瓶；磁力攪拌下于50 ℃恒溫水浴鍋內熱引發(fā)聚合4 h后再于60 ℃恒溫水浴鍋內熱引發(fā)聚合20 h，所得固體以甲醇-乙酸(體積比9∶1)為溶劑進行索氏提取，直至索氏提取器內溶液不含類模板分子為止，再用甲醇反復洗滌聚合物以除去其中殘留的乙酸，將處理好的分子印跡聚合物放置于真空干燥箱內，60 ℃干燥至恒重，待用，并記為SMIP?？瞻追怯≯E聚合物的制備及處理方法與表面分子印跡聚合物的制備步驟相同，只是在聚合物合成過程中不加入替代模板分子，記為SNIP。

1.3.2 分子印記聚合物的吸附性能研究

準確稱取50.0 mg SMIP和SNIP，分別置于20 mL具塞錐形瓶中，分別加入8 mL質量濃度為250 μg/mL的HJMS氯仿溶液?；旌先芤河?5 ℃恒溫水浴振蕩器中，使聚合物與HJMS分子相互作用，每隔一段時間t(60、90、120、150、180、210、240、300 min)后，取出SMIP和SNIP上清液各1份，測定其中HJMS的含量，繪制HJMS吸附量Q(mg/g)與吸附時間t之間的變化曲線[24]。

1.3.3 分子印跡固相萃取柱的制備

取2只內徑為12.7 mm，長為66 mm的聚丙烯空柱，先用玻璃棒把一層聚乙烯篩板推到柱體底部，將長頸漏斗置入柱體中，分別在漏斗中加入處理過的SMIP和SNIP填料，輕輕提起漏斗，柱床體積為6 mL，裝填料后，緩慢注入5 mL甲醇通過固相萃取柱，再用玻璃棒把另一層聚乙烯篩板頂入柱體，使其在填料上表面固定，輕輕按壓使其表面平齊。

1.3.4 分子印跡固相萃取柱的優(yōu)化

1.3.4.1 上樣原液的制備

取1.45 g花椒油樹脂置于75 mL三氯甲烷中，于35 ℃下150 r/min振蕩提取4 h，再將其轉移到分液漏斗中，振搖2 min，靜置分層后，收集三氯甲烷萃取液，定容于100 mL容量瓶中，將其作為固相萃取柱的上樣原液于4 ℃下避光保存待用。

1.3.4.2 上樣溶劑種類及上樣量的選擇[25]

實驗選取相同體積的丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷和乙腈分別作為上樣的溶劑[26]。取1 mL上樣原液分別用上述上樣溶劑稀釋至25 mL作為上樣液，相同操作下分別上樣1.6倍柱床體積的上樣液(經檢測，其中花椒麻味物質濃度為0.35 mg/mL)，高效液相色譜法分別檢測上樣液和流出液中花椒麻味物質的濃度，差減法計算出花椒麻味物質在固相萃取小柱中的保留率B[27]，保留率最大的溶劑為最佳上樣溶劑，見式(1)：

(1)

式中：C1為上樣流出液中花椒麻味物質的質量，mg；C0為上樣液中花椒麻味物質的質量，mg。

以保留效果最佳的溶劑為上樣溶劑，分別上樣4、5、6、7、8 mL，高效液相檢測流出液中花椒麻味物質的濃度，流出液中檢測不出花椒麻味物質的最大體積為最大上樣量。

1.3.4.3 淋洗溶劑種類的選擇[28]

參照王遵臣[29]等的方法選取相同體積的乙腈、三氯甲烷、甲苯、甲醇/水溶液(體積比5∶5)分別作為淋洗溶劑。MISPE柱中的吸附劑不僅吸附目標分子，還有些雜質會被同時吸附。因此，先用淋洗劑除去雜質，再洗脫目標物質，以減少雜質對目標物質的影響[30]，先用1倍柱床體積的上樣液上樣，再分別用乙腈、三氯甲烷、甲苯、甲醇/水(體積比5∶5)各0.8倍柱床體積對其進行淋洗，收集淋洗液，高效液相色譜法測其中花椒麻味物質的濃度。計算淋洗后花椒麻味物質在固相萃取柱上的保留率，保留率見式(2)：

(2)

