劉曉燕, 張 瑾, 王媛媛, 蔡順晨, 張 晴, 孫 靜, 徐繼明

(淮陰師范學(xué)院, 化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 淮安 223300)

0 引言

赤蘚醇(Erythritol,1,2,3,4-丁四醇),作為一種代謝產(chǎn)物及貯存化合物,在許多天然產(chǎn)品如地衣,大麻葉、蘑菇、西瓜及葡萄中廣泛存在,很多發(fā)酵食品如醬油、啤酒中也含有豐富的赤蘚醇．赤蘚醇熱量極低(0.3 kcal/g),甜度卻為蔗糖的70%～80%．由于人體缺乏代謝赤蘚醇的酶系,人體攝入的90%的赤蘚醇不能被人體代謝,很快隨尿液直接排出體外而不改變血糖指數(shù),因此赤蘚醇被認(rèn)為是理想的低熱量無糖食品配料．同時動物毒理學(xué)與臨床研究已表明赤蘚醇是安全的甜味劑,且人體對其具有高耐受性．基于以上的屬性,赤蘚醇已被廣泛應(yīng)用于特殊功能食品加工,成為糖尿病人、心血管病人和肥胖病人飲食中理想的甜味劑[1]．此外,赤蘚醇能抑制口腔細菌增長,對齲齒具有明顯的抑制作用,因而在日化領(lǐng)域亦廣受青睞[2-3]．近年來,赤蘚醇在食品與衛(wèi)生保健、化工等領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊,需求量日益增加．

赤蘚醇在自然界中含量極低,目前大規(guī)模生產(chǎn)赤蘚醇的主要方法是微生物發(fā)酵法[4]．赤蘚醇商業(yè)化生產(chǎn)主要依賴于短梗霉屬(Aureobasidiumsp.)以及鏈霉屬(Pseudozymatsukubaensis)以葡萄糖為原料發(fā)酵合成赤蘚醇[5],因而發(fā)酵成本較高．近年來,解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)因其廣泛的底物范圍及高赤蘚醇產(chǎn)量獲得了眾多關(guān)注[6-8]．解脂耶氏酵母大多從食品中分離而來,被FDA(美國食品藥物管理局)認(rèn)定為對人類健康無害的安全發(fā)酵菌株[9],且該菌對低溶氧及重金屬環(huán)境耐受力強,使得粗原料可以作為其發(fā)酵碳源而降低發(fā)酵成本．以上特點使得解脂耶氏酵母在赤蘚醇發(fā)酵領(lǐng)域中具有顯著優(yōu)勢．

甘蔗渣(Bagasse)是制糖加工過程中的副產(chǎn)品,甘蔗榨汁過程中大量可溶性糖含量殘留在甘蔗渣中,因此甘蔗渣是良好的微生物發(fā)酵碳源[10]．甘蔗渣產(chǎn)量巨大,然而目前尚無有效地處理方法．在實驗中,選擇甘蔗渣作為唯一碳源、以解脂耶氏酵母為發(fā)酵菌株進行赤蘚醇發(fā)酵,探索一條甘蔗渣利用新工藝,同時為降低赤蘚醇發(fā)酵成本提供技術(shù)指導(dǎo)．并通過發(fā)酵條件優(yōu)化,構(gòu)建了甘蔗渣生產(chǎn)赤蘚醇的高效發(fā)酵體系．

1 材料和方法

1.1 菌種與原料

實驗所用的菌株為解脂耶氏酵母 SWJ-1b,該菌分離自渤海海洋魚類消化道,純化后接在固體YPD斜面上,置入4℃冰箱中保存．為保證菌株活力,每個月轉(zhuǎn)接一次斜面．

實驗所用原料來自淮安本地水果店鮮榨甘蔗汁后棄置的甘蔗渣,經(jīng)烘干與粉碎后使用．

1.2 培養(yǎng)基

YPD固體培養(yǎng)基(g/L): 葡萄糖20.0,瓊脂20.0,酵母粉10.0,蛋白胨20.0．

YPD液體培養(yǎng)基(g/L): 葡萄糖20.0,酵母粉10.0,蛋白胨20.0．

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2SO42.50,MgSO4·7H2O 1.00,KH2PO41.00,酵母粉 0.75及NaCl 20.0,底物20.0．

以上培養(yǎng)基均以蒸餾水配置,并在配置好后于115℃下滅菌30 min后待用．

1.3 試劑

赤蘚醇測定試劑: 國藥集團化學(xué)試劑有限公司.

