李永偉 劉心偉 王志盛 許曉娜 郭孝蘭 張小倩

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA），俗稱綠膿桿菌，屬革蘭氏陰性桿菌，是非發(fā)酵菌科假單胞菌屬的代表菌種，對各種環(huán)境具有較強的適應性，可存在于陸地、海洋、動物、植物和人體。PA是與一系列院內感染密切相關的機會性致病菌，可導致住院患者罹患肺炎、尿路感染以及皮膚和軟組織感染，是重癥監(jiān)護室、腫瘤科、燒傷科和外科病房常見的病原菌，且多為多重耐藥菌株，導致發(fā)病率和死亡率升高[1，2]。近年來，由PA引起的囊性纖維化（Cystic Fibrosis，CF）患者的肺部感染引起了人們的重視，由于其可長期存在于CF患者的氣道內，導致急性感染遷延為慢性感染，成為臨床治療CF的棘手問題[3]。在針對非發(fā)酵菌革蘭氏陰性桿菌的監(jiān)測結果顯示，PA在臨床上的分離率約占非發(fā)酵菌感染50%以上，居非發(fā)酵菌引起的感染性疾病首位[4]。

由于PA膜孔蛋白通透性較差，加之外膜蛋白表達減低，造成藥物難以到達菌體內部，因此PA對多種抗菌藥物天然耐藥，其造成的感染治療成為臨床難題[5]。PA耐藥機制較為復雜，大致可分為天然耐藥機制和獲得性耐藥機制。野生型PA對氨基青霉素類，氨基青霉素/β-內酰胺酶抑制劑合劑，第一代和第二代頭孢菌素天然耐藥，但對羧基芐青霉素類（替卡西林、羧芐青霉素），脲基青霉素類（哌拉西林、硫苯咪唑青霉素），第三代和第四代頭孢菌素，以及碳青霉烯類和單酰胺類（氨曲南）敏感[6]。獲得性耐藥機制又可分為酶類機制和非酶類機制，前者主要包括青霉素酶、超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）、頭孢菌素酶（AmpC）和碳青霉烯酶（A、B、C、D四類），后者包括外排泵機制，膜孔蛋白缺失機制和青霉素結合蛋白改變機制。

金 屬 β-內 酰 胺 酶（metallo β-lactmases，MBL），又稱金屬酶，是一類活性位點含有金屬離子的β-內酰胺酶。這些酶能夠有效水解除單酰胺類抗菌藥物（氨曲南）以外的幾乎所有β-內酰胺酶抗生素，使得致病菌對青霉素、頭孢菌素和碳青霉烯類耐藥[7]。由于MBL具有保守的金屬離子結合位點，需要Zn2+作為該酶的輔助因子，因此，傳統(tǒng)的β-內酰胺酶抑制劑（克拉維酸等）對MBL無效，但該酶可被EDTA，菲咯啉和巰基化合物抑制。人類于上世紀60年代中期首次在致病性較低的蠟樣芽孢桿菌中發(fā)現兩種結構較為類似的MBL，該酶為鋅離子依賴酶。第三種鋅離子依賴的MBL，即青霉素酶，亦于上世紀80年代早期在嗜麥芽假單胞菌中被發(fā)現。隨后，又分別在嗜水氣單胞菌和脆弱擬桿菌發(fā)現可以水解亞胺培南的MBL。但上述這些酶均由染色體基因編碼，且在臨床上呈散發(fā)分布，因此并未引起人們的重視[8，9]。2010年《柳葉刀·感染性疾病》雜志對“超級細菌”NDM-1型MBL的報道，更是引起了人們對MBL的高度關注。其實早在1991年日本學者Watanabe等[10]已經首次報道了在PA中分離出由可傳播的耐藥質粒介導的可水解亞胺培南的β-內酰胺酶，并被證實為金屬酶，此即IMP-1，且其所在的結合性質粒可以橫向傳播給假單胞菌屬的其他細菌。與以往出現的PA對亞胺培南的耐藥機制不同，這是首次發(fā)現由獲得性金屬β-內酰胺酶引發(fā)的PA對亞胺培南耐藥，由此拉開了針對攜帶MBL的PA進行研究的大幕。隨后又在脆弱擬桿菌中發(fā)現了MBL，兩年后，又在日本岡崎分離出的粘質沙雷菌中發(fā)現該酶，這意味著MBL由單株散發(fā)向隨機分布過渡，各菌株之間的橫向傳播成為可能[11，12]。

