張梅 幺寶金 楊永剛 胡耀中 李銀清 王群 趙雨

摘 要 采用同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法對(duì)初生期（15 d）和快速生長期（60 d）東北梅花鹿茸進(jìn)行蛋白表達(dá)譜差異分析，共鑒定出127種差異表達(dá)蛋白。其中，與快速生長期鹿茸相比，初生期鹿茸中顯著性上調(diào)差異表達(dá)蛋白49種，顯著性下調(diào)差異表達(dá)蛋白78種。這些差異表達(dá)蛋白主要為細(xì)胞外基質(zhì)成分及參與調(diào)控神經(jīng)生長和血液循環(huán)進(jìn)程的功能蛋白。初生期鹿茸主要富含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分，且在快速生長期鹿茸中表達(dá)量顯著下調(diào)。同時(shí)，與初生期鹿茸相比，參與調(diào)控神經(jīng)生長和血液循環(huán)的相關(guān)蛋白表達(dá)量在快速生長期鹿茸中顯著上調(diào)。這些差異表達(dá)蛋白共同參與調(diào)控梅花鹿茸的生長速度。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示鹿茸生長機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)研究鹿茸的臨床應(yīng)用具有重要的參考意義。

關(guān)鍵詞 梅花鹿茸； 初生期； 快速生長期； 蛋白質(zhì)表達(dá)譜； 差異分析

1 引 言

鹿茸為鹿科動(dòng)物未骨化密生茸毛的幼角，是哺乳動(dòng)物中唯一可以循環(huán)再生的器官，同時(shí)，也是生長速度最快的器官。每年4～5月，鹿角開始脫落，大約15 d后長出新的鹿茸。鹿茸剛開始生長速度較慢，當(dāng)生長至60 d時(shí)，生長速度最快，平均生長速度可達(dá)20 mm/d。大約90 d后，鹿茸生長速度開始變慢并逐漸骨化，隨后鹿角脫落并開始下一次循環(huán)再生[1，2]。鹿茸的活性成分主要包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖和脂類物質(zhì)等，其中主要成分為蛋白質(zhì)及多肽[3]。

近年來，越來越多的研究者開始關(guān)注鹿茸中具有生物活性的蛋白質(zhì)及多肽類成分。研究表明，鹿茸蛋白及多肽具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等作用[4～6]，對(duì)神經(jīng)、皮膚、軟骨及骨組織損傷具有修復(fù)作用[7～10]。因此，針對(duì)鹿茸生長和發(fā)育過程中的功能蛋白表達(dá)譜進(jìn)行系統(tǒng)和深入研究，有助于進(jìn)一步揭示鹿茸的再生及快速生長機(jī)制。同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)相對(duì)定量和絕對(duì)定量（iTRAQ）技術(shù)是目前應(yīng)用較為廣泛的蛋白質(zhì)定量分析技術(shù)。通過與液相色譜、質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)或絕對(duì)定量，具有簡便、快速和通量高等優(yōu)勢，并廣泛應(yīng)用到蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域中[11]。靳夢亞等[12]利用iTRAQ結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)不同加工工藝鹿茸（鮮品、煮炸、直接凍干等）進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組研究，共鑒定篩選出87種差異表達(dá)蛋白； Dong等[13]采用iTRAQ結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)從鹿茸骨膜干細(xì)胞中鑒定出169種蛋白。然而目前有關(guān)鹿茸在初生期和快速生長期的蛋白組學(xué)比較的相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究針對(duì)梅花鹿鹿茸在初生期和快速生長期這兩個(gè)時(shí)期中的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較，篩選參與調(diào)控生長發(fā)育的差異表達(dá)蛋白，對(duì)揭示鹿茸的再生和快速生長機(jī)制具有重要意義。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

ZNC-D冷凍粉碎機(jī)（北京中科耐馳公司）； 5920R高速低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）； Heto PowerDry LL3000 冷凍干燥機(jī)（美國Thermo公司）； LC-20AB高效液相色譜儀（日本島津公司）； nanoACQUITY 超高效液相色譜儀（美國Waters公司）； TripleTOF 5600質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）。

