唐瓏 王悅芬 趙文景 孫雪艷 崔方強(qiáng) 孟元 趙靜 蔡朕 王暉 申子龍

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)早期的臨床表現(xiàn)以微量白蛋白尿為主，研究證明蛋白尿不僅是腎小球足細(xì)胞功能紊亂的結(jié)果，也是腎損害進(jìn)展的獨立危險因素[1]。如果得不到及時有效的治療，患者很快會出現(xiàn)大量蛋白尿，并伴有腎功能進(jìn)行性下降，最終進(jìn)展至終末期腎衰竭，一定程度上增加了患者的病死率[2-3]。足細(xì)胞及其相關(guān)分子的損傷在糖尿病腎病早期及微量蛋白尿的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用，其中Nephrin、Podocin作為足細(xì)胞裂孔隔膜上的跨膜蛋白，在維持足細(xì)胞形態(tài)及腎小球濾過屏障功能中意義重大。保腎通絡(luò)方是在北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科協(xié)定處方保腎方Ⅱ號(生黃芪、生地黃、女貞子、水蛭等)加用蟲類藥(蟬蛻、地龍、全蝎)組方而成，基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用均驗證其為治療糖尿病腎病有效中藥方劑，本研究旨在通過觀察不同劑量的保腎通絡(luò)方對早期DN大鼠尿液中Nephrin、Podocin排泄的影響，初步探討保腎通絡(luò)方對早期糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞的保護(hù)作用與最佳治療劑量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥物

SPF級健康雄性SD大鼠35只，體重200～240 g，鼠齡6～8周齡，由北京市中醫(yī)研究所動物室提供(合格證書編號：11400500012601)。

保腎通絡(luò)方由生黃芪30 g、黨參15 g、生地黃30 g、女貞子20 g、菟絲子20 g、鬼箭羽15 g、三棱10 g、水蛭5 g、蟬蛻9 g、地龍6 g、全蝎6 g組成，水煎劑，4℃冰箱保存，每3天配置一次。藥材由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供；鹽酸貝那普利片，由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)(規(guī)格：10 mg×14片，國藥準(zhǔn)字:H20030514)。

1.2 實驗試劑與儀器

鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ，美國，Sigma)；檸檬酸、檸檬酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；尿Nephrin Elisa試劑盒、尿Podocin Elisa試劑盒(北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司)等。FreeStyle?血糖儀及試紙(美國，Abbott)；低溫冰箱(美國，Thermo)；MultiSkan3酶標(biāo)儀(美國，Thermo)；全自動生化分析儀(美國，Beckman Coulter)。

1.3 動物模型的建立與分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)抽取7只為空白組，其余為模型組。造模前禁食不禁水4小時，模型組單次左下腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液(以0.1 mol/L檸檬酸緩沖液冰上配置，pH 4.2～4.5)55 mg/kg，空白組注射等量的檸檬酸緩沖液。造模48小時內(nèi)給予5%葡萄糖飲水，72小時后尾尖采血，血糖儀測定隨機(jī)血糖濃度≥16.7 mmol/L且血糖水平維持一周者確定為糖尿病大鼠模型。將糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為五組，每組7只。其中中藥組給予保腎通絡(luò)方(高劑量組20.4 mg·kg-1·d-1、中劑量組10.2 mg·kg-1·d-1、低劑量組5.1 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組及模型組給予等量蒸餾水灌胃。每日1次，連續(xù)給藥8周。

1.4 標(biāo)本采集與檢測

給藥后的第8周末，血糖儀測取大鼠尾尖隨機(jī)血糖(blood glucose，BG)；所有大鼠分別放置代謝籠12小時，收集并記錄尿量，3000 r/min離心10分鐘，全自動生化分析儀測定尿糖(urine glucose，UG)。按Elisa試劑盒說明用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠尿Nephrin濃度、尿Podocin濃度、尿白蛋白濃度(urinary albumin，U-ALB)。全自動生化分析儀測定尿肌酐(urea creatinine，Ucr)；為減少尿量的影響，尿Nephrin、尿Podocin及尿白蛋白濃度均以尿肌酐校正，分別表示為UALB/Ucr(UACR)、UNE/Ucr(UNECR)、UPO/Ucr(UPOCR)；分別比較UNECR、UPOCR與UACR的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實驗期間，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)不同程度的進(jìn)食及飲水量增加，尿量明顯增多，消瘦，毛色澤枯黃，活動遲緩。后期相繼出現(xiàn)白內(nèi)障、口足潰瘍等并發(fā)癥，中藥各劑量組以上情況均有不同程度的改善。