根據Almber關于β-內酰胺酶的生物學分類法，MBL屬于B組β-內酰胺酶，屬于A組碳青霉烯酶。而根據B-J-M功能分類法，MBL則屬于3群中的碳青霉烯酶，這也是目前推薦的β-內酰胺酶分類系統(tǒng)，但對MBL未做進一步區(qū)分。隨著金屬酶報道的增多，Bush等將MBL分成三個亞群，即3a、3b和3c，目前所發(fā)現的MBL絕大多數屬于3a亞群，3b和3c亞群僅存在于特定菌屬和菌種。3a亞群MBL的特點是底物譜較寬，水解青霉素的速度與水解亞胺培南的速度相近或更快，還能有效水解頭孢菌素，故也是β-內酰胺酶中最危險的一種?；诎被嵝蛄械南嗨菩?，MBL又被分成三個類B1、B2和B3。B1亞類的酶序列相似度超過23%，這些酶包括來自枯草芽孢菌的Bc-Ⅱ酶，來自脆弱擬桿菌的CcrA酶，金黃桿菌的BlaB酶，短穩(wěn)桿菌的EBR-1酶，從銅綠假單胞菌、黏質沙雷氏菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌中分離得到獲得性的IMP型金屬β-內酰胺酶，以及從銅綠假單胞菌產生的VIM型及SPM型等。由MBL導致的PA對亞胺培南耐藥呈逐年增加趨勢，在巴西因MBL導致的亞胺培南耐藥率達到43.9%，在意大利則達到39.1%，這說明MBL機制已經成為僅次于膜孔蛋白缺失機制的第二位亞胺培南耐藥機制[13]。各種類型MBL的不斷出現，給院內感染的治療帶來新的挑戰(zhàn)，因為產MBL的PA均為多耐藥或泛耐藥菌株，可對β-內酰胺類，青霉素類，頭孢菌素類，氨基糖甙類和喹諾酮類耐藥。與MBL陰性的PA相比，MBL陽性的PA菌株可導致院內感染發(fā)病率升高，同時是引起死亡率升高的重要因素[14，15]。

在基因水平對MBL進行深入研究，使研究者對MBL的多樣性有了更加清晰認識，目前已經發(fā)現的與PA相關的MBL基因型主要有：blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaGIM、blaNDM、blaAIM和blaFIM。本研究將就有關編碼MBL的基因型現狀進行綜述。

1 IMP型PA

blaIMP是第一個見于報道的獲得性MBL編碼基因，也是亞洲地區(qū)最常見基因型，由日本學者Watanabe等從一株1988年分離的銅綠假單胞菌GN17203獲得，即IMP-1型MBL。該酶屬于B1亞類，分子量約為28 000，等電點為9.0，其底物譜較寬，可水解亞胺培南，氧亞氨基類頭孢菌素和7-甲氧基頭孢菌素。酶活性不被β-內酰胺酶抑制劑克拉維酸和舒巴坦所抑制，但可被硫酸銅、氯化汞、乙二胺四乙酸鹽（EDTA-K2）和碘劑抑制。其編碼質粒大小為31-MDa，耐藥性可橫向傳播給其他銅綠假單胞菌，但不傳播給大腸埃希菌[10]。迄今為止，已發(fā)現IMP的亞種多達51種，大部分位于Ⅰ類整合子中，其中在PA中發(fā)現的有33種[16]，分別為：IMP-1，2，4，5，6，7，8，9，10，11，13，14，15，16，18，19，20，21，22，25，26，29，30，31，33，35，37，40，41，43，44，45，48。它們之間氨基酸序列的相似率從90%～99%不等，水解活性相當，均可以移動基因盒的形式插入至Ⅰ類整合子中[17]。在國內最早發(fā)現的是IMP-1，隨后又相繼發(fā)現IMP-4、IMP-6、IMP-9、IMP-25和IMP-45，其中IMP-6與IMP-1相比，存在一個S262G位置的序列突變，且也是首次在日本出現，可認為是前者的變種。不同的是IMP-1對亞胺培南和其他多種抗生素耐藥，而IMP-6對新型的碳青霉烯類抗生素如美羅培南和多利培南耐藥。而在廣州首次分離出的IMP-25與IMP-6相比，存在一個G235S位點突變，與IMP-1存在S262G和G235S兩個位點的突變，可以認為是IMP-1和IMP-6的變種，其進化路徑為IMP-1→IMP-6→IMP-25，對美羅培南的耐藥性呈遞增趨勢，IMP-25對美羅培南的耐藥性強于前兩者，可認為是其適應新型碳青霉烯類抗生素暴露演化而來[17～23]。從地理分布來看，IMP型MBL已由最初在東亞的日本、韓國和中國播散至歐洲的德國、英國、法國和比利時，在美洲和澳洲及東南亞各國，是影響范圍最廣的一種。