鹿眠寶和鹿醒寶麻醉復(fù)蘇藥品（青島漢河藥業(yè)有限公司）； PierceTM BCA 蛋白檢測試劑盒（美國Thermo 公司）； iTRAQ Reagent 8 Plex One標(biāo)記試劑盒（美國AB Sciex 公司）； 丙酮、乙腈、甲醇、甲酸等色譜純試劑（美國Thermo 公司）； 二硫蘇糖醇（DTT）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三乙基碳酸氫銨、碘乙酰胺、尿素和胰酶等均為分析純（美國Sigma公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 鹿茸樣品采集 選取4周歲健康的雄性東北梅花鹿（吉林省雙陽市鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn)）6只，隨機(jī)分成兩組，每組3只。分別于脫盤后15 d和60 d時(shí)采集鹿茸頂端生長中心組織（長度約5 cm）。首先，通過注射鹿眠寶3號(hào)（0.02 mg/kg）對(duì)梅花鹿進(jìn)行全身麻醉，切取長度約5 cm的鹿茸頂端組織，去除茸皮，經(jīng)純化水反復(fù)漂洗后，切成1 cm3小塊，液氮保存。通過注射鹿醒寶3號(hào)（0.02 mg/kg）進(jìn)行梅花鹿復(fù)蘇[14]。

2.2.2 蛋白質(zhì)提取制備 鹿茸組織經(jīng)低溫破碎、蛋白裂解（裂解液： 7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、1% SDS、1 mmol/L PMSF、2 mmol/L EDTA、10 mmol/L DTT）和低溫高速離心（15000 r/min）20 min后，收集上清液。加入終濃度為55 mmol/L 碘乙酰胺，避光反應(yīng)45 min。經(jīng)丙酮沉淀（20℃，2 h），15000 r/min低溫離心20 min，沉淀溶于0.5 mol/L三乙基碳酸氫銨，用BCA法測定蛋白濃度[15]。

2.2.3 蛋白酶解、同位素標(biāo)記和分離純化 稱取不同生長時(shí)期鹿茸蛋白提取物100 μg，按底物∶酶質(zhì)量比為20∶1加入胰蛋白酶，37℃酶解4 h； 按相同比例補(bǔ)加胰蛋白酶， 37℃繼續(xù)酶解8 h，冷凍干燥。蛋白酶解物溶于0.5 mol/L三乙基碳酸氫銨，取出iTRAQ Reagent 8 Plex One Assay Kit 中的113和116同位素標(biāo)記標(biāo)簽（每個(gè)標(biāo)記標(biāo)簽含有1個(gè)活力單位（Unit），可標(biāo)記100 μg蛋白樣品），恢復(fù)到室溫。加入70 μL異丙醇混勻活化，將活化后的113和116標(biāo)記標(biāo)簽分別加入到初生期（脫盤后30 d）和快速生長期（脫盤后60 d）鹿茸蛋白樣本中，室溫孵育2 h。將標(biāo)記后的各組肽段混合均勻，用LC-20AB液相系統(tǒng)進(jìn)行肽段液相分離[16]。色譜柱： Ultremex SCX強(qiáng)陽離子交換層析柱（250 mm × 4.6 mm， 美國Phenomenex公司）。洗脫液： 緩沖液 A（25%乙腈，25 mmol/L KH2PO4， pH 2.7）和緩沖液 B（25%乙腈，25 mmol/L KH2PO4，1 mol/L KCl， pH 2.7）。洗脫條件： 混合肽段用4 mL Buffer A溶解，進(jìn)樣后以1 mL/min的速率進(jìn)行梯度洗脫： 0～10 min， 100% 緩沖液 A； 10～21 min， 5%～35% 緩沖液 B； 21～22 min， 35%～80% 緩沖液 B； 檢測波長： 214 nm。根據(jù)洗脫曲線收集組分后，經(jīng)Strata X柱除鹽，冷凍干燥。

