劉克洪 李景琦 高 堅 (武警浙江省總隊杭州醫(yī)院康復(fù)中心，浙江 杭州 310051)

普拉格雷干預(yù)對腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響及可能機制

劉克洪 李景琦 高 堅 (武警浙江省總隊杭州醫(yī)院康復(fù)中心，浙江 杭州 310051)

目的考察普拉格雷對腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響及可能機制。方法雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型組和普拉格雷組3組，每組40只。假手術(shù)組與模型組灌胃給予生理鹽水，普拉格雷組給予普拉格雷10 mg·kg-1·d-1，連續(xù)給藥14 d。記錄或檢測各組行為障礙、組織病理學改變、腦內(nèi)半胱天冬酶(Caspase)-3及程序化死亡基因(PDCD)-5表達情況，外周血超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及S-100β蛋白表達情況。結(jié)果與假手術(shù)組比，模型組及普拉格雷組神經(jīng)功能評分升高顯著(P<0.05)；與模型組比較，普拉格雷組神經(jīng)功能評分顯著降低(P<0.05)。假手術(shù)組腦組織細胞結(jié)構(gòu)完整；模型組細胞排列紊亂，水腫嚴重，血管充血；與模型組比較，普拉格雷組腦組織結(jié)構(gòu)較完整，且壞死及水腫程度降低。與假手術(shù)組比，模型組可見大量Caspase-3和PDCD-5細胞(P<0.05)，SOD明顯降低(P<0.05)，MDA、NSE和S-100β明顯增高(P<0.05)；與模型組比，普拉格雷組Caspase-3和PDCD-5細胞顯著降低(P<0.05)，SOD明顯增高(P<0.05)，MDA、NSE和S-100β明顯降低(P<0.05)。結(jié)論普拉格雷可以通過抑制Caspase-3及PDCD-5凋亡因子，調(diào)控SOD、MDA、NSE及S-100β表達從而改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能障礙。

普拉格雷；腦梗死；半胱天冬酶-3；程序化死亡基因；超氧化物歧化酶；丙二醛；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；S-100β

腦梗死后神經(jīng)功能的改善成為近年來研究的難點和熱點，針對腦梗死動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，抑制凋亡及保護神經(jīng)成為治療的重點〔1〕。普拉格雷作為第三代血小板抑制劑，可與P2Y12受體相結(jié)合，從而發(fā)揮更強更迅速的抗血小板聚集作用，是一種已處于Ⅲ期臨床試驗的藥物〔2〕，然而有關(guān)普拉格雷可否改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能的研究至今缺如，其可改善神經(jīng)保護的機制也未知。本文探究普拉格雷對腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響及可能機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 雄性Wistar大鼠(北京維通利華公司)120只，8～10周齡，體重180～220 g，隨機分為假手術(shù)組，模型組和普拉格雷組各40只。

1.2腦梗死大鼠的制備 大鼠全麻后置于操作臺上，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)，頸外動脈(ECA)及頸內(nèi)動脈(ICA)。結(jié)扎ECA及CCA近心端。在CCA近分叉處插入備用魚線，將栓線送至大腦中動脈分叉處，平均進線(18.5±0.5)mm(ECA與ICA分叉處為起點)，栓線尾端留于皮膚外，栓塞90 min后抽線實現(xiàn)再灌注。以大鼠清醒后爬行時右轉(zhuǎn)圈，提尾時右前肢內(nèi)收屈曲為納入標準。假手術(shù)組操作同上，僅暴露各組血管，而不進行線栓插入〔3〕。

1.3給藥 假手術(shù)組和模型組均灌胃給予生理鹽水，劑量10 ml·kg-1·d-1，普拉格雷組給予普拉格雷10 mg·kg-1·d-1，連續(xù)給藥14 d。

1.4神經(jīng)功能評分〔3〕記錄所有大鼠治療后的神經(jīng)功能評分。0分：活動自如，未有障礙；1分：存在活動障礙，左側(cè)前爪無力；2分：存在活動障礙，推手術(shù)側(cè)肩部，發(fā)現(xiàn)對側(cè)的移動阻力降低；3分：存在活動障礙，大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)圈；4分：活動障礙明顯，無肢體活動。分值越高提示行為障礙越明顯。

1.5腦組織病理 治療后，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠處死，取腦組織，參照固定-脫水-包埋-切片-染色等步驟，光鏡觀察病理形態(tài)。

1.6Caspase-3及程序化死亡基因(PDCD)-5在腦組織的表達 選擇1.5的切片，按照脫蠟-透明-脫水-抗原修復(fù)-抗體孵育-染色等步驟，光鏡觀察Caspase-3及PDCD-5表達情況。按染色強度與陽性細胞數(shù)比例確定陽性情況，無著色0分，<1%為1分、1%～10%為2分，11%～33%為3分，34%～66%為4分，67%～100%為5分，染色強度按無、弱、中和強分別為0、1、2和3分，陽性細胞百分率評分+細胞染色強度評分≥3為陽性，否則為陰性。

1.7外周血超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)表達 治療前后，自大鼠眼球取血，靜置2 h，離心取血清，按照說明書操作步驟〔3〕，并應(yīng)用儀器檢測吸光度并計算SOD和MDA的相對含量。SOD和MDA試劑購于美國CST公司。

1.8外周血神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及S-100β蛋白表達 治療前后，自大鼠眼球取血，高速離心取上清，以酶標儀采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定NSE及S-100β水平，嚴格按照試劑盒說明書操作，NSE及S-100β試劑盒均購于R&D公司。

