1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院影像科(廣東 深圳 518036)

周芬莉1 戚玉龍2 毛立軍1呂金華1 吳 軍1

到目前為止，急性缺血性卒中仍是致死、致殘率高的常見病。時(shí)間窗內(nèi)血管再通治療是唯一特效的治療方法，但即使優(yōu)化溶栓流程后，總體靜脈溶栓或介入取栓率仍然較低，導(dǎo)致很多的患者致殘。除了血管再通治療，卒中后的神經(jīng)功能重建也是重要的治療手段。神經(jīng)功能重建主要有兩種方法，一種是神經(jīng)康復(fù)治療，另外一種是干細(xì)胞移植。利用干細(xì)胞的多向分化潛能，使神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)重建，最終實(shí)現(xiàn)功能重建。但是目前干細(xì)胞移植尚停留在實(shí)驗(yàn)室階段，沒有進(jìn)入臨床的主要原因是，移植進(jìn)入人體的干細(xì)胞的存活時(shí)間、遷移和分化均難以人為控制。本實(shí)驗(yàn)主要觀察移植干細(xì)胞在大鼠體內(nèi)的無創(chuàng)示蹤。核磁共振技術(shù)是臨床常用于卒中患者的檢查方法，具有無創(chuàng)性、可重復(fù),是較理想的監(jiān)測手段，所用的示蹤劑是臨床常用于內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)顯影的菲立磁，是一種超順磁性氧化鐵(Superparamagnetic Iron Oxide，SPIO)粒子，在常規(guī)的1.5T核磁上就能探測到。本研究擬將菲立磁標(biāo)記于移植的干細(xì)胞胞漿內(nèi)，通過核磁對(duì)磁性顆粒的顯像來示蹤移植的干細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重200～250g，購自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)過程符合動(dòng)物倫理學(xué)。主要試劑和材料：菲立磁(Feridex IV,11.2 mg/mL，美國advanced magnetic公司)；培養(yǎng)基DMEM/F12(GIBCO，含L-谷氨酰胺)；硫酸魚精蛋白(上海生化)；IV型膠原酶(Sigma)。儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱(REVCO ELITE II)；倒置顯微鏡(LEICA DMIRB，德國徠卡公司)；數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)(OLYMPUS DP70，日本OLYMPUS公司)；核磁共振(西門子AVANTO 1.5T MR)。

1.2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞采集培養(yǎng)征得產(chǎn)婦同意后取產(chǎn)科足月健康新生兒廢棄的臍帶1cm，無菌條件下浸入PBS中，4℃保存；PBS洗滌后，剔除臍靜脈、動(dòng)脈，無需剔除羊膜。加入少量H-DMEM培養(yǎng)基濕潤后剪碎。加入5倍體積的0.1%IV型膠原酶，放在培養(yǎng)箱消化1小時(shí)。PBS稀釋3倍后，用100目細(xì)胞篩網(wǎng)過篩。離心：1600rpm，10min。細(xì)胞沉渣接種于DMEM/F12全培養(yǎng)基(圖1)。4天后，全量換液。以后每3天換液1次，至細(xì)胞融合傳代。P4代干細(xì)胞備用于磁標(biāo)記(圖2)。

1.3 菲立磁標(biāo)記臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞菲立磁0.05ml加5%GS0.45mL稀釋為濃度1.12mg/mL，取0.5mL稀釋后的菲立磁液體加入5.1mL的全培養(yǎng)基中(濃度0.1mg/mL)，再對(duì)半加入全培養(yǎng)基至菲立磁濃度為0.05mg/mL。硫酸魚精蛋白0.1mL加無菌注射用水0.9mL稀釋為濃度1mg/mL。稀釋后的魚精蛋白0.028mL加入11.2mL的含菲立磁的全培養(yǎng)基中(濃度0.05mg/mL)，手動(dòng)搖勻3分鐘。P4代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞加入含菲立磁的全培養(yǎng)基5mL/瓶。培養(yǎng)箱孵化過夜，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，PBS加10U/mL的肝素再洗滌1次，進(jìn)行普魯士藍(lán)染色顯示藍(lán)色鐵顆粒在胞漿內(nèi)(圖3)。磁標(biāo)記后的干細(xì)胞消化離心后加入生理鹽水重懸為107cell/ml備用。