高碘酸鈉試劑: 準(zhǔn)確稱取高碘酸鈉溶于0.25 mol/L硫酸,終濃度為0.03 mol/L．

SnCl2試劑: 準(zhǔn)確稱取SnCl2溶于0.3 mol/L鹽酸,終濃度為0.125 mol/L (注:現(xiàn)配現(xiàn)用)．

變色酸試劑: 準(zhǔn)確稱取0.2 g變色酸溶于10 mL水,再加入40 mL濃硫酸．

其他所需試劑: NH4Cl,NH4HCO3,過硫酸銨,尿素及玉米漿．

實驗中所用試劑均為分析純．

1.4 種子液培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)

從YPD斜面培養(yǎng)基上挑取菌體接種于YPD液體培養(yǎng)基中,在搖床內(nèi)于30℃和200 rpm下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h．取1 mL(OD600nm=30)培養(yǎng)好的種子液接種至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,在搖床內(nèi)于30℃和200 rpm下恒溫振蕩120 h．

1.5 發(fā)酵優(yōu)化

在碳源優(yōu)化實驗中,分別添加10.0,20.0,30.0,40.0,50.0和60.0 g/L甘蔗渣進行發(fā)酵培養(yǎng)．在氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中,分別添加(NH4)2SO4,NH4Cl,NH4HCO3,過硫酸銨,尿素及玉米漿作為氮源進行發(fā)酵培養(yǎng)．在氮源濃度優(yōu)化實驗中,分別添加0,1.0,2.0,3.0和4.0g/L的氮源進行發(fā)酵培養(yǎng)．在NaCl優(yōu)化實驗中分別添加0,20.0,40.0,60.0,80.0及100.0 g/L的NaCl于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵．在礦物元素添加優(yōu)化試驗中,分別添加0,2.0,4.0,6.0及8.0 mg/L的Cu2+和0,5.0,10.0,15.0和20.0 mg/L的Mn2+至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)．以優(yōu)化后的條件發(fā)酵并測定發(fā)酵曲線,培養(yǎng)時間為一周共168 h,每24 h取樣測定．

1.6 赤蘚醇產(chǎn)量的測定

發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)離心后,取上層清液稀釋50倍,取0.5 mL于大試管內(nèi),對照加0.5 mL蒸餾水．首先向各試管中加入0.5 mL高碘酸鈉試劑,室溫下放置8～10 min．隨后加入0.5 mL SnCl2,搖勻．接著加2 mL變色酸,用力搖勻后置于沸水浴30 min,待冷卻后轉(zhuǎn)移至比色管中定容至25 mL,于570 nm處測吸光度,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出產(chǎn)量．

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 原料的預(yù)處理

將新鮮的甘蔗渣經(jīng)粉碎、烘干、再粉碎后,于干燥處保存,如圖1所示．甘蔗渣烘干可以降低水活度,防止微生物滋生導(dǎo)致的組分變化．甘蔗渣粉碎后質(zhì)地更加均勻,在發(fā)酵培養(yǎng)基中與微生物細胞更容易接觸,對發(fā)酵更為有利．

2.2 不同碳源發(fā)酵赤蘚醇比較

為了探究甘蔗渣作為發(fā)酵底物的可行性,分別以20.0 g/L的甘油、葡萄糖、豆渣,菠蘿皮,甘蔗渣及玉米芯作為底物進行發(fā)酵培養(yǎng)．發(fā)酵結(jié)束后,測定不用底物培養(yǎng)基中赤蘚醇產(chǎn)量,結(jié)果如圖2所示．結(jié)果表明,不同底物對發(fā)酵過程的菌體生物量和赤蘚醇產(chǎn)量影響明顯．甘蔗渣的赤蘚醇產(chǎn)量(9.7 g/L)雖略低于理想原料甘油(10.9 g/L)及葡萄糖(11.7 g/L),但相對于其他粗原料如蘋果皮(6.9 g/L)及玉米芯(7.6 g/L)有較大優(yōu)勢,在所有粗原料中發(fā)酵效果最好．因此選擇甘蔗渣作為發(fā)酵底物是可行的．