1.9統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組治療前后的神經(jīng)功能評分 治療前，與假手術(shù)組比較，模型組及普拉格雷組神經(jīng)功能評分較治療前顯著升高(P<0.05)，治療后，普拉格雷組神經(jīng)功能評分較治療前顯著降低(P<0.05)，與模型組比較，普拉格雷組神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.2各組腦組織病理學比較 假手術(shù)組腦組織細胞結(jié)構(gòu)完整；模型組細胞排列紊亂，水腫嚴重，血管充血；與模型組比較，普拉格雷組腦組織結(jié)構(gòu)較完整，且壞死及水腫程度降低，見圖1。

表1 各組治療前后的神經(jīng)功能評分分)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.3各組腦Caspase-3及PDCD-5表達 假手術(shù)組未見Caspase-3 和PDCD-5陽性細胞，模型組見大量Caspase-3〔32例(80.00%)〕和PDCD-5陽性細胞〔35例(87.50%)〕(χ2=53.333，62.222，均P=0.000)；與模型組比較，普拉格雷組Caspase-3 和PDCD-5陽性率〔17例(42.50%)、15例(37.50%)〕明顯降低(χ2=8.717,P=0.003 0;χ2=21.333,P=0.000 0)，見圖2。

2.4各組治療前后外周血SOD及MDA水平比較 治療前，與假手術(shù)組比較，模型組及普拉格雷組SOD顯著降低(P<0.05)，MDA顯著升高(P<0.05)；治療后，較治療前普拉格雷組SOD顯著增高(P<0.05)，MDA顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，普拉格雷組SOD顯著增高(P<0.05)，MDA顯著降低(P<0.05)，見表2。

圖1 各組腦組織的HE染色(×400)

圖2 各組腦組織Caspase-3及PDCD-5表達(×400)

2.5各組治療前后外周血NSE及S-100β水平比較 治療前，與假手術(shù)組比較，模型組及普拉格雷組NSE及S-100β顯著增高(P<0.05)；治療后，普拉格雷組NSE及S-100β顯著降低(P<0.05)，與模型組比較，普拉格雷組NSE及S-100β顯著降低(P<0.05)，見表3。

表2 各組治療前后外周血SOD及MDA水平比較分)

表3 各組治療前后外周血NSE及S-100β水平比較分)

3 討 論

腦梗死發(fā)生機制不明，但腦組織缺血缺氧導(dǎo)致的細胞凋亡及氧自由基增高，促使多種腦組織損傷特異性蛋白，如NSE及S-100β分泌增多，誘導(dǎo)腦組織神經(jīng)功能的損傷。NSE多由神經(jīng)元細胞分泌，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)特異性蛋白，生理狀態(tài)下的血清水平較低，難以被檢測到，但當顱內(nèi)缺血缺氧時，胞質(zhì)內(nèi)的NSE即進入血液循環(huán)，外周血增高的NSE可作為顱內(nèi)損傷的標志物〔4～7〕；S-100β可在多種腦內(nèi)細胞內(nèi)表達，但表達受限，參與腦細胞的多種代謝過程，被認為是腦損傷的特異性標記蛋白〔8～10〕。

腦梗死發(fā)病的重要因素之一是細胞凋亡，細胞凋亡受多種基因調(diào)控，線粒體凋亡通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑和死亡受體通路均可干預(yù)凋亡，這三種通路均需要激活下游Caspase-3和PDCD-5等凋亡蛋白才能發(fā)揮誘發(fā)細胞程序性死亡的作用。Caspase-3為通路中的關(guān)鍵因子，是啟動凋亡的重要分子〔11〕。PDCD-5具有早期及始動性的功能，參與線粒體凋亡通路〔12〕。本文結(jié)果提示腦梗死大鼠腦部存在明顯的細胞凋亡。

生理條件下，機體具有清除體內(nèi)多余自由基的功能，然而在缺血缺氧的情況下，氧自由基聚集，損傷腦組織。SOD作為最主要的抗氧化酶，可有效清除體內(nèi)氧自由基；而MDA與線粒體膜的穩(wěn)定性相關(guān)，兩者的含量可反映機體氧自由基情況〔13,14〕。本文結(jié)果提示腦梗死大鼠的氧自由基代謝紊亂。

普拉格雷作為一種新型的抗血小板藥物，是一種前體藥物，可在體內(nèi)活化為活性物質(zhì)，與血小板受體結(jié)合從而發(fā)揮更有效的抗血小板聚集的效果。研究多認為普拉格雷具有較好的預(yù)防和改善心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的功能〔15,16〕。

本文說明普拉格雷可以明顯降低腦梗死大鼠顱內(nèi)凋亡程度。普拉格雷可以顯著減輕腦梗死大鼠氧自由基的分泌。普拉格雷可以降低腦特異性損傷蛋白的分泌，參與腦梗死的修復(fù)。既往研究〔13〕顯示，抗血小板療法可誘發(fā)大腦皮層發(fā)生依賴性神經(jīng)功能重組的變化，使腦梗死恢復(fù)期患者大腦皮層發(fā)生功能重組變化，使患肢運動功能得到恢復(fù)。普拉格雷療法可以通過減輕顱內(nèi)凋亡程度、氧自由基分泌狀況及腦損傷蛋白的合成改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能障礙，然而有關(guān)其深入機制的研究仍需后續(xù)實驗。

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R743.3

A

1005-9202(2017)24-6038-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.015

浙江省自然科學基金資助項目(No.LY12H09006)

李景琦(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腦損傷意識障礙康復(fù)研究。

劉克洪(1983-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)損傷康復(fù)研究。

〔2016-11-29修回〕

(編輯 苑云杰)