蔣超文 陳琰 王斌

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種常見的以持續(xù)呼吸系統(tǒng)癥狀和氣流受限為特征的疾病，通常與有毒顆?；驓怏w的顯著暴露引起的氣道和/或肺泡異常有關(guān)[1-2]。2018年最新流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示，我國(guó)COPD疾病負(fù)擔(dān)非常重，總患病人數(shù)已達(dá)9 990萬，約占全球COPD患者的25%，其中，20歲及以上成人COPD患病率為8.6%，40歲以上人群患病率則高達(dá)13.7%[3]。在全球范圍內(nèi)，COPD是第四大死亡原因，預(yù)計(jì)到2020年，COPD將會(huì)超越下呼吸道感染而成為僅次于缺血性心臟病和腦血管疾病的第三大死因，給全球公共衛(wèi)生帶來很大負(fù)擔(dān)[4]。

為了研究COPD的發(fā)病機(jī)制和有效的臨床治療方法，國(guó)內(nèi)外雖然進(jìn)行了很多研究，但是取得的進(jìn)展有限，目前仍未能完全闡明其發(fā)病機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是研究COPD的重要手段和途徑，雖然動(dòng)物疾病模型只能模擬COPD的一部分特征，但是其確實(shí)可以提高我們對(duì)COPD生理、病理生理和治療的基本機(jī)制的認(rèn)識(shí)，建立穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)成功的前提條件。本文就目前各種常用的COPD動(dòng)物模型及其研究和應(yīng)用綜述如下。

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

大鼠、豚鼠、小鼠、小型豬、家兔、猴子以及犬是目前用于建立COPD模型的主要?jiǎng)游?，其中，最常用的是大鼠和豚鼠?/p>

1大鼠： 大鼠生命周期短，繁殖力強(qiáng)，性情較溫馴，飼養(yǎng)繁殖成本較低，而且目前已經(jīng)對(duì)大鼠基因組研究得很清楚。由于大鼠基因組與人類基因組非常相近，比較適合用于建立COPD動(dòng)物模型。但應(yīng)用大鼠建立COPD模型也有其局限性：①大鼠的肺分左右葉，左肺僅一葉，右肺4葉；②大鼠氣管黏膜下的腺體無杯狀細(xì)胞，支氣管的分支少，這些特征與人類不太相符；③有研究表明，大鼠對(duì)煙熏誘導(dǎo)的COPD樣損傷抵抗力較強(qiáng)等[5]。

2. 小鼠： 小鼠作為動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)與大鼠相似。其缺點(diǎn)主要包括：①因支氣管和細(xì)支氣管無杯狀細(xì)胞及缺乏黏液下腺，導(dǎo)致濾過功能較低；②無呼吸性細(xì)支氣管；③建立模型所需時(shí)間比較長(zhǎng)，難以維持且評(píng)價(jià)肺功能困難，且損害程度存在品系差異[6]。

3. 小型豬： 小型豬目前被認(rèn)為是較理想的用于建立COPD模型的動(dòng)物。小型豬的肺分葉明顯，結(jié)構(gòu)與人類很相似，左側(cè)2葉，右側(cè)3葉，而且小型豬也有呼吸性支氣管， COPD模型中氣道阻力增加的最重要原因的就是這些小氣道阻力的升高；小型豬的氣道黏膜下腺體相對(duì)發(fā)達(dá), 更容易感染，因此誘導(dǎo)COPD模型相對(duì)容易成功；此外，小型豬的氣道直徑較大，便于實(shí)驗(yàn)操作[7]。

4. 豚鼠： 豚鼠與大鼠相似。豚鼠的肺不僅在解剖學(xué)及生理學(xué)上與人類較為相似，而且對(duì)過敏原的反應(yīng)也與人類有很多相似之處，因此也常被用于構(gòu)建COPD 模型[8-16]。

5. 猴子： 猴子與人類同屬靈長(zhǎng)類動(dòng)物，其肺組織結(jié)構(gòu)和功能與人類最為接近，其病理生理、發(fā)病機(jī)制也與人類相似，因此，用猴子來復(fù)制COPD模型相比其他動(dòng)物有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。猴子被認(rèn)為是研究人類COPD發(fā)病機(jī)制的最合適做模型的動(dòng)物[17]。其不足之處在于: ①體型偏大，實(shí)驗(yàn)操作較為困難；②購買、飼養(yǎng)、繁殖和藥物使用的成本高；③生命周期長(zhǎng)，繁殖速度慢，繁殖數(shù)量相對(duì)少，導(dǎo)致研究周期長(zhǎng)[18]。

