楊國峰，李增利，楊鈺華

(1.西安海棠職業(yè)學院 陜西 西安 710038；2.西安市第三中學 陜西 西安 710048)

黃褐斑是一種常見的色素增加性皮膚病，女性多發(fā)。臨床上除了常規(guī)西醫(yī)治療外，中醫(yī)療法也得到較多的應用。近年來，中藥四六湯在黃褐斑的臨床治療中得到廣泛應用[1]。但關于四六湯在黃褐斑治療過程中的具體藥效情況及其作用機制等研究，目前報道較少。為此，本研究通過建立動物模型的方式，從藥效學角度，對四六湯防治黃褐斑的相關作用機制分析研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料：豚鼠40只，均為雌性，健康狀況良好，體重（25±7）g，7周齡。均由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2011-0012。對于本次研究的具體內(nèi)容和研究形式、研究方法等，均向本醫(yī)院倫理學部門進行匯報，接受審核，并經(jīng)批準準予實施。實驗設計方案、使用動物品種品系規(guī)格、處死動物的方法、項目進行中設計動物福利和倫理問題等均符合要求。四六湯，藥方中包含山藥25g，桃仁、當歸、雞血藤、紅花、山茱萸、茯苓、白術、丹參各20g，澤瀉、柴胡、丹皮、甘草、白芍各15g，紫草、白芷、白蒺藜各10g，白僵蠶5g。藥材均購自本地藥房。對藥材進行冷水浸泡后煎煮，對藥液進行蒸發(fā)濃縮，獲得濃度為1.44g/ml的藥液妥善保存?zhèn)溆?。實驗中以維生素C作為對照藥物，購自本地藥房。實驗過程中使用的主要試劑和儀器情況見表1。

表1 主要試劑和儀器

1.2 方法

1.2.1 黃褐斑模型制備和實驗分組：動物購買后均置于本院實驗室中進行為期一周的適應性喂養(yǎng)，待動物適應環(huán)境之后進行分組實驗。對40只動物進行實驗分組，隨機分為四組，每組10只，分別設為空白對照組、動物模型組、維生素C組、四六湯組?？瞻讓φ战M不做任何處理，其他三組均在動物背部取3cm×3cm大小的皮膚進行脫毛，并利用中波紫外線進行照射，制備黃褐斑動物模型。紫外線波長設置為320nm，動物與光源之間的距離保持10cm左右。每只動物每次的照射時間為60min，每日照射1次，各組動物均實施連續(xù)4周的紫外線照射。照射過程中密切觀察各組豚鼠背部脫毛部位皮膚變化情況，如果肉眼觀察黑色素沉著面積擴大、著色加深，局部皮膚出現(xiàn)明顯的黃褐斑，與黃褐斑的臨床表現(xiàn)一致，則視為動物模型制備成功（見圖1）。本次研究中，上述三組均成功制備黃褐斑動物模型，未出現(xiàn)死亡或失敗的情況。

1.2.2 分組處理：維生素C組、四六湯組分被給予維生素C注射液（批準文號：國藥準字H42020431，2010-09-30，湖北天圣康迪制藥有限公司生產(chǎn)）0.1g/kg注射和四六湯灌服治療。動物模型組不給予任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)；維生素C組、四六湯組均連續(xù)給藥4周。

圖1 動物造模前后局部皮膚

1.2.3 取材與相關指標檢測：連續(xù)給藥4周對各組進行尾部采血，之后對各組動物均實施背部脫毛，并在麻醉后予以斷頸處死，處死后快速獲得各組脫毛后皮膚組織送檢。取部分標本檢測各組的性激素水平與SOD、MDA水平[2]。并取部分標本切片后行HE染色，行組織病理學觀察，檢測各組皮損區(qū)黑素顆粒的表達。

1.3 統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)一采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計比較，以P＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動物SOD、MDA水平檢測與對比：實驗動物均進入最終的結(jié)果分析，未出現(xiàn)脫落和中途死亡的動物?？瞻讓φ战M的SOD水平顯著高于動物模型組與維生素C組，MDA水平顯著低于動物模型組與維生素C組（P＜0.05）；四六湯組的SOD水平和MDA水平與空白對照組均存在一定差異，分別低于、高于對照組，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。且四六湯組的SOD水平明顯高于動物模型組與維生素C組，MDA水平顯著低于動物模型組與維生素C組(P＜0.05）。維生素C組的SOD、MDA水平與動物模型組之間也存在明顯差異(P＜0.05）,見表2。

表2 各組動物SOD、MDA 水平檢測對比 （xˉ±s,nmol/mg）

2.2 各組性激素水平檢測與比較：空白對照組的P、E2水平顯著低于動物模型組與維生素C組，T水平顯著高于動物模型組與維生素C組（P＜0.05）。四六湯組的各項指標水平與空白對照組均存在一定差異，四六湯組的P、E2水平高于空白對照組，T水平低于空白對照組，但P＞0.05。且四六湯組的T水平明顯高于動物模型組與維生素C組，P、E2水平顯著低于動物模型組與維生素C組（P＜0.05）。維生素C組的P、E2、T水平與動物模型組之間也存在明顯差異（P＜0.05），見表3。2.3 組織學結(jié)果：經(jīng)HE染色，動物模型組表皮增厚、表皮細胞大小呈不均勻增大。真皮層可見有局灶性炎性細胞浸潤。真皮及皮下組織微血管數(shù)目增生。黑色素細胞在HE染色標本上不易辨認。空白對照組上皮較薄，可看到分成四層，基底層和棘細胞層一起共2～3層，表面有少量角質(zhì)。真皮為染成淺紅色的膠原纖維束交織成網(wǎng)，可見毛囊、皮脂腺與表皮相連，真皮及真皮下可見少量血管（見圖2）。