2 VIM型PA

blaVIM于1999年首次在意大利北部城市維羅納大學的一所教學醫(yī)院收治的一位意大利住院患者的創(chuàng)面分泌物中分離而來，即VIM-1。這株銅綠假單胞菌對所有β-內酰胺類抗生素耐藥，包括氨芐西林、羧芐西林、哌拉西林、硫苯咪唑青霉素、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟、碳青霉烯類和氨曲南耐藥，較為特別的是其對亞胺培南的最小抑菌濃度（MIC）超過128μg/ml，其活性可被乙二胺四乙酸鹽（EDTA）抑制。VIM-1型MBL屬于B1亞類，具有較為較寬的底物譜，與Bc-Ⅱ同源性較高，保留了和Bc-Ⅱ和CcrA相似的鋅離子活性中心，與IMP-1型，CcrA，BlaB和L1型MBL具有相似的水解活性，可以增強廣譜β-內酰胺酶在微生物宿主中的耐藥性，但氨基酸同質性低于40%[24，25]。隨后又在希臘發(fā)現了VIM-1型的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌[26，27]。目前已報道的VIM亞型多達46種，其中在PA中發(fā)現24種，分別為 VIM-1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，13，14，15，16，17，18，20，28，30，36，36，37，38和最近在美國發(fā)現的VIM-43[16]。分布最為廣泛的亞型是VIM-2，遍布亞、歐、非三大洲，由最初的意大利、希臘等南歐國家播散至日本、韓國、法國、葡萄牙、波蘭、智利、阿根廷和美國，已經導致多次院內感染流行[17]。VIM-2首次鑒定自法國1例由PA引起的、粒細胞減少患者的血流感染，它對除氨曲南以外的絕大多數的β-內酰胺類抗生素耐藥，包括頭孢他啶、頭孢吡肟和亞胺培南[28]。VIM-2包含266個氨基酸，質量29.4kDa，pI=5.6，與Bc-Ⅱ氨基酸一致性達到32%，與 IMP-1，CcrA，BlaB，NDM-1分別為 31%，27%，24%，24%[29]。VIM-2與VIM-1的氨基酸一致性可達90%，其耐藥基因位于僅存在于VIM-2的Ⅰ類整合子上，質粒大小為21800bp，被命名為pNOR-2000，可傳遞給其它PA[30]。VIM型MBL的同源性≥90%，與IMP型之間氨基酸序列的一致性＜40%，但動力學性質相似，耐藥基因大部分位于Ⅰ類整合子上[31]。目前，在中國大陸發(fā)現的有關PA的MBL基因型主要是VIM-2，2001年臺灣學者Yan Jing-Jou等報道了在臨床分離的PA株發(fā)現了新型VIM-2的變種VIM-3，與VIM-2相比，二者僅有2個核苷酸不同，導致2個氨基酸發(fā)生改變，其耐藥基因存在于染色體上，VIM-2及其變種VIM-3已經成為臺灣地區(qū)MBL流行的主要基因型[32]。

3 SPM型PA

SPM-1于2001年首次分離自巴西圣保羅的一名四歲的白血病女孩的血流感染中，菌株編號48-1997A，該PA株對除多粘菌素意外的所有抗生素耐藥，為多重耐藥菌株。SPM-1與以往發(fā)現的IMP和VIM有很大不同，是一個全新的MBL家族，與IMP-1的氨基酸同源性達到35.5%[33]。介導SPM-1的基因組件是一個普通的局部基因組件ISCR4，既不是染色體，也不是質粒，也非轉座子或整合子[34]。有趣的是，從巴西不同地區(qū)分離的PA株，雖然其blaSPM高度一致，但其內部的基因組件卻各不相同。SPM-1較為理想的底物是青霉素類和頭孢菌素類，且結合頭孢菌素類較青霉素類更加牢固。和IMP-1和VIM-1類似，SPM-1不水解克拉維酸和氨曲南，可作為競爭性抑制物[35]。目前SPM-1多重耐藥PA的出現僅局限于巴西國內，除了1位曾在巴西就醫(yī)的瑞典人除外，其他國家尚未發(fā)現SPM-1[36，37]。目前，南美的碳青霉烯類耐藥率位居世界之最，在假單胞菌屬和不動桿菌均屬中存在的SPM-1型MBL是導致南美碳青霉烯類高耐藥水平的重要因素[38]。

