黃芪甲苷、人參皂苷Rg1對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠Hedgehog信號(hào)通路的調(diào)控影響

趙唯含 史瑞 楊美娟 高康麗 李寧飛 李軍祥

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是臨床常見的消化系統(tǒng)疾病，以胃黏膜上皮和腺體萎縮或伴有腸化生及不典型增生為特征表現(xiàn)[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于本病的治療主要是緩解癥狀，如應(yīng)用促胃動(dòng)力藥、胃黏膜保護(hù)劑及抑酸劑等，而中醫(yī)藥憑借其優(yōu)勢(shì)在治療CAG中扮演著重要角色[2]。黃芪和三七是健脾益氣和活血化瘀藥的代表，黃芪中的主要有效成分是黃芪甲苷，三七中的主要有效成分是人參皂苷Rg1。以往研究發(fā)現(xiàn)黃芪及三七可以通過激活Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵因子改善萎縮性胃炎大鼠胃黏膜的萎縮狀態(tài)。本次實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì)黃芪和三七的有效成分黃芪甲苷及人參皂苷Rg1治療CAG的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠80只，體重(160±20) g，SPF級(jí)，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(京)20090007，飼養(yǎng)于北京市中醫(yī)研究所SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)間，12小時(shí)光照/黑夜循環(huán)，相對(duì)恒溫(25℃)，恒濕(75%)。

1.2 試劑與藥物

黃芪甲苷(Astragaloside IV，AST)分子式：C41H68O14，分子量784，標(biāo)準(zhǔn)品，購自北京市藥品檢驗(yàn)所，編號(hào)：110781；人參皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1，GSS)：標(biāo)準(zhǔn)品，購自北京萬誠科貿(mào)有限公司，純度≥98%(HPLC); Purmorphamine購自上海浩然生物有限公司; 特異性抗體Shh購自美國(guó)CST公司，Gli-1、Ptch、SUFU、CyclinD1和β-actin購自美國(guó)abcam公司；辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗鼠或兔抗羊二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；組織裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自美國(guó)Promega公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit和THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix購自日本Toyobo公司；PV-9001、PV-9003免疫組化檢測(cè)試劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

采用幽門彈簧植入術(shù)配合高鹽熱淀粉糊灌胃法制備萎縮性胃炎大鼠模型[3]。造模結(jié)束后，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將造模動(dòng)物分為模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組、黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷高劑量組、Purmorphamine組及葉酸組，每組10只，另設(shè)10只空白組?？瞻捉M和模型組予去離子水灌胃2 mL/天；黃芪甲苷低劑量予水溶液1.5 mg/(kg·d)灌胃；高劑量予3 mg/(kg·d)，人參皂苷Rg1低劑量予0.5 mg/(kg·d)灌胃， 高劑量予1 mg/(kg·d)；Purmorphamine組予Purmorphamine水溶液1.6 mg/(kg·d)灌胃，共治療8周。

1.4 標(biāo)本的采集

實(shí)驗(yàn)大鼠禁食水16小時(shí)，10%水合氯醛4 mL/100 g體重腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血后，沿胃大彎剪開，除去胃內(nèi)容物，生理鹽水沖洗干凈，展開照相，大體觀察；取幽門與前胃與腺胃交界線連線的2/5部分，放入凍存管內(nèi)，液氮條件下保存，用于Western blot及PCR實(shí)驗(yàn)；胃竇部橫向條狀取材，用10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，切片用于HE染色及免疫熒光。

1.5 Western Blot檢測(cè)胃組織Shh、Ptch、Gli-1的蛋白表達(dá)

組織塊稱重，加入液氮，研磨并粉碎組織，加細(xì)胞裂解液50 μL，在冰上進(jìn)行勻漿離心處理，取蛋白上清液，測(cè)定總蛋白濃度。調(diào)整濃度以后進(jìn)行電泳分離，把蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用5%的脫脂牛奶封閉2小時(shí)。將封閉膜放入一抗中，4℃過夜，洗凈未結(jié)合的一抗，然后放入二抗工作液中，室溫孵育2小時(shí)?；叶戎捣治霾捎肐mageJ軟件。