6. 犬： 犬暴露在香煙煙霧之后導(dǎo)致的慢性支氣管炎和肺氣腫的病理和病理生理學(xué)變化與人類較為相似，而其作為COPD動(dòng)物模型的不足之處與猴子相似。目前犬已經(jīng)被廣泛用于建立支氣管哮喘和COPD的動(dòng)物模型[19]。研究證實(shí)，短時(shí)間內(nèi)直接吸入香煙煙霧可使犬產(chǎn)生肺氣腫和肺纖維化[20]。

二、建立COPD動(dòng)物模型的常用方法

目前國(guó)內(nèi)外建立COPD動(dòng)物模型的方法主要是通過將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物暴露于蛋白水解酶、香煙煙霧、炎癥刺激物(如LPS)和基因調(diào)控來誘導(dǎo)產(chǎn)生。

1. 蛋白水解酶誘導(dǎo)的COPD模型： 研究表明，蛋白酶-抗蛋白酶失衡是引起COPD病理類型中肺氣腫的主要原因。在被確診為α1抗胰蛋白酶缺乏癥的患者中，大部分患者同時(shí)患有肺氣腫[21]。這一發(fā)現(xiàn)是肺氣腫胰蛋白酶-抗胰蛋白酶假說的基石。當(dāng)肺內(nèi)蛋白酶負(fù)荷超過抗蛋白酶時(shí)，彈性蛋白酶被降解，最終導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)生[22]。后續(xù)的研究則進(jìn)一步證明，向嚙齒動(dòng)物大鼠氣管注入彈性蛋白酶可誘導(dǎo)其再現(xiàn)肺氣腫的主要病理特征[23]。常用的蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶、豬胰彈性蛋白酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶等。

毛旻等[24]把10只小型豬隨機(jī)分為模型組(n= 6)和對(duì)照組(n=4)，模型組采用氣管內(nèi)注入木瓜蛋白酶的方法復(fù)制肺氣腫模型。實(shí)驗(yàn)方法具體如下：麻醉小型豬后行氣管插管，測(cè)定各組肺功能、血?dú)狻㈦娮佑?jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography, CT)，模型組支氣管鏡下左肺葉內(nèi)注入5 ml(6 U/kg)木瓜蛋白酶，對(duì)照組支氣管內(nèi)注入5 ml生理鹽水，每周1次，于第五周測(cè)定各組肺功能、分析血?dú)?、檢測(cè)并評(píng)估左右肺葉的CT值，最后對(duì)比分析兩組小型豬血?dú)?、肺功能、CT值的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明小型豬支氣管鏡下左肺葉內(nèi)注入木瓜蛋白酶能成功復(fù)制豬肺氣腫模型。

采用蛋白水解酶誘導(dǎo)COPD模型這種方法的主要優(yōu)點(diǎn)是我們可以通過調(diào)整蛋白水解酶的灌注劑量來控制COPD的嚴(yán)重程度，缺點(diǎn)則是彈性蛋白酶在COPD中的作用依賴于多種病理生理機(jī)制，從而增加了臨床事件的數(shù)量[25-27]。

2. 煙霧吸入誘導(dǎo)的COPD模型： 吸煙已被公認(rèn)是COPD的最主要的病因。大鼠、小鼠和豚鼠等都可以用煙霧吸入誘導(dǎo)COPD模型的建立。曹君等[28]把20只C57BL/6J小鼠置于自制熏煙箱進(jìn)行煙熏，每天煙熏4次，每次6支香煙煙熏15 min， 持續(xù)90 d，最后成功建立了肺氣腫模型。該COPD模型穩(wěn)定可靠，其病理學(xué)改變與人類COPD相似。

煙霧吸入法誘導(dǎo)的COPD模型具有COPD的許多疾病特征，包括肺內(nèi)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道纖維化以及肺氣腫，但是不同動(dòng)物種類或者同種動(dòng)物不同品系對(duì)香煙煙霧的敏感程度不一，而目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物暴露方法[29-31]。