4 GIM型PA

2002年在德國杜賽爾多夫大學醫(yī)院的ICU病房共收集到5株對碳青霉烯類耐藥的PA菌株，藥敏試驗顯示，其耐藥模式高度一致，尤其是對亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢吡肟和哌拉西林-他唑巴坦高度耐藥，只對多粘菌素B敏感。MBL初篩試驗證實，這5株PA均產生MBL，但使用blaIMP，blaVIM和blaSPM均未獲得相應的擴增產物，后續(xù)試驗證明新型MBL基因型的誕生，即GIM-1。氨基酸分析顯示，GIM-1與IMP，VIM和SPM型MBL同源性不超過45%，酶動力學試驗顯示，與IMP-1較為接近，且對亞胺培南和美羅培南的水解活性較為接近，這也是與之前所發(fā)現MBL的不同之處。GIM-1也存在Ⅰ類整合子中，In77，所在質粒較小，大小為22kb，屬非結合性質粒，人們一度推定認為，具有特定的宿主，不能通過結合轉移的方式傳遞給其他細菌[39]。2012年又在距離杜賽爾多夫半徑40km的幾個城市發(fā)現5株GIM-1型對碳青霉烯類耐藥的PA，以ATCC27853和NCTC10662作為受體進行的結合轉移試驗未獲得成功，印證了GIM-1只能局限于部分區(qū)域傳播[40]。然而，2013年在陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌、粘質沙雷菌、大腸埃希菌、產酸克雷伯菌和弗氏檸檬酸桿菌陸續(xù)發(fā)現GIM-1，打破了這一觀點，這說明GIM-1可能會以轉座子，整合元件或結合元件的方式橫向傳播給同菌屬或不同菌屬的其他細菌。針對Ⅰ類整合子的分子結構分析顯示，大多數blaGIM-1基因盒具有相同的元件aacA4，aadA1和blaOXA-2，這說明以上元件在橫向傳播的過程中攜帶著大量的遺傳信息[41]。截至目前，尚未在德國以外的國家和地區(qū)發(fā)現GIM-1的蹤跡。

5 NDM型PA

NDM-1首次進入人們的視野在2009年，來自于引起1名在印度新德里有過居留史的瑞典人的尿路感染，對碳青霉烯類耐藥的1株肺炎克雷伯菌[42]。后來《柳葉刀·感染性疾病》又報道在印度、巴基斯坦和英國大量檢出NDM-1陽性的腸桿菌科細菌，很多致病菌幾乎對所有抗生素耐藥，感染者面臨無藥可用的局面。由于NDM-1由質粒介導，其橫向傳播造成的院內感染暴發(fā)流行，引起了人們的擔憂[43]。目前，除NDM-1外，發(fā)現了13個NDM系列亞種，即NDM-2至NDM-14，已分別在銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、洛菲不動桿菌和大腸埃希菌中發(fā)現。NDM-1型PA于2011年在塞爾維亞首次被檢出并報道，同時檢出兩株NDM-1陽性的PA，它們同時對亞胺培南和美羅培南耐藥，MIC均大于32μg/ml，基因測序證實與之前在肺炎克雷伯菌中發(fā)現的blaNDM-1完全一致，屬于B1亞類，這意味著blaNDM-1已經突破腸桿菌科范圍向其他菌屬傳播[44]。次年在法國，從1位之前在塞爾維亞接受過住院治療的患者體內也檢出了NDM-1型PA[45，46]。至此以后，NDM-1型PA在全世界陸續(xù)被發(fā)現，包括意大利、埃及和斯洛伐克，但與在印度發(fā)現的有所不同，其編碼基因位于染色體上[47～50]。2015年在新加坡發(fā)現3株NDM-1陽性的PA，這也是首次在東南亞地區(qū)發(fā)現NDM-1型PA，也意味著由南亞和歐美地區(qū)向東南亞蔓延[51]。在中國，臺灣學者Wu等[52]首先在2010年報道了NDM-1型肺炎克雷伯菌，2013年南昌大學第二附屬醫(yī)院Hu等[53]也報道檢出了NDM-1型肺炎克雷伯菌，同年，北京廣安門醫(yī)院[54]又報道分離出國內第一株NDM-1型大腸埃希菌，這說明NDM-1在國內有散發(fā)傳播趨勢。2014和2015年，大陸學者又分別在肺炎克雷伯菌和洛菲不動桿菌中發(fā)現了NDM的變種NDM-9和NDM-14，但尚未在國內出現任何NDM型PA的報道[55，56]。NDM-1的傳入，以及其新變種在國內的出現，引發(fā)了學者對國內院內感染防治的擔憂，因為質粒介導的NDM系列編碼基因可能會橫向傳播至頑固耐藥的PA。