1.6 RT-PCR檢測(cè)胃組織Shh mRNA、Ptch mRNA、Gli-1 mRNA表達(dá)

把組織放入研缽中，研磨成粉末狀，Trizol試劑法提取樣本的總RNA，經(jīng)ReverTra Ace qPCR RT Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再將此設(shè)為模板，利用特異性引物合成PCR產(chǎn)物。大鼠的引物序列及產(chǎn)物大小見表1。以β-actin基因作為內(nèi)參，將標(biāo)本的待測(cè)指標(biāo)和內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，相對(duì)定量數(shù)據(jù)處理使用2-△△Ct法。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.7 量子點(diǎn)介導(dǎo)的免疫熒光法檢測(cè)胃黏膜組織SUFU、CyclinD1蛋白的表達(dá)

石蠟切片脫蠟、水化、微波抗原修復(fù)、TBS洗滌，封閉緩沖液37℃濕盒孵育60分鐘，分別滴加SUFU、CyclinD1抗體，37℃孵育2小時(shí)，TBS-T漂洗5 分鐘/次×3次，封閉緩沖液37℃濕盒孵育20分鐘，滴加QDs-SA標(biāo)記的二抗，37℃濕盒孵育30分鐘，TBS-T漂洗5分鐘/次×3次，滴加緩沖甘油封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察，每個(gè)組織隨機(jī)采集5張圖片拍照。用image pro plus 6.0 軟件分析圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃黏膜組織肉眼及病理觀察

2.1.1 肉眼觀察 空白組大鼠黏膜紅潤(rùn)；模型組大鼠前胃無明顯變化，腺胃黏膜表面黃染，暴露黏膜顏色發(fā)白。

2.1.2 病理學(xué)評(píng)價(jià) 空白組大鼠黏膜結(jié)構(gòu)正常，腺體整齊緊密；模型組胃黏膜變薄，出現(xiàn)萎縮，固有層腺體減少，排列稀疏，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，個(gè)別可見淋巴濾泡形成；各給藥組較模型組比較黏膜萎縮情況有不同程度的改善，腺體排列較整齊，其中以黃芪甲苷高劑量組和人參皂苷Rg1高劑量組為最佳。見圖1。

2.2 各組大鼠胃組織Shh、Ptch、Gli-1蛋白表達(dá)的比較

與空白組比較，模型組大鼠胃組織Shh、Ptch、Gli-1蛋白含量均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組及葉酸組Shh蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，各給藥組均能顯著升高Ptch蛋白含量(P<0.05)。人參皂苷Rg1高劑量組、Purmorphamine組Gli-1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見表2、圖2。

注：A：空白組；B：模型組；C：黃芪甲苷低劑量組；D：黃芪甲苷高劑量組；E：人參皂苷Rg1低劑量組；F：人參皂苷Rg1高劑量組；G：Purmorphamine組；H：葉酸組

表2 各組大鼠胃組織Shh、Ptch、Gli-1蛋白表達(dá)

注： 與空白組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01。

表3 各組大鼠胃組織Shh、Ptch、Gli-1 mRNA表達(dá)

注： 與空白組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01。

圖2 胃組織Shh、Ptch及Gli-1的Western Blot表達(dá)

2.3 各組大鼠胃組織Shh、Ptch、Gli-1基因表達(dá)的比較

與前述Western Blot檢測(cè)結(jié)果基本一致， 與空白組比較， 模型組大鼠胃組織Shh、 Ptch、 Gli-1的mRNA含量均顯著降低(P<0.05)； 與模型組比較， 人參皂苷Rg1高劑量組對(duì)Shh、 Ptch有改善作用(P<0.05)， 黃芪甲苷低劑量和高劑量組均可顯著改善Gli-1的基因表達(dá)(P<0.05)， Purmorphamine組對(duì)于Shh、 Ptch、 Gli-1均療效顯著(P<0.05)。 見表3。

2.4 各組大鼠SUFU蛋白表達(dá)情況

與空白組相比較，模型組SUFU蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組和Purmorphamine組SUFU蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.05)。見圖3、表4。

2.5 各組大鼠CyclinD1蛋白表達(dá)情況

與空白組相比較，模型組CyclinD1蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組和Purmorphamine組均表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。見圖4、表5。

注：A：空白組；B：模型組；C：黃芪甲苷低劑量組；D：黃芪甲苷高劑量組；E：人參皂苷Rg1低劑量組；F：人參皂苷Rg1高劑量組；G：Purmorphamine組；H：葉酸組

注：A：空白組；B：模型組；C：黃芪甲苷低劑量組；D：黃芪甲苷高劑量組；E：人參皂苷Rg1低劑量組；F：人參皂苷Rg1高劑量組；G：Purmorphamine組；H：葉酸組

表4 量子點(diǎn)標(biāo)記各組大鼠SUFU的表達(dá)情況

注： 與空白組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表5 量子點(diǎn)標(biāo)記各組大鼠CyclinD1的表達(dá)情況