1.4 MR成像SD大鼠分為兩組：正常對(duì)照組、移植組。移植組大鼠麻醉后經(jīng)枕大池注射0.1ml菲立磁標(biāo)記的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，正常對(duì)照組同樣方法注入等量的生理鹽水。行大鼠頭顱核磁成像時(shí)，大鼠俯臥，用腕關(guān)節(jié)線圈，行橫斷面SE T1，SE T2及SWI序列。參數(shù)：FOV 130，Phase 49.5，層厚：3mm，Average:6。T2：翻轉(zhuǎn)角：150；基礎(chǔ)分辨率：384；分辨：768×266；相位方向：70%；TR 4000，TE 105，T1：翻轉(zhuǎn)角：90；基礎(chǔ)分辨率：256；分辨：512×192；相位方向：75%；TR 400，TE 12。

2 結(jié) 果

濃度為0.05mgFe/mL的的菲立磁－硫酸魚精蛋白復(fù)合物用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記率接近100%，標(biāo)記效果好，細(xì)胞內(nèi)的鐵顆粒含量較高。短時(shí)間繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞活性保持良好。1.5T核磁共振對(duì)大鼠顱腦成像清晰度較高。T2WI成像可以顯示標(biāo)記于干細(xì)胞內(nèi)的菲立磁鐵顆粒。移植早期(第三天)，核磁顯示菲立磁顆粒主要集中在環(huán)池周圍的蛛網(wǎng)膜下腔。移植后2周T2WI對(duì)菲立磁顆粒的顯示信號(hào)明顯變?nèi)?，但磁敏感加?quán)成像SWI仍可檢測到菲立磁信號(hào)，并且顯示這些顆粒已經(jīng)從蛛網(wǎng)膜下腔遷移進(jìn)入了腦實(shí)質(zhì)內(nèi)部，信號(hào)較前分散減弱。

3 討 論

磁共振成像技術(shù)對(duì)磁性物質(zhì)較敏感，特別是磁敏感加權(quán)成像SWI利用磁敏感性差異形成增強(qiáng)對(duì)比[1]，磁性顆粒信號(hào)會(huì)得到放大，通過標(biāo)記磁性物質(zhì)，可以進(jìn)行MR顯影下的細(xì)胞示蹤。根據(jù)磁性標(biāo)記物的不同和標(biāo)記方法的不同，細(xì)胞磁標(biāo)記主要分為細(xì)胞外標(biāo)記和細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記兩種，細(xì)胞外標(biāo)記較容易被吞噬細(xì)胞清除，細(xì)胞內(nèi)磁標(biāo)記的生物相容性較好，保留時(shí)間較長。最常用的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物是菲立磁(Feridex)，是一種超順磁性顆粒，是臨床常用的診斷試劑,臨床上主要用于內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)的顯影，作為診斷試劑的菲立磁濃度遠(yuǎn)大于50μg/mL，對(duì)于人體仍然是安全的。