2.2 各組大鼠血糖與尿糖的比較

模型組的血糖與尿糖均高于正常組，證明造模成功；經(jīng)治療后，模型組及中藥各劑量組的血糖與尿糖水平明顯高于正常對照組(P<0.05)；與模型組比較，中藥組血糖與尿糖均有所下降，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血糖及尿糖比較

注： 與正常組比較，aP<0.05。

2.3 各組大鼠尿白蛋白排泄的比較

8周末，模型組及中藥組大鼠UACR明顯高于正常組(P<0.05)；各劑量中藥組UACR均較模型組有所降低(P>0.05)，其中中藥中劑量組分別低于中藥低劑量組與中藥高劑量組(P>0.05)，但中藥各劑量組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.4 各組大鼠尿Nephrin、Podocin排泄的比較

8周末，模型組及中藥組大鼠UNECR及UPOCR明顯高于正常組(P<0.05)；中藥各劑量組UNECR較模型組減少，其中中藥中劑量組、中藥高劑量組較模型組明顯下降(P<0.05)，中藥中劑量組與高劑量組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；中藥各劑量組UPOCR較模型組減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；其中中藥中劑量組UPOCR低于中藥低劑量組與中藥高劑量組，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.5 大鼠UNECR、UPOCR與UACR相關(guān)分析

經(jīng)Pearson相關(guān)分析，UNECR與UACR呈正相關(guān)(r=0.746，P<0.05)；UPOCR與UACR呈正相關(guān)(r=0.517，P<0.05)。見圖1、2。

表2 各組大鼠UACR、UNECR、UPOCR比較

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

圖1 尿Nephrin與尿微量白蛋白的相關(guān)性分析

圖2 尿Podocin與尿微量白蛋白的相關(guān)性分析

3 討論

Nephrin、Podocin是足細(xì)胞裂孔隔膜的主要跨膜蛋白，參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重塑，在維持足細(xì)胞與腎小球濾過屏障完整性上發(fā)揮了重要的作用[4]。足細(xì)胞相互交叉的足突與隔膜裂孔共同覆蓋在腎小球基底膜的表面，維持著較大的濾過面積，是阻止蛋白滲漏入尿的最后一道屏障[5]。足細(xì)胞相關(guān)分子的異常表達(dá)已被證明與糖尿病腎損傷及蛋白尿相關(guān)[6-8]。各種原因引起的Nephrin、Podocin的損傷、移位或表達(dá)減少都會影響足細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白重排和相連蛋白功能，導(dǎo)致足突變寬、融合，裂孔隔膜破壞、疏松甚至消失，最終產(chǎn)生蛋白尿。近年來，大量證據(jù)表明糖尿病腎病患者及動物模型的腎臟組織中Nephrin、Podocin表達(dá)下降，而尿中足細(xì)胞相關(guān)因子的研究也逐漸成為熱點[9]。研究證明足細(xì)胞損傷并脫落進(jìn)入尿液是糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生的一個重要因素[10]。動物實驗發(fā)現(xiàn)尿Nephrin的表達(dá)可以作為腎小球損傷的早期跡象，并且常常先于蛋白尿出現(xiàn)。臨床研究亦證明尿Nephrin水平與尿蛋白呈統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性，糖尿病患者尿Nephrin排泄明顯高于非糖尿病患者，并與足細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[8,11-12]。尿中Podocin會隨DN的進(jìn)展而增加，Podocin與血肌酐呈正相關(guān)，在一定程度上反映了DN進(jìn)展中蛋白尿和腎功能損害的嚴(yán)重程度[13]。Wickman等[14]通過臨床對比發(fā)現(xiàn)通過尿肌酐校正后的尿Podocin(UPOCR)表達(dá)與腎小球的損傷程度密切相關(guān)，UPOCR值會隨著蛋白尿的減少而降低，并且高UPOCR表達(dá)者往往會有較高的尿蛋白/肌酐比值，并在疾病的活動期、急性期表現(xiàn)尤為顯著。這標(biāo)志著尿Nephrin、Podocin等足細(xì)胞相關(guān)分子的檢測可以作為糖尿病腎病的早期生物學(xué)標(biāo)志物。