2.2.4 質(zhì)譜鑒定 肽段樣品溶于2%乙腈-0.1%甲酸溶液中。采用超高效液相色譜（nanoACQUITY）-質(zhì)譜（TripleTOF 5600）聯(lián)用進(jìn)行肽段鑒定[17]。色譜柱： Symmetry C18柱（20 mm×180 μm， 5 μm， 美國Waters公司）和BEH130 C18柱（100 mm ×100 μm， 1.7 μm， 美國Waters公司）。流動(dòng)相A（水-乙腈-甲酸 = 98∶2∶0.1，V/V）和B（水-乙腈-甲酸=2∶98∶0.1， V/V）。洗脫條件： 首先以流動(dòng)相A進(jìn)行肽段樣品吸附，流速2 μL/min，洗脫時(shí)間15 min； 然后用5% 流動(dòng)相B以300 nL/min的流速洗脫1 min，最后進(jìn)行梯度洗脫： 0～40 min，5%～35%B； 40～45 min，35%～80% B； 45～50 min，80% B。質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置： 離子源為Nanospray IIIsource（美國AB SCIEX公司），放射器為石英材料拉制的噴針（美國New Objectives公司）。數(shù)據(jù)采集時(shí)參數(shù)設(shè)置如下： 離子源噴霧電壓2.5 kV，氮?dú)鈮毫?0 psi（14.5 psi≈1 bar），噴霧氣壓15 psi，噴霧接口處溫度150℃； 掃描模式為反射模式，分辨率 ≥30000； 一級(jí)單張圖譜掃描時(shí)間為250 ms，每次采集30個(gè)電荷為2+～5+，并且單秒計(jì)數(shù)大于120的二級(jí)圖譜，3.3 s為一個(gè)循環(huán)； 第二個(gè)四極桿（Q2）的傳輸窗口設(shè)置為100 Da處效率為100%； 脈沖射頻為11 kHz； 檢測器的檢測頻率為40 GHz； 每次掃描的粒子信號(hào)以4個(gè)通道分別記錄共4次后合并轉(zhuǎn)化成數(shù)據(jù)； 離子碎裂的能量設(shè)置為（35±5） eV； 母離子動(dòng)態(tài)排除設(shè)置為： 在一半的出峰時(shí)間內(nèi)（約18 s），相同母離子的碎裂不超過2次。

2.2.5 生物信息學(xué)分析 液相色譜-質(zhì)譜分離鑒定后的數(shù)據(jù)通過ProteinPilot 5.0軟件（美國AB Sciex公司）進(jìn)行分析。由于梅花鹿為非模式生物，因此，將數(shù)據(jù)與NCBI nr和Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，優(yōu)先選擇與梅花鹿或與梅花鹿同源性較高的物種（馬鹿（Cervus elaphus）、牛（Bos taurus）、羊（Ovis aries）等）進(jìn)行比對(duì)。同時(shí)，選擇與兩個(gè)數(shù)據(jù)庫均成功比對(duì)的蛋白進(jìn)行相對(duì)定量分析和差異蛋白篩選。差異蛋白篩選原則為： 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)豐度差異倍數(shù)（Fold change）≥1.5或 ≤0.67，且p值（p value）≤0.05[18]。差異表達(dá)蛋白功能富集分析采用AmiGO網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用程序（http：//amigo.geneontology.org/rte）進(jìn)行 [19]。

3 結(jié)果與討論

3.1 初生期和快速生長期鹿茸總蛋白制備及差異表達(dá)蛋白鑒定

采集初生期期和快速生長期的鹿茸頂端生長組織，經(jīng)破碎、裂解、離心等步驟提取出鹿茸總蛋白，經(jīng)BCA法測定初生期鹿茸總蛋白和快速生長期鹿茸總蛋白的濃度，分別為5.415和5.689 μg/μL，體積均為240 μL。通過iTRAQ技術(shù)、液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)初生期和快速生長期鹿茸中表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，采用ProteinPilot 5.0軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，共得到236225個(gè)二級(jí)譜圖（Total spectra）。其中，匹配到特有肽段的譜圖（Unique Spectra）數(shù)量為13494個(gè)，鑒定到特有肽段序列（Unique Peptide）數(shù)量為5933個(gè)，鑒定到的蛋白（Protein）數(shù)量為2261個(gè)。肽段序列長度分布結(jié)果具體見圖1，在匹配到的肽段中，絕大多數(shù)的肽段包含10～20個(gè)氨基酸殘基。

通過差異表達(dá)分析，共鑒定出差異表達(dá)蛋白127種。 初生期與快速生長期鹿茸相比，顯著性上調(diào)差異表達(dá)蛋白49種，顯著性下調(diào)差異表達(dá)蛋白78種（p<0.05， Fold change ≥1.5或 ≤0.67）。