MR所顯示的信號(hào)對(duì)比強(qiáng)度與磁標(biāo)記干細(xì)胞的標(biāo)記效率有關(guān)。研究認(rèn)為磁標(biāo)記的效率與細(xì)胞的數(shù)量、標(biāo)記濃度和孵育時(shí)間呈正相關(guān)。文獻(xiàn)中SPIO-PLL復(fù)合物標(biāo)記干細(xì)胞的濃度通常是20～50μg/mL。有研究認(rèn)為25μg/mL鐵已經(jīng)達(dá)到了標(biāo)記干細(xì)胞所需要的飽和濃度，在此濃度可有效標(biāo)記細(xì)胞97～100%，超過50μg/mL濃度可使細(xì)胞的變形增殖能力受到不同程度的抑制[2]。有研究認(rèn)為當(dāng)濃度大于22.4μg/mL時(shí)，SPIOs影響干細(xì)胞的存活和分化[3]。也有研究認(rèn)為100μg/mL以下濃度標(biāo)記干細(xì)胞是安全的[4]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)孵育1小時(shí)即可見到菲立磁顆粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，過夜后細(xì)胞的標(biāo)記率幾乎可以達(dá)到100%，但是胞質(zhì)內(nèi)鐵顆粒的含量卻不盡相同，短時(shí)間繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞生長仍然良好。有研究用50μg/mL的濃度標(biāo)記3天，胞質(zhì)內(nèi)鐵含量達(dá)到最高飽和度(24.9±0.6)pg/cell，但隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖分裂，胞內(nèi)鐵含量會(huì)下降[5]。有研究顯示應(yīng)用1.5T的核磁檢測鐵含量(16.4±3.1)pg/cell的細(xì)胞，核磁T1WI、T2WI能檢測到的最小數(shù)量級(jí)細(xì)胞分別為2×104，1×104[6]。SWI檢測磁差異敏感性高于常規(guī)的T1WI、T2WI，因此對(duì)于遷移分散后磁性信號(hào)減弱后的干細(xì)胞示蹤效果可能優(yōu)于常規(guī)的核磁T2加權(quán)相，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

既往國內(nèi)外有一些相關(guān)干細(xì)胞示蹤研究，這些研究使用的主要是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞[7-11]，相對(duì)而言，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞從廢棄的臍帶中提取，含量豐富，更容易獲得，并且分化能力強(qiáng)、免疫原性低，性能穩(wěn)定，成瘤性極低[12]，適宜進(jìn)行異體間干細(xì)胞移植。國內(nèi)外報(bào)道的MR示蹤磁標(biāo)記干細(xì)胞中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植大都是在立體定位儀下，腦實(shí)質(zhì)局部注射進(jìn)行移植[13-14]。但是這種移植方式本身具有創(chuàng)傷性。注射細(xì)胞數(shù)量也受到限制，通常只能注入數(shù)微升細(xì)胞液。枕大池移植無需立體定位儀，較為方便，既保證了干細(xì)胞進(jìn)入顱內(nèi)，又避免穿刺導(dǎo)致的腦實(shí)質(zhì)的直接損傷，并且可注入較大數(shù)量級(jí)別的細(xì)胞，本研究中注入了106數(shù)量級(jí)的干細(xì)胞，是立體定位下腦局部注射量的百倍，在常規(guī)T2WI上可見到早期聚集在環(huán)池的磁標(biāo)記干細(xì)胞的明顯的低信號(hào)改變。有研究比較了經(jīng)枕大池移植和立體定位腦局部注射兩種方法，認(rèn)為經(jīng)枕大池移植的神經(jīng)干細(xì)胞可以進(jìn)入大腦皮層下，并進(jìn)行遠(yuǎn)距離遷移[15]。此外，腦局部注射穿刺過程中產(chǎn)生的微出血在SWI下同樣會(huì)表現(xiàn)低信號(hào)，與磁標(biāo)記干細(xì)胞本身的信號(hào)會(huì)產(chǎn)生混淆，并且干細(xì)胞植入腦內(nèi)后可能死亡裂解釋放出現(xiàn)磁顆粒，這些磁顆粒被吞噬細(xì)胞吞噬后可能隨著吞噬細(xì)胞進(jìn)行遷移，因此核磁下所見到的磁顆粒信號(hào)的遷移并不一定說明干細(xì)胞本身的遷移。本實(shí)驗(yàn)中通過枕大池注射移植干細(xì)胞，不存在腦組織微出血的混淆，蛛網(wǎng)膜下腔的磁性顆粒被吞噬細(xì)胞吞噬后向腦實(shí)質(zhì)內(nèi)遷移的可能性也較小，因此在核磁成像上所顯示的磁性顆粒的遷移與干細(xì)胞的遷移更為吻合。