式中：m1為淋洗流出液中花椒麻味物質的質量，mg；m0為上樣液中花椒麻味物質的質量，mg。

1.3.4.4 洗脫液用量的確定[31]

固定制備好的MISPE柱，用1倍柱床體積的上樣溶液上樣， 0.8倍柱床體積的淋洗液淋洗后，再依次用6、8、10、12 mL的甲醇進行洗脫，收集洗出液，高效液相色譜法測其中花椒麻味物質的濃度，當花椒麻味物質的回收率接近100%的最小體積為洗脫液用量。根據上樣液與洗脫液中花椒麻味物質量的變化計算花椒麻味物質的回收率[32]，回收率定義為式(3):

(3)

式中：R為花椒麻味物質的回收率；NP為經過萃取柱后洗脫溶液中所含花椒麻味物質的質量，mg；NC表示初始上樣液中含有花椒麻味物質的質量，mg。

1.3.5 分子印跡固相萃取柱的實際應用

在最佳的上樣溶劑、淋洗溶劑、洗脫溶劑下進行過柱。用高效液相色譜分別測定上樣液與固相萃取柱流出液中花椒麻味物質的純度。其高效液相色譜條件為：色譜柱-Agilent EclipseXDB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動相-甲醇∶水(體積比60∶40)，流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫40 ℃，紫外檢測波長254 nm。GC-MS條件為：氣相色譜條件:色譜柱為石英毛細管柱HP-1(30 m×0.25 mm)，進樣口溫度 280 ℃，采用程序升溫：起始溫度50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至140 ℃，接著以10 ℃/min升至180 ℃，再以15 ℃/min升至260 ℃，保持5 min。進樣量1 μL，載氣氦氣流速1.0/min，分流比10∶1。質譜條件：EI離子源，連接質譜接口溫度 280 ℃，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃，倍增器電壓1.8 kV；質量掃描范圍為m/z：35～500，掃描間隔1 s。

1.3.6 試驗數據處理方法

每個實驗重復3次，用Origin8.0和Excel 2003處理實驗數據并作圖，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 表面分子印跡聚合物的吸附特性

如圖2所示，在前180 min，吸附速率較快，在吸附210 min以后吸附量基本保持不變，達到吸附平衡。吸附動力學試驗結果表明，SMIP對花椒麻味物質的飽和吸附時間為210 min，對花椒麻味物質的最大吸附容量為(24.92±0.81) mg，特異因子α=(2.91±0.09)。

圖2 SMIP及SNIP對花椒麻味物質吸附動力學分析Fig.2 Binding dynamics of SMIP and SNIP to HJMS

2.2 上樣溶劑種類及上樣量的選擇

由圖3-A所示，當以丙酮作為上樣溶劑時，HJMS的保留率最低(MISPE和NISPE分別為(40.05±4.39)%和(29.64±3.71)%，當以二氯甲烷作為上樣溶劑時，HJMS的保留率最高(MISPE和NISPE分別為(78.72±5.36)%和(40.46±4.23)%，即MISPE對HJMS的保留能力隨著上樣溶劑極性增大而降低，這是因為溶劑極性太大則會破壞特異性印跡位點與花椒麻味物質之間的氫鍵結合[33]。故選二氯甲烷為上樣溶劑。

為了確定MISPE的最大上樣量，分別取4、5、6、7、8 mL的上樣液(其中花椒麻味物質的質量濃度為0.35 mg/mL)上樣，分別計算保留率。如圖3-B所示，當上樣量為 4、5、6 mL時花椒麻味物質在MISPE中的保留率均是100%，即這些過程中均沒有花椒麻味物質穿漏，當上樣量為7 mL時MISPE對HJMS的保留率為(88.71±3.36)%，即上樣液中約12%的花椒麻味物質沒有被MISPE吸附。因此，當固相萃取柱的柱床體積為6 mL時，選擇1倍柱床體積的0.35 mg/mL的花椒麻味物質上樣液作為最大上樣量[34]。