3. 內(nèi)毒素誘導(dǎo)的COPD 模型： 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 存在于革蘭陰性菌中，可以誘發(fā)氣道慢性炎癥，通過對(duì)模型動(dòng)物氣道內(nèi)反復(fù)滴注LPS可構(gòu)建COPD動(dòng)物模型。Stolk等[32]通過向金黃地鼠氣管內(nèi)反復(fù)滴入LPS成功建立了LPS誘導(dǎo)的COPD模型，并推斷肺氣腫形成的重要原因是LPS引起的中性粒細(xì)胞聚集及蛋白酶釋放。該研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)滴入LPS 8周后即可觀察到肺氣腫形成。此外，另有多項(xiàng)研究也成功的應(yīng)用LPS誘導(dǎo)了其他鼠類COPD模型[33-35]。

COPD 是一種慢性的病理過程，由氣道炎癥到氣道重塑，逐步導(dǎo)致持續(xù)性通氣功能障礙，而LPS誘導(dǎo)的肺氣腫是在短時(shí)間內(nèi)造成肺及氣管的損傷,所以LPS誘導(dǎo)的肺氣腫只是復(fù)制出COPD的部分特征[7]。

4. 基因調(diào)控的COPD 模型： COPD是一種多基因病，遺傳易感性是其重要的危險(xiǎn)因素。通過對(duì)動(dòng)物某一特定基因進(jìn)行調(diào)控的方法來建立 COPD 模型是近年來興起的一種新方法。Iizuka等[36]采用煙霧吸入法成功在Nrf2-/-小鼠中誘導(dǎo)出COPD模型。Churg等[37]將腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)敲除小鼠(TNF-αR-/-)長(zhǎng)期暴露于煙霧后成功復(fù)制了COPD小鼠模型。

α-1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin, AAT)缺乏是COPD最常見的遺傳因素， 人類只有一個(gè)編碼α-1抗胰蛋白酶的基因，而小鼠有6個(gè)，所以建立AAT缺乏癥相關(guān)COPD小鼠模型非常困難。 Borel等[38]最近成功地運(yùn)用第三代基因編輯技術(shù)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)技術(shù)創(chuàng)建了這種小鼠COPD模型。

基因調(diào)控的COPD動(dòng)物模型為研究者提供了一個(gè)新的方向，將會(huì)有越來越多的研究采用基因調(diào)控的動(dòng)物模型來研究COPD的發(fā)病機(jī)制。

5. 其他方法誘導(dǎo)的COPD模型： 由于COPD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，發(fā)病過程較為復(fù)雜，目前尚無統(tǒng)一的、公認(rèn)的COPD動(dòng)物模型建立方法。為了盡可能真實(shí)地模擬COPD 的發(fā)病過程，許多研究者采用多因素聯(lián)合誘導(dǎo)COPD動(dòng)物模型。比較常用的是LPS經(jīng)氣管內(nèi)注入加香煙煙熏法。宋小蓮等[39]將24只8周齡Wistar大鼠隨機(jī)分成3組，每組8只。其中1組作健康對(duì)照，另2組分別進(jìn)行單純香煙煙熏和香煙煙熏加氣道內(nèi)注入LPS兩種方法建立COPD模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然兩種方法都可以成功建立大鼠COPD模型，但是采用香煙煙熏加氣道內(nèi)注入LPS方法建立的大鼠COPD模型病理生理改變與人類COPD特征更為相似。此外，還有氣道內(nèi)注入LPS和促彈性蛋白酶以及氣管內(nèi)滴入蛋白酶加二氧化硫刺激法等其他建模方法。

三、展望

COPD發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，建立穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型是研究COPD發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)和前提條件。而在COPD動(dòng)物模型構(gòu)建中，單因素誘導(dǎo)的模型有許多方面不太符合人類COPD發(fā)病過程和病理生理改變，所以采用復(fù)合因素誘導(dǎo)的動(dòng)物模型越來越多。隨著COPD動(dòng)物模型的發(fā)展和新的研究方法的建立，研究者在COPD的發(fā)病機(jī)制及其治療方法的研究中一定會(huì)取得更大的進(jìn)展 。