圖1 烘干粉碎后的甘蔗渣

圖2 不同碳源發(fā)酵赤蘚醇比較

2.3 甘蔗渣濃度對解脂耶氏酵母赤蘚醇發(fā)酵的影響

解脂耶氏酵母分別在含有6種不同濃度甘蔗渣(10.0,20.0,30.0,40.0,50.0和60.0 g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),其發(fā)酵結(jié)果如圖3所示．從圖3可以看出,在低底物濃度(10.0 g/L)培養(yǎng)基中,赤蘚醇產(chǎn)量較低,產(chǎn)率也不高．當(dāng)培養(yǎng)基中的甘蔗渣濃度提升至30.0 g/L,赤蘚醇的產(chǎn)量最高,達到13.7 g/L,同時產(chǎn)率也達到最大的45.7 %．但隨著甘蔗渣濃度的進一步增加,赤蘚醇產(chǎn)量與產(chǎn)率均有所下降．

結(jié)果表明甘蔗渣濃度在赤蘚醇發(fā)酵中起關(guān)鍵作用．過低濃度的甘蔗渣使得發(fā)酵產(chǎn)量低,不利于工業(yè)化生產(chǎn)．然而碳源濃度過高同樣不利于赤蘚醇生產(chǎn),推測其中的原因可能是過多的甘蔗渣導(dǎo)致培養(yǎng)基傳質(zhì)及溶氧量下降,從而使發(fā)酵產(chǎn)量下降．這從側(cè)面反映了培養(yǎng)基溶氧量及傳質(zhì)對發(fā)酵的重要影響．值得一提的是,王鳳偉等人在研究耐高滲赤蘚糖醇生產(chǎn)菌的篩選與發(fā)酵條件優(yōu)化時所選用葡萄糖的最佳濃度達到200g/L[11],原因可能是碳源的溶解性不同所導(dǎo)致．可溶性碳源不會影響培養(yǎng)基溶氧,因而較高的添加量也不會導(dǎo)致溶氧量的下降;而不溶性碳源則受到培養(yǎng)基溶氧的限制,培養(yǎng)基對其接納力下降．甘蔗渣作為一種不溶性碳源,其適于發(fā)酵的濃度偏低,故實驗中測定到其最佳發(fā)酵濃度為30.0 g/L．

2.4 NaCl濃度對甘蔗渣發(fā)酵赤蘚醇的影響

滲透壓對細胞生長及代謝影響較大,而對于赤蘚醇生成來說,滲透壓的選擇顯得尤為關(guān)鍵[12]．一般情況下,赤蘚醇是由耐高滲的菌株在較高的滲透壓下生成,作為對抗高滲環(huán)境的一種反應(yīng)．發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源及NaCl是提供滲透壓的主要來源,然而實驗中所用碳源甘蔗渣不能溶于水,因此碳源本身不能提供滲透壓．在此通過添加NaCl提高發(fā)酵培養(yǎng)基滲透壓來調(diào)控赤蘚醇產(chǎn)量．Yang等也認(rèn)為較高的NaCl初始濃度在調(diào)節(jié)滲透壓中比發(fā)酵碳源有更為重要的作用[7]．因此實驗中,把NaCl作為滲透壓調(diào)節(jié)劑,并對其濃度進行優(yōu)化．在赤蘚醇發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的NaCl(濃度范圍為0～100.0 g/L),發(fā)酵結(jié)果如圖4所示．