中醫(yī)古籍關(guān)于糖尿病有較多描述，《素問》首稱其為消渴病，日久兼見“肺癆”“雀盲”“癰疽”“水腫”“關(guān)格”等并發(fā)癥。其中“水腫”“尿濁”“關(guān)格”等與糖尿病腎病的表現(xiàn)尤為相近。筆者結(jié)合臨床治療經(jīng)驗與各家中醫(yī)見解，認(rèn)為糖尿病日久損及腎臟，病機(jī)以氣陰兩虛為本，兼夾水濕、濁毒、瘀血等病邪，發(fā)展至糖尿病腎臟病期，腎絡(luò)瘀阻既為發(fā)病之故，又為病久之果，因此在治療上更加注重滋補(bǔ)腎陰，益氣活血通絡(luò)，并總結(jié)出基礎(chǔ)方劑保腎方Ⅱ號，由生黃芪、生地黃、丹參、女貞子、水蛭等組成，保腎通絡(luò)方是在保腎方Ⅱ號基礎(chǔ)上加用蟲類藥(蟬蛻、地龍、全蝎)組方而成，DN病程較長，纏綿難愈，根據(jù)中醫(yī)理論，久病入絡(luò)，久病必瘀，故DN患者往往存在腎絡(luò)瘀滯?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)從腎臟病理角度已證實了腎絡(luò)瘀滯的存在，如腎小球硬化、間質(zhì)纖維化、腎小球及小動脈內(nèi)微血栓形成等均可認(rèn)為是腎絡(luò)瘀滯的表現(xiàn)，所以很多醫(yī)家已形成共識，活血化瘀應(yīng)貫穿糖尿病腎病治療的始終。而入絡(luò)成瘀，一般草木類藥物不能到達(dá)病所，唯用蟲類藥疏絡(luò)剔邪，才能松動病根，所以從腎絡(luò)瘀滯角度來看，應(yīng)用蟲類藥治療DN符合其中醫(yī)病機(jī)特點?，F(xiàn)代藥理研究也證實蟲類藥多具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗組胺、改善高凝狀態(tài)等作用，能針對上述因素而發(fā)揮作用。保腎通絡(luò)方以生地黃、黃芪為君藥益氣滋陰，聯(lián)合黨參、枸杞子增強(qiáng)養(yǎng)陰益氣之功，三棱、鬼箭羽活血化瘀，配合水蛭、蟬蛻、地龍、全蝎、蟲蟻通絡(luò)，全方攻補(bǔ)兼施，扶正祛邪，經(jīng)臨床及實驗研究證明療效確切[15-16]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，保腎方Ⅱ號可有效降低糖尿病腎病大鼠尿白蛋白排泄率，上調(diào)MMP-2、TIMP-2的表達(dá)，在一定程度上改善腎功能及腎臟病理的進(jìn)展。臨床研究則發(fā)現(xiàn)應(yīng)用保腎方Ⅱ號治療糖尿病腎病患者，可在降低蛋白尿，改善臨床癥狀的同時有穩(wěn)定血糖，減少胰島素用量的優(yōu)勢。臨床觀察同時發(fā)現(xiàn)：蟲類藥具有益腎固本、祛風(fēng)散邪、清熱利濕、活血化瘀的作用，其配合健脾補(bǔ)腎、活血益氣藥物可明顯改善慢性腎炎患者癥狀，減少蛋白尿，安全性好[17]。

本研究通過腹腔注射鏈脲佐菌素復(fù)制糖尿病動物模型，在對比蛋白尿的同時，比較尿Nephrin、Podocin排泄，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠尿微量白蛋白、Nephrin、Podocin的排泄率均明顯增加。對早期糖尿病腎病的及時發(fā)現(xiàn)、糖尿病患者檢測指標(biāo)的完善有進(jìn)一步指導(dǎo)意義。通過不同劑量的保腎通絡(luò)方治療后，大鼠尿Nephrin的排泄率明顯低于模型組，其中中藥中劑量雖然與其他劑量組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但效果呈現(xiàn)較優(yōu)趨勢，不除外低劑量藥效不夠，高劑量組濃度較高加重腎臟負(fù)擔(dān)可能。雖然UACR與UPOCR的水平與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，但是呈現(xiàn)下降趨勢，考慮治療時間較短的緣故，同時也與糖尿病腎病尿Nephrin的排泄先于白蛋白出現(xiàn)這一結(jié)論相符。相關(guān)性分析顯示UACR與UNECR、UPOCR呈正相關(guān)，推測糖尿病尿白蛋白的增加與Nephrin、Podocin蛋白從尿中丟失相關(guān)。雖然控制血糖是治療糖尿病腎病的重要手段，但以上研究提示調(diào)節(jié)Nephrin、Podocin，降低蛋白尿也可作為中藥保護(hù)腎臟的靶點之一，該保護(hù)作用可能與血糖、尿糖的降低無絕對關(guān)系。同時也為尿足細(xì)胞的測定作為糖尿病腎病生物學(xué)標(biāo)志提供了有力的證據(jù)。

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