曹誼林

先天性小耳畸形主要表現(xiàn)為重度耳郭發(fā)育不全，伴外耳道閉鎖或狹窄，是較為常見的新生兒出生缺陷。該病在我國發(fā)病率較高。目前臨床治療手段仍以自體肋軟骨移植耳郭再造或人工支架植入為主。前者供區(qū)損傷大，且難以精確控制形態(tài)；后者為人工材料，形態(tài)可控但無生物學(xué)功能，易發(fā)生異物反應(yīng)及假體外露等并發(fā)癥。因此，如何更有效地修復(fù)耳郭結(jié)構(gòu)，重建其功能仍是整形外科治療的難題。組織工程技術(shù)利用患者廢棄的自體殘耳軟骨細(xì)胞復(fù)合支架材料再生耳郭形態(tài)軟骨，可實(shí)現(xiàn)耳郭結(jié)構(gòu)重建和功能修復(fù)。這一優(yōu)勢(shì)使其成為耳再造的重要研究方向。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，各類軟骨的組織工程修復(fù)技術(shù)已在動(dòng)物體內(nèi)取得較大成功，且組織工程軟骨的臨床應(yīng)用嘗試也獲得了一定進(jìn)展，但要實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，仍有一些關(guān)鍵科學(xué)問題需闡明。

1 種子細(xì)胞

文中已詳細(xì)描述了軟骨組織工程常用的種子細(xì)胞來源及其特點(diǎn)。軟骨細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，且軟骨再生穩(wěn)定性好，因此仍是目前最為重要的種子細(xì)胞來源。但由于其在體外大量擴(kuò)增過程中，容易發(fā)生去分化、功能喪失，這一特性極大限制了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。為解決軟骨細(xì)胞去分化問題，研究者通過改進(jìn)或優(yōu)化體外培養(yǎng)體系，如培養(yǎng)體系中增加有效的生長因子、建立適宜的體外3D培養(yǎng)體系等手段，以延緩軟骨細(xì)胞的去分化速度或使去分化的軟骨細(xì)胞發(fā)生重分化，最終達(dá)到穩(wěn)定或維持軟骨細(xì)胞表型的目的。這些研究成果不僅有望獲得功能完全的軟骨細(xì)胞，同時(shí)還能滿足構(gòu)建大塊軟骨組織對(duì)細(xì)胞數(shù)量的要求，最終有望解決軟骨細(xì)胞臨床應(yīng)用中的質(zhì)量及數(shù)量問題。

除軟骨細(xì)胞外，文中還提到了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stromal cells, ASCs)等成體干細(xì)胞。上述細(xì)胞中，尤其是BMSCs具有取材方便、來源較充足、取材創(chuàng)傷相對(duì)小、成軟骨能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，這使其成為軟骨組織工程較為理想的種子細(xì)胞之一。研究者通過軟骨分化誘導(dǎo)體系、基因重組技術(shù)轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)體系、共培養(yǎng)技術(shù)等手段，能成功地將BMSCs誘導(dǎo)成具有軟骨特性的軟骨樣組織。對(duì)于臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化而言，上述手段中，外源性蛋白和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)顯然不適用。相對(duì)而言，軟骨分化誘導(dǎo)及共培養(yǎng)技術(shù)可能更有臨床應(yīng)用前景。盡管如此，我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs體外誘導(dǎo)獲得的成熟軟骨組織在皮下微環(huán)境中極易發(fā)生血管化、骨化，最終軟骨再生失敗。而將軟骨細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)后植入動(dòng)物皮下，則可獲得成熟穩(wěn)定的軟骨再生效果。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這是由于軟骨細(xì)胞能分泌一些抗血管化細(xì)胞因子(如軟骨調(diào)節(jié)素Ⅰ)，從而穩(wěn)定了BMSCs的體內(nèi)軟骨再生。由此可見，解決血管化、骨化問題是BMSCs皮下軟骨再生穩(wěn)定性的關(guān)鍵。