圖3 甘蔗渣濃度對赤蘚醇發(fā)酵的影響 圖4 NaCl濃度對甘蔗渣發(fā)酵赤蘚醇的影響

在圖4中,最大赤蘚醇產(chǎn)量發(fā)生在NaCl初始濃度為60 g/L時,為15.1 g/L．這表明在解脂耶氏酵母以甘蔗渣為原料發(fā)酵赤蘚醇時,同樣需要較高的滲透壓促進赤蘚醇的生成．然而,過高的滲透壓對赤蘚醇的生成也存在相反的作用,其原因在于過高的滲透壓會抑制細胞生長,從而使得赤蘚醇分泌下降．

2.5 不同氮源對解脂耶氏酵母赤蘚醇發(fā)酵的影響

分別添加相同濃度的(NH4)2SO4,NH4Cl,NH4HCO3,(NH4)2S2O8,尿素及玉米漿于發(fā)酵培養(yǎng)基中作為氮源進行發(fā)酵培養(yǎng),其發(fā)酵結(jié)果如圖5所示．從圖5數(shù)據(jù)中可以看出,當(dāng)?shù)礊橛袡C氮源(尿素和玉米漿時),發(fā)酵體系生物量較高,但赤蘚醇產(chǎn)量較低;當(dāng)?shù)礊?NH4)2S2O8時,發(fā)酵體系生物量較低,但赤蘚醇的產(chǎn)量高于其他幾種氮源,達到15.9 g/L．由此可見,氮源種類對解脂耶氏酵母產(chǎn)赤蘚醇發(fā)酵過程的菌體生長及赤蘚醇合成存在顯著影響,有的氮源能夠引起菌體的過量生長,但往往不利于赤蘚醇的合成．因此在實驗中,(NH4)2S2O8可以認(rèn)定為甘蔗渣發(fā)酵赤蘚醇的最佳氮源．

王鳳偉等在以葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)赤蘚醇時,所選用的最佳氮源為酵母膏與尿素的復(fù)合氮源,他們認(rèn)為有機氮源更有利于赤蘚醇的合成[11]．這與實驗結(jié)果有所不同．實驗選擇的測定氮源中,無機氮源的發(fā)酵效果顯著優(yōu)于有機氮源,推測其原因可能在于,實驗所用的碳源甘蔗渣成分較為復(fù)雜,本身含有部分有機氮源,無機氮源的添加構(gòu)成了無機有機混合氮源,更加有利于赤蘚醇發(fā)酵．

2.6 氮源濃度對解脂耶氏酵母赤蘚醇發(fā)酵的影響

為了確定甘蔗渣發(fā)酵赤蘚醇的最佳氮源,分別向培養(yǎng)基中添加不同濃度(0,1.0,2.0,3.0和4.0g/L)的(NH4)2S2O8進行發(fā)酵培養(yǎng),其結(jié)果如圖6所示．從圖6數(shù)據(jù)可以看出,當(dāng)培養(yǎng)基中(NH4)2S2O8濃度為0時,赤蘚醇產(chǎn)量較低(9.2 g/L)．隨著氮源濃度的逐漸增加,生物量隨之提高,赤蘚醇產(chǎn)量也在逐漸增加．當(dāng)?shù)礉舛葹?.0 g/L時,赤蘚醇產(chǎn)量達到最大,為16.6 g/L,而此時生物量并非最高．當(dāng)?shù)礉舛冗M一步增加時,赤蘚醇產(chǎn)量開始降低．這些結(jié)果表明,氮源的添加是赤蘚醇的合成的必需條件,然而其添加量對赤蘚醇產(chǎn)量有著顯著影響．過高的氮源導(dǎo)致細胞的大量生長,使過多的碳源被細胞呼吸所消耗,轉(zhuǎn)化為赤蘚醇的碳源減少,從而使得赤蘚醇產(chǎn)量下降．因此,在實驗中,解脂耶氏酵母發(fā)酵甘蔗渣產(chǎn)赤蘚醇(NH4)2S2O8的最佳濃度約為3.0 g/L．