表3 各組性激素水平檢測比較

表3 各組性激素水平檢測比較

注：＃表示與空白對照組比較，有顯著性差異，P＜0.05；※表示與四六湯組比較，有顯著性差異，P＜0.05；△表示與動物模型組比較，有顯著性差異，P＜0.05

組別 n P（ng/ml） E2（mol/ml） T（ng/ml）空白對照組動物模型組維生素C組四六湯組10 10 10 10 2.31±0.02 6.25±0.34?！?.02±0.21?！?.82±0.03 550.12±12.03 851.32±15.37?！?87.15±16.75＃※△568.12±11.06 15.02±1.32 6.12±0.34?！?0.03±1.03?！?4.16±1.21

圖2 動物皮膚的 HE 染色（×100）

3 討論

從現(xiàn)代醫(yī)學角度分析，黃褐斑屬于原因不明的色素沉著性疾病[3-4]。分析相關的發(fā)病原因，與多種因素相關，包括環(huán)境因素與遺傳因素以及精神因素、妊娠、內(nèi)分泌失調(diào)、氧自由基、濫用避孕藥等[5-6]。

中醫(yī)稱黃褐斑為“肝斑”、“黧黑斑”，并認為屬于一種后天性黑色素沉著過度性皮膚病[7-8]。臨床治療中，四六湯的應用較多，方中包含桃仁、山藥、當歸、紅花、山茱萸、澤瀉、白芍等多種中藥，共同應用，可以滋養(yǎng)肌膚，祛除濁滯，化瘀祛斑[9]。另外，從現(xiàn)代醫(yī)學角度分析，四六湯具有一定的抗氧化作用，進而能夠獲得理想的祛斑效果。本研究從藥效學角度分析其祛斑機制，抗氧化作用與黃褐斑的形成存在密切聯(lián)系，氧自由基與皮膚黑色素的形成及色素沉著有關，正常情況下，機體內(nèi)的氧化與抗氧化酶系統(tǒng)保持著動態(tài)平衡。SOD屬于抗氧化劑，與黑素的產(chǎn)生之間存在一定關系，受到一定因素的影響，其水平會發(fā)生變化，代謝失衡導致黑素生成過多，進而引發(fā)黃褐斑。而提高機體內(nèi)SOD水平，可以有效清除各種多余的超氧自由基，如MDA，進而其形成量顯著減少，從而阻止黃褐斑的產(chǎn)生[10]。研究結(jié)果顯示，對各組動物的SOD、MDA水平進行檢測和比較，空白對照組的SOD水平顯著高于動物模型組與維生素C組，MDA水平顯著低于動物模型組與維生素C組。四六湯組的SOD水平低于空白對照組，MDA水平高于空白對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。且四六湯組的SOD水平明顯高于動物模型組與維生素C組，MDA水平顯著低于動物模型組與維生素C組，P＜0.05。維生素C組的SOD、MDA水平與動物模型組之間也存在明顯差異，P＜0.05。血液及皮膚組織中SOD降低MDA的含量，使體內(nèi)過氧化程度降低，抗氧化能力及清除自由基能力增強，減少黑素細胞的生成及皮膚色素沉著[11-12]。四六湯對紫外線照射所致動物黃褐斑模型具有一定的保護和改善作用，分析其藥效學作用，可能與有效抗氧化有關[13]。另外，黃褐斑的出現(xiàn)與機體內(nèi)性激素水平之間存在十分密切的聯(lián)系。黑色素的產(chǎn)生會受到人體內(nèi)性激素水平的較大影響，對女性而言，在一些特殊的生理階段，包括妊娠期和月經(jīng)期，體內(nèi)的性激素水平會出現(xiàn)明顯的改變，進而影響到黑素的產(chǎn)生。在人體內(nèi)分泌不穩(wěn)定時通常引起情緒不穩(wěn)定，也會間接引起色斑形成。女性黃褐斑的形成與性激素的異常存在一定相關性[14]，患者血清的FSH、E2、P水平會出現(xiàn)顯著上升的情況。本次研究中，空白對照組的P、E2水平顯著低于動物模型組與維生素C組，T水平顯著高于動物模型組與維生素C組。四六湯組的P、E2水平高于空白對照組，T水平低于空白對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。且四六湯組的T水平明顯高于動物模型組與維生素C組，P、E2水平顯著低于動物模型組與維生素C組。維生素C組的P、E2、T水平與動物模型組間也存在明顯差異。即證實，通過治療黃褐斑動物體內(nèi)的性激素水平發(fā)生了異常變化，而四六湯治療可顯著改善其體內(nèi)的性激素水平且效果更為明顯，可以更好地改善紫外線照射所致黃褐斑動物模型[15]。

綜上所述，通過本次研究可以發(fā)現(xiàn)，四六湯對紫外線照射所致動物黃褐斑模型具有一定的保護和改善作用，分析其藥效學作用，可能與有效抗氧化，并改善動物體內(nèi)性激素水平有關。進一步的結(jié)果還有待今后深入研究。

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