注：與空白組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

3 討論

Hedgehog信號(hào)通路幾乎涉及哺乳動(dòng)物發(fā)育的所有過程，目前關(guān)于其與腫瘤的調(diào)控研究較為透徹[4]。Hedgehog信號(hào)通路主要由三部分組成：Hh信號(hào)肽(Shh、Ihh、Dhh)、跨膜受體(Ptch、Smo)和下游轉(zhuǎn)錄因子(Gli)。Shh參與多種誘導(dǎo)過程，在胚胎胚芽不對(duì)稱性發(fā)育和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程發(fā)揮成形素、分裂素以及分化因子等作用[5]。Shh蛋白釋放后與Ptch結(jié)合，解除了Ptch對(duì)Smo的抑制作用，進(jìn)而將信號(hào)向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)傳遞，激活下游的Gli轉(zhuǎn)錄因子[6]。Gli-1是一種轉(zhuǎn)錄激活劑，Hh信號(hào)通路的激活可以上調(diào)Gli-1的表達(dá)，有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Shh表達(dá)不足時(shí)，Gli-1也會(huì)降低，而Shh被激活時(shí)，Gli-1將會(huì)表達(dá)上調(diào)，因此Gli-1也常被作為檢測(cè)Hedgehog信號(hào)通路是否激活的代表性分子[7]。Sufu是Hedgehog通路中處在Smo和Gli之間的Fused抑制物，Gli基因的活化需要Sufu處于抑制狀態(tài)，而Smo的活化可以抑制Sufu的功能。CyclinD1是細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子，在G1期含量最高且活性最大，通路異?；罨罂梢陨险{(diào)CyclinD1蛋白表達(dá)[8]。Purmorphamine是一種小分子嘌呤衍生物，可以作為Hedgehog信號(hào)通路的特異性激活劑[9]。

黃芪甲苷(又稱黃芪皂苷Ⅳ，Astragaloside Ⅳ)為中藥黃芪主要有效成分之一，現(xiàn)代藥理研究其有鎮(zhèn)靜、降壓、消炎、影響蛋白合成、促進(jìn)NK細(xì)胞活性等作用，是黃芪的重要生理活性成分[10]。三七中皂苷成分是三七的主要有效成分之一，目前已從三七的不同部位分離得到60余種單體皂苷成分，其中人參皂苷Rg1是三七總皂苷中最具代表性的特征化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,人參皂苷Rg1在體內(nèi)可被代謝為Rh1，起到促進(jìn)免疫應(yīng)答的作用，表現(xiàn)為一定的抗腫瘤活性[11]。

本實(shí)驗(yàn)采用幽門彈簧植入術(shù)配合高鹽熱淀粉糊灌胃法構(gòu)建CAG大鼠模型，該模型以胃竇萎縮為主，炎癥浸潤(rùn)明顯，符合一般萎縮性胃炎特征。在前期實(shí)驗(yàn)中，黃芪、三七作為益氣活血法的代表藥物，可以顯著升高Hedgehog信號(hào)通路中正反饋因子，降低負(fù)反饋因子表達(dá)，進(jìn)一步維護(hù)細(xì)胞凋亡與增殖的動(dòng)態(tài)平衡，保護(hù)胃黏膜[12]。黃芪甲苷是中藥黃芪的主要單體成分，人參皂苷Rg1是中藥三七的主要單體成分，且含量最高，因此本次實(shí)驗(yàn)選擇了黃芪甲苷和人參皂苷Rg1探索中藥黃芪、三七的有效成分對(duì)大鼠CAG的作用機(jī)制。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1的高低劑量組對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠的病理情況均有不同程度的改善，抑制萎縮及炎癥發(fā)生。對(duì)CAG大鼠Hedgehog通路相關(guān)因子進(jìn)行檢測(cè)，人參皂苷Rg1低劑量組和高劑量組可升高Shh、Ptch的表達(dá)，其中以高劑量組改變明顯；黃芪甲苷高劑量組顯著改善Gli-1的表達(dá)，及升高CyclinD1的蛋白表達(dá)。

綜上，在慢性萎縮性胃炎發(fā)生發(fā)展過程中，中藥黃芪及三七的主要單體成分黃芪甲苷、人參皂苷Rg1對(duì)Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵因子均有一定的激活作用，由結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1主要作用于Hedgehog通路的上游因子，而黃芪甲苷主要作用的靶點(diǎn)因子處于Hedgehog通路的下游，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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