圖5 不同氮源對甘蔗渣發(fā)酵赤蘚醇的影響 圖6 氮源濃度對赤蘚醇產(chǎn)量的影響

2.7 添加Cu2+和Mn2+對赤蘚醇發(fā)酵的影響

研究表明,很多礦物質(zhì)例如Cu2+,Fe3+,Mn2+及Zn2+等會通過影響細胞內(nèi)的酶活性來影響赤蘚醇產(chǎn)量．在眾多礦物元素中,Cu2+和Mn2+被認(rèn)為對赤蘚醇合成存在最為顯著的影響[13]．為了研究這兩種金屬離子對甘蔗渣發(fā)酵合成赤蘚醇的影響,在實驗中,通過添加不同濃度的Cu2+和Mn2+,探究發(fā)酵過程中赤蘚醇濃度的變化．分別將0～8 mg/L的Cu2+及0～20 mg/L的Mn2+添加至發(fā)酵培養(yǎng)基,測定不同培養(yǎng)基中赤蘚醇產(chǎn)量變化,結(jié)果如圖7所示．在圖7a中,發(fā)現(xiàn)細胞生長及赤蘚醇產(chǎn)量受Cu2+添加量的顯著影響,隨著Cu2+含量的增加,生物量逐漸降低．而當(dāng)Cu2+含量為4 mg/L,赤蘚醇產(chǎn)量最高(17.9 g/L);Mn2+同樣對細胞生長及赤蘚醇合成存在類似影響．從圖7b中可以看出,隨著Mn2+添加量的提高,生物量下降,而赤蘚醇產(chǎn)量提高．當(dāng)Mn2+為10 mg/L時,赤蘚醇產(chǎn)量達到最高(18.6 g/L)．而當(dāng)Mn2+濃度高于10 mg/L時,赤蘚醇產(chǎn)量迅速下降．

圖7 Cu2+(a)和Mn2+(b)對甘蔗渣發(fā)酵赤蘚醇的影響

在Lee等的報道中[13],在培養(yǎng)基中添加Mn2+和Cu2+Torula sp.發(fā)酵赤蘚醇產(chǎn)量提高,進一步研究發(fā)現(xiàn),赤蘚醇產(chǎn)量提高的原因在于,Cu2+的添加會導(dǎo)致赤蘚醇合成的關(guān)鍵酶赤蘚糖還原酶活力的提高,因為Cu2+會降低赤蘚糖還原酶的抑制劑延胡索酸的生成[14]．Mn2+與Cu2+對赤蘚醇的促進作用則表現(xiàn)在不同的方面．Mn2+能夠改變細胞滲透性,使得生成的赤蘚醇更快地運出細胞,從而減少產(chǎn)物的反饋抑制,促進赤蘚醇生成[15]．然而,過多的Mn2+會破壞胞內(nèi)平衡,使得赤蘚醇產(chǎn)量下降．因此,當(dāng)培養(yǎng)基中添加10 mg/L的Mn2+同時添加4 mg/L的Cu2+,會使得赤蘚醇產(chǎn)量大幅度提高,結(jié)果與Lee等的報道是一致的[13-14]．

2.8 解脂耶氏酵母以甘蔗渣為原料的赤蘚醇發(fā)酵曲線

圖8 甘蔗渣產(chǎn)赤蘚醇的發(fā)酵曲線

為了更好地把握解脂耶氏酵母利用甘蔗渣發(fā)酵赤蘚醇的情況,對該發(fā)酵過程進行了全程跟蹤測試．以條件優(yōu)化后培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng),每隔24 h取樣測定,發(fā)酵結(jié)果如圖8所示．從圖8中可以看出,在發(fā)酵開始的前48個 h內(nèi),發(fā)酵液中的赤蘚醇產(chǎn)量幾乎沒什么變化,可能的原因是前48 h是解脂耶氏酵母接入發(fā)酵培養(yǎng)基的適應(yīng)期．從發(fā)酵72 h起,隨著發(fā)酵天數(shù)的增長,赤蘚醇的產(chǎn)量逐漸增加,并在發(fā)酵144 h達到最大值,進一步發(fā)酵赤蘚醇已無明顯增長．由此可知,在解脂耶氏酵母以甘蔗渣為唯一碳源的發(fā)酵赤蘚醇的周期大約為144 h,赤蘚醇最高產(chǎn)量達到了18.9 g/L．這些結(jié)果表明,以甘蔗渣作為碳源進行赤蘚醇發(fā)酵具有極高的可行性,可將其用于赤蘚醇的工業(yè)生產(chǎn),為赤蘚醇生產(chǎn)提供了一條經(jīng)濟可行的新工藝．