2.3 淋洗溶劑種類的選擇

在分子印跡固相萃取實驗中，淋洗溶劑的選擇應盡可能地消除分子印跡聚合物對模板分子非特異性相互作用而最大限度地保留住特異性相互作用[29]。為了最大限度地保留MISPE柱的特異性吸附性能，而且盡可能降低雜質等非特異性吸附的干擾，實驗分別考察了以乙腈、三氯甲烷、甲苯、甲醇/水溶液(體積比5∶5)作為淋洗劑時，固相萃取柱對花椒麻味物質的保留率。由圖3-C可知，當以甲醇/水(體積比5∶5)作為淋洗劑時，HJMS在MISPE上的保留率最低。當以三氯甲烷和甲苯作為淋洗劑時，MISPE對HJMS的保留率均為100%，即MISPE柱中沒有HJMS被淋洗下來；但三氯甲烷和甲苯分別作為淋洗劑時，NISPE柱上非特異吸附的花椒麻味物質的保留率分別為(51.47±3.92)%和(85.04±6.09)%，說明三氯甲烷作為淋洗劑時能比甲苯更好的消除非特異性吸附力的影響。因此，淋洗溶劑選用氯仿溶液。

2.4 洗脫液種類及用量的選擇

本實驗選擇甲醇作為洗脫溶劑，分別以6、8、10、12 mL的甲醇作為洗脫液計算回收率[35-36]，結果如圖3-D所示，甲醇用量為10 mL時，MISPE上的HJMS的回收率為(98.57±2.18)%，即HJMS幾乎全部被洗脫下來。因此，當固相萃取柱的柱床體積為6 mL，取1倍柱床體積的上樣液時，選用10 mL約1.7倍柱床體積的甲醇作為洗脫液[28]。

A-不同上樣溶劑對MISPE和NISPE中花椒麻味物質保留率的影響；B-上樣體積對MISPE和NISPE中花椒麻味物質保留率的影響；C-不同淋洗溶劑對MISPE和NISPE中花椒麻味物質保留率的影響；D-甲醇用量對MISPE中花椒麻味物質回收率的影響圖3 固相萃取柱優(yōu)化結果圖Fig.3 Optimization diagram of solid phase extraction column

2.5 高效液相色譜檢測花椒麻味物質的分離純化結果

采用高效液相色譜法，在相同檢測條件下對花椒麻味物質標準品和固相萃取柱分離純化得到的產物進行定性確證，結果見表1。

表1 液相色譜圖的分析結果Table 1 Analysis results of HPLC chromatogram

花椒麻味物質標準品的3個峰的平均保留時間分別是(13.961±0.237)、(14.538±0.221)、(14.908±0.256) min，固相萃取柱分離純化得到的產物的3個峰的平均保留時間分別是(13.718±0.218)、(14.235±0.206)、(14.752±0.202) min，經均值差異性檢驗，花椒麻味物質標準品的3個峰的平均保留時間與固相萃取柱分離純化得到的產物的平均保留時間相比，無顯著性差異(p>0.05)，可確證分離純化出的物質的主要成分是花椒麻味物質；上樣液中花椒麻味物質的峰面積占總峰面積的76.15%，固相萃取柱分離純化得到的花椒麻味物質占總峰面積的94.10%，花椒麻味物質占總峰面積的比例提高了18%，從圖4看出，固相萃取柱流出液的HPLC圖主要有3個峰，中間峰最大[37-38]。

A-花椒麻味物質標準品的高相液相色譜圖；B-上樣液的HPLC圖；C-固相萃取柱流出液的HPLC圖圖4 花椒麻味物質的高效液相色譜圖Fig.4 Chromatogram of HPLC

2.6 氣相色譜-質譜聯(lián)用檢測花椒麻味物質的分離純化結果

GC-MS儀器檢測花椒麻味物質標準品、上樣液、固相萃取柱流出液的氣相色譜-質譜總流圖見圖5。經NIST05.LIB譜庫檢索和峰面積歸一化法計算[39]，其分析結果分別見表2～表4。

A-花椒麻味物質標準品的氣相色譜-質譜總離子流圖；B-上樣液的氣相色譜-質譜總離子流圖；C-固相萃取柱流出液的氣相色譜-質譜總離子流圖圖5 花椒麻味物質的氣相色譜-質譜總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatogram of the numb-taste component