2 支架材料

文中已詳細(xì)描述了軟骨組織工程常用的支架材料來源。主要有天然生物材料、人工合成材料及復(fù)合材料3種類型。 常用的天然生物材料除文中提到的藻酸鹽、殼聚糖、膠原，還有脫細(xì)胞基質(zhì)材料、透明質(zhì)酸等。這些材料最大的優(yōu)點(diǎn)是無明顯的細(xì)胞毒性，生物相容性好，植入體內(nèi)后無明顯炎癥反應(yīng)或僅引起輕微的炎癥反應(yīng)。因此軟骨細(xì)胞與之復(fù)合植入體內(nèi)后軟骨再生較為穩(wěn)定。然而遺憾的是，這些材料也存在明顯的局限性，如力學(xué)性能較差、難以精確塑形、體內(nèi)降解較快等。因此，這些天然材料在可注射性組織工程軟骨中更具有優(yōu)勢(shì)。近年來，研究者也在努力改進(jìn)、優(yōu)化材料的特性，使其適用范圍更廣。如通過交聯(lián)技術(shù)、光敏技術(shù)、溫敏技術(shù)、凍干技術(shù)等提高膠原材料的可塑性及力學(xué)強(qiáng)度；通過改進(jìn)脫細(xì)胞技術(shù)提高脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料的強(qiáng)度及細(xì)胞黏附率等。材料的優(yōu)化有望為軟骨組織工程技術(shù)提供更理想的支架材料。

人工合成材料常用的有：多孔聚乙烯(Medpor)、聚己內(nèi)酯(poly-caprolactone, PCL)、聚羥基乙酸(poly-glycolic acid, PGA)和聚乳酸(poly-lactic acid，PLA)等。這些合成材料不僅來源廣、易于獲取，更重要的是具有可塑性強(qiáng)，可精確控制形態(tài)；力學(xué)性能好，植入體內(nèi)后形態(tài)能維持良好等優(yōu)勢(shì)。這些優(yōu)勢(shì)使其非常適合作為耳郭形態(tài)軟骨構(gòu)建的支架材料。但同樣的，這些材料也有不足之處，最大的缺點(diǎn)是組織相容性較差，材料本身及其降解產(chǎn)物植入體內(nèi)后，會(huì)激發(fā)機(jī)體的異物炎癥反應(yīng)，從而干擾軟骨體內(nèi)再生。此外，材料缺乏柔韌可屈曲的特性、外露、感染等問題也是限制人工合成材料進(jìn)一步應(yīng)用的關(guān)鍵因素。

為克服上述天然材料和人工合成材料各自的不足，取其長補(bǔ)其短，研究者們嘗試了不同方式(物理或化學(xué)方法)將2種或者2種以上的天然材料和人工合成材料進(jìn)行復(fù)合，從而獲得組織相容性較好、形態(tài)可控、力學(xué)性能合適的復(fù)合材料。如文中提及的絲蛋白-藻酸鹽3D多孔耳郭支架、膠原/PLA, 殼聚糖/PLA和 膠原/殼聚糖/PLA等。這些研究成果為軟骨再生技術(shù)提供了重要參考依據(jù)，但這些支架材料在人體內(nèi)的安全性及有效性仍不明確。因此，要實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化還有很長的路要走。

3 展望

自1997 年筆者在裸鼠背上成功構(gòu)建出人耳郭形態(tài)軟骨以來，軟骨組織工程技術(shù)獲得較大的發(fā)展。最重要的是，組織工程耳郭形態(tài)軟骨的臨床試用研究已獲得了成功。該臨床試驗(yàn)主要以自體殘耳軟骨細(xì)胞復(fù)合PGA/PLA-PCL支架，體外構(gòu)建耳郭形態(tài)軟骨用以重建小耳癥患者耳郭。經(jīng)過2.5年的隨訪，初步證實(shí)了該方法的有效性。盡管如此，要實(shí)現(xiàn)組織工程耳郭的大規(guī)模臨床應(yīng)用，一些關(guān)鍵科學(xué)問題仍需闡明，一些關(guān)鍵參數(shù)仍需進(jìn)一步優(yōu)化及改進(jìn)，如更長期的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸如何？尤其是PCL內(nèi)核完全降解后耳郭的形態(tài)如何？強(qiáng)度如何？后期軟骨有無進(jìn)一步吸收？此外，如何優(yōu)化軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)及擴(kuò)增體系、如何優(yōu)化改進(jìn)目前支架材料的制備工藝、如何優(yōu)化支架性能、如何提高體外構(gòu)建軟骨的質(zhì)量及功能等，這些問題均是后續(xù)研究的重要方向。