3 結(jié)束語

為了研究解脂耶氏酵母以甘蔗渣為唯一碳源進行發(fā)酵產(chǎn)赤蘚醇的可行性,進行了本次實驗．以甘蔗渣為唯一碳源進行發(fā)酵產(chǎn)赤蘚醇的研究,初步探索了適合甘蔗渣發(fā)酵赤蘚醇的最佳培養(yǎng)基．結(jié)果證明,以甘蔗渣為唯一碳源發(fā)酵產(chǎn)赤蘚醇是可行的,赤蘚醇產(chǎn)率可達到63%．為實現(xiàn)甘蔗渣的再利用,降低赤蘚醇發(fā)酵成本提供了可靠的技術(shù)支撐．

[1] Roper H, Goossens J. Erythritol a new material for food and non-food application[J]. Starch/St?rke,1993, 45: 400-405.

[2] 郭傳琦, 葛兆強, 李兆河, 等. 赤蘚糖醇在日化領(lǐng)域中的應(yīng)用研究[J]. 精細與專用化學(xué)品, 2014(2): 25-28.

[3] 薛雅鶯, 賈慧慧, 楊海軍. 赤蘚糖醇在非食品領(lǐng)域的應(yīng)用與研究現(xiàn)狀[J]. 精細與專用化學(xué)品, 2012(7): 9-11.

[4] Park J B, Seo B C, Kim J R, et al. Production of erythritol in fed-batch cultures of Trichosporon sp[J]. J Ferment Bioeng, 1998, 86: 577-580.

[5] Ishizuka H, Wako H, Kasumi T, et al. Breeding of a mutant of Aureobasidium sp. with high erythritol production[J]. J Ferment Bioeng, 1989, 68: 310-314.

[6] Tomaszewska L, Rywinska A, Rymowicz W. High selectivity of erythritol production from glycerol by Yarrowia lipolytica[J]. Biomass Bioener, 2014, 64: 309-320.

[7] Yang L B, Zhan X B, Zheng Z Y, et al. A novel osmotic pressure control fed-batch fermentation strategy for improvement of erythritol production by Yarrowia lipolytica from glycerol[J]. Bioresource Technol, 2014, 151: 120-127.

[8] Rywinska A, Bak M, Rakicka M, et al. Selection of the UV mutants of Yarrowia lipolytica yeast for erythritol biosynthesis from glycerol[J]. Acta Sci Pol Biotechnol, 2012, 11: 23-28.

[9] Moeller L, Zehnsdorf A, Aurich A, et al. Substrate utilization by recombinant Yarrowia lipolytica growing on sucrose[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93: 1695-1702.

[10] 王允圃,李積華,劉玉環(huán),等.甘蔗渣綜合利用技術(shù)的最新進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2010, 26(16): 370-375.

[11] 王鳳偉. 耐高滲赤蘚糖醇生產(chǎn)菌的篩選與發(fā)酵條件優(yōu)化[D]. 無錫：江南大學(xué)碩士研究生論文, 2012.

[12] Tomaszewska L, Rakicka M, Rymowicz W, et al. A comparative study on glycerol metabolism to erythritol and citric acid in Yarrowia lipolytica yeast cells[J]. FEMS Yeast Res, 2014,14: 966-976.

[13] Lee J K, Ha S J, Kim SY, et al. Increased erythritol production in Torula sp. by Mn2+and Cu2+[J]. Biotechnol Lett, 2000, 22: 983-986.

[14] Lee J K, Koo B S, Kim S Y. Fumarate-Mediated inhibition of erythrose reductase, a key enzyme for erythritol production by Torula coralline[J]. Appl Environ Microb, 2002, 68: 4534-4538.

[15] Mironczuk A M, Dobrowolski A, Rakicka M, et al. Newly isolated mutant of Yarrowia lipolytica MK1 as a proper host for efficient erythritol biosynthesis from glycerol[J]. Process Biochem, 2015,50: 61-68.