6 AIM型PA

AIM-1于2012年首次在南澳大利亞城市阿德萊德市分離的3株PA中發(fā)現，它們的耐藥模式高度一致，對亞胺培南的MIC達到512μg/ml，被認為是同一克隆株。MBL表型篩選均為陽性，但未發(fā)現任何之前已報道的MBL基因（包括blaIMP、blaVIM、blaSPM-1、blaGIM-1、blaSIM-1、blaDIM-1和blaNDM-1），出現了一種新型的MBL，命名為AIM-1（Adelaide Imipenemase） 。氨基酸和核苷酸序列分析顯示，AIM-1與THIN型和L1型MBL具有高度同源性，屬于B3亞類，由染色體介導，而非Ⅰ類整合子，這也改變了學術界有關MBL大多數MBL屬于B1亞類的認識。與其他B3類MBL不同的是，AIM-1的耐藥基因是一種可移動的移動基因元件ISCR15，可在SPM-1和NDM-1以及AIM-1三者之間相互傳遞。酶動力學試驗顯示，AIM-1可水解除氨曲南和克拉維酸之外的大多數β-內酰胺類抗菌制劑，除了頭孢他啶外，其動力學參數與L1一致[57]。與其他MBL相比，雖然AIM-1具有很高的Kcat值，具有高效的針對碳青霉烯類的水解活性，但使用大腸埃希菌的結合轉移試驗證明，這種耐藥性并不能傳遞給受體菌，這與之前有關IMP和VIM的報道一致[17]。AIM-1的晶體結構顯示，AIM-1是B3亞類的MBL中第一個被發(fā)現攜帶移動基因元件的MBL；與其他B3亞類相比，AIM-1底物的綁定位點是較窄，也是較為局限的，這也揭示了AIM-1對碳青霉烯類具有高效水解活性的原因[58]。目前，除首例報道外，尚未發(fā)現其他國家和地區(qū)出現有關AIM-1型PA株及其變種的有關報道。

7 FIM型PA

2012年，意大利弗洛倫薩大學醫(yī)院的工作人員從2007年分離的1株多重耐藥PA株中發(fā)現了一種新型的MBL，命名為FIM-1（Florence Imipennemase）。這株PA來自于一名血管移植物引發(fā)的血流感染者，且其一直在意大利居住，沒有旅游史。藥敏結果顯示，該菌株對除粘菌素以外的所有抗菌制劑耐藥，美羅培南-EDTA聯合試驗和碳青霉烯酶試驗證實，屬于產MBL的PA株。PCR擴增試驗，未發(fā)現之前已被報道的任何MBL基因，是一種新型MBL。MLST試驗揭示，FIM-1屬于與MBL傳播密切相關的ST-235基因家族，是高風險多重耐藥基因的典型代表。FIM-1屬于MBL的B1亞類，與已知的MBL中結構最為接近的是NDM-1，氨基酸同源性達到40%，其編碼基因可插入到染色體中，基因元件ISCR19可能參與了該MBL基因的捕獲和移動，但其來源尚屬未知。酶動力學參數顯示，FIM-1具有較寬的水解底物譜，尤其對青霉素類和碳青霉烯類具有特殊的催化能力，但不水解氨曲南[59]。目前，除首例報道外，亦未發(fā)現其他有關FIM-1型PA及其變種的報道。

產金屬β-內酰胺酶銅綠假單胞菌（Metalloβ-lactamase-producing Pseudomonas，MPPA）的 出現和傳播，造成院內感染的發(fā)病率和死亡率升高，已經成為全球性的威脅，這不僅僅是針對免疫缺陷患者而言，也包括社區(qū)健康人群。作為一種重要的病原菌，其耐藥特性與病原性已呈并駕齊驅之勢。雖然目前已經對影響耐藥菌株增殖的有關因子，包括突變導致的自然基因多態(tài)性、水平層面的基因轉移、國際旅行的增多和患者頻繁往返于兩個國家都增加了耐藥菌株傳播的可能，以及免疫缺陷患者接受各種侵入性檢查和治療手段實施所面臨的巨大的抗生素選擇壓力等研究較為深入，但往往具有不可控性。因此，積極致力于有關MPPA的分子流行病學監(jiān)測、耐藥機制、嚴格規(guī)范的抗生素合理使用和快速診斷方法的研究以及新型抗生素的研發(fā)已成為控制MPPA在世界范圍內暴發(fā)流行的當務之急。

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