由圖5-A和表2可知，花椒麻味物質標準品主要成分為酰胺類物質，其中山椒素1含量為11.72%、山椒素2的含量為13.91%、長碳鏈不飽和酰胺類物質1的含量為19.42%、長碳鏈不飽和酰胺類物質2的含量為10.51%、長碳鏈不飽和酰胺類物質3的含量為17.08%；由圖5-B和表3可知，氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測出上樣液中主要含50種成分，酰胺類物質即花椒麻味物質在上樣液中的相對含量為30.81%；由圖5-C和表4可知，經過分子印跡固相萃取柱分離純化得到的產物中花椒麻味物質的相對含量為93.66%，說明上樣液在經過分子印跡固相萃取柱分離后可得到純度較高的花椒麻味物質，其中酰胺類物質4的含量最高，為28.71%，其次酰胺類物質3的含量為22.27%，酰胺類物質7的含量為11.16%、酰胺類物質8的含量為6.12%、酰胺類物質9的含量為8.22%，酰胺類物質10的含量為6.84%[40-41]。

表2 花椒麻味物質標準品的組分及其相對含量Table 2 The component and relative content component of the numb-taste component standards

表3 花椒油樹脂的組分及其相對含量Table 3 The component and relative content component of Zanthoxylum oil resin ingredient

續(xù)表3

序號保留時間/min化合物名稱(英文名稱)質荷比(m/z)相對含量/%2919 581β?瑟林烯(β?selinene)2040 743019 796巴倫西亞橘烯(naphthalene)2041 783120 156欖香腦(elemenolic)2220 793221 056杜松醇(cadinol)2220 623321 358橙花叔醇(nerolidol)2226 383421 768氧化石竹烯(caryophylleneoxide)2200 473522 167斯巴醇(spathalenol)2220 533623 8512，3?二甲基?2，3?二苯基丁烷(2，3?dimethyl?2，3?diphenylbutane)2380 353725 791十七烷(heptadecane)2400 573826 5732?十六烯酸(hypogaeicacid)2540 143927 646棕櫚酸(palmiticacid)2560 224031 269羥基?山椒素12451 514131 632羥基?山椒素22450 544234 261山椒素12633 624335 381山椒素22633 484435 765山椒素32631 234537 106山椒素52630 284640 453長碳鏈不飽和酰胺類物質12927 764740 935長碳鏈不飽和酰胺類物質22922 434841 373長碳鏈不飽和酰胺類物質32965 084941 572長碳鏈不飽和酰胺類物質42964 885044 362反?9?十八碳烯酸甲酯(methylelaidate)2980 11

表4 固相萃取柱流出液的組分及其相對含量Table 4 The component and relative content component of the sample liquid passing solid-phase extraction column

3 結論

用硅膠表面分子印跡聚合物制成固相萃取柱，確定了該固相萃取柱的最佳上樣溶劑為二氯甲烷，最佳淋洗溶劑為三氯甲烷，最佳洗脫溶劑為甲醇，用此固相萃取柱對花椒油樹脂中的花椒麻味物質進行分離純化，結果表明，該固相萃取柱對花椒麻味物質表現(xiàn)出優(yōu)異的特異性吸附效果，可以分離純化出相對純度為93.66 %的花椒麻味物質，與其它提取純化花椒麻味物質的研究方法相比，該方法更加快速、經濟、高效。

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ThepreparationandapplicationoftheChinesepricklyash'smolecularlyimprintedsolid-phaseextraction

CHEN Xiao-long1,LI Yao1,CHEN Guang-jing1,JIN Xin-kai3,KAN Jian-quan1,2*

1(College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715 China) 2(Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation,Chongqing 400715,China) 3(College of Gardening,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The molecularly imprinted polymers was synthesized by molecular structure analogues of α-(OH)-sanshool as the template molecule,2-Vpy as functional monomer,EDMA as the crosslinking agent and at the proportion of 1∶4∶20.The optimal sample solvent,drip washing solvent and elution solvent were selected out and the SMIP was used to separate and purify the numb taste components in Zanthoxylum oleoresin.The results show that the SMIP had specific adsorption to the numb taste components,and 93.66% of pure numb taste components can be separated.

Chinese prickly ash; molecularly imprinted polymer; molecularly imprinted solid-phase extraction (MISPE); high performance liquid chromatography (HPLC); gas chromatography mass spectrometry (GC-MS)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014711

碩士研究生(闞建全教授為通訊作者，E-mail：kanjianquan@163.com)。

國家自然科學基金(31371834)

2017-05-06，改回日期：2017-06-01