3.2 初生期和快速生長期鹿茸差異表達(dá)蛋白功能富集分析

根據(jù)iTRAQ鑒定分析結(jié)果，首先針對(duì)初生期和快速生長期鹿茸的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析（Gene ontology enrichment analysis）（p≤0.01），結(jié)果見圖2。通過生物進(jìn)程（Biological process）功能富集分析，這些差異表達(dá)蛋白主要?dú)w類為參與調(diào)節(jié)代謝進(jìn)程（Metabolic process）、生物調(diào)節(jié)（Biological process）、應(yīng)激反應(yīng)（Response to stimulus）、發(fā)育進(jìn)程（Developmental process）等生物進(jìn)程的功能蛋白。通過細(xì)胞組分（Cellular component）功能富集分析，這些差異表達(dá)蛋白主要?dú)w類為細(xì)胞器組分（Organelle）、大分子復(fù)合物（Macromolecular complex）、膜成分（Membrane）和細(xì)胞外成分（Extracellular region）等功能蛋白； 通過分子功能（Molecular function）富集分析，這些差異表達(dá)蛋白主要?dú)w類為結(jié)合活性（Binding）、催化活性（Catalytic）、結(jié)構(gòu)分子活性（Structural molecular activity）和分子功能調(diào)節(jié)（Molecular function regulator）等功能分類。以上結(jié)果表明，初生期和快速生長期鹿茸中的差異表達(dá)蛋白主要為細(xì)胞器和細(xì)胞外大分子復(fù)合物，并通過結(jié)合、催化等方式參與調(diào)節(jié)鹿茸頂端生長中心細(xì)胞代謝、應(yīng)激和發(fā)育等生物進(jìn)程。

3.3 初生期鹿茸顯著性上調(diào)差異表達(dá)蛋白分析

針對(duì)初生期顯著性上調(diào)差異表達(dá)蛋白（p <0.05， Fold change ≥1.5）進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)蛋白主要為細(xì)胞外基質(zhì)類成分，如軟骨低聚基質(zhì)蛋白（Cartilage oligomeric matrix protein）、核心蛋白聚糖（Decorin）、層粘連蛋白亞基α-4（Laminin subunit alpha-4）、聚集蛋白核心蛋白（Aggrecan core protein）和二聚糖（Biglycan）等，結(jié)果見表1。軟骨低聚基質(zhì)蛋白是軟骨形成和發(fā)育過程中重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，基因突變和失活常導(dǎo)致假性軟骨發(fā)育不全（PSACH）和多發(fā)性骨骺發(fā)育不良（MED）等骨骼系統(tǒng)疾病[20]。核心蛋白聚糖、聚集蛋白核心蛋白和二聚糖是軟骨組織中重要的基質(zhì)成分，主要存在于新生和年輕態(tài)軟骨組織中[21]。層粘連蛋白亞基α-4是軟骨組織損傷修復(fù)過程中重要的基質(zhì)成分[22]。這些結(jié)果表明鹿茸在初生期合成和分泌特殊的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，參與調(diào)控初生期鹿茸的形成和生長發(fā)育，而這些蛋白在進(jìn)入快速生長期后表達(dá)量顯著下調(diào)。

3.4 初生期鹿茸顯著性下調(diào)蛋白分析

針對(duì)初生期顯著性下調(diào)（快速生長期顯著上調(diào)）的差異表達(dá)蛋白（p <0.05， Fold change ≤0.67）進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)蛋白主要包括神經(jīng)母細(xì)胞分化相關(guān)蛋白AHNAK（Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK）、血紅蛋白（Hemoglobin subunit alpha， beta）、鐵蛋白（Ferritin heavy， light chain）、 蛋白S100-A2和A10（Protein S100-A2， A10）和結(jié)合珠蛋白（Haptoglobin）等，如表2

所示，這些蛋白主要參與調(diào)控神經(jīng)生長和血液循環(huán)等生物過程。神經(jīng)母細(xì)胞分化相關(guān)蛋白AHNAK通過調(diào)節(jié)雪旺細(xì)胞的形態(tài)、遷移以及髓鞘形成進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)生長和再生的調(diào)控[23]。血紅蛋白是哺乳動(dòng)物血液循環(huán)系統(tǒng)中的主要氧運(yùn)載蛋白，但由于其高反應(yīng)性血紅素基團(tuán)的存在，也使其成為一種潛在的組織損傷性物質(zhì)。尤其是在出現(xiàn)溶血情況時(shí)，血紅蛋白被釋放到血漿中，作為急性期反應(yīng)蛋白的結(jié)合珠蛋白可以與血紅蛋白形成幾乎不可逆的非共價(jià)蛋白質(zhì)復(fù)合物，進(jìn)而抑制游離血紅蛋白對(duì)組織和器官的氧化毒性[24， 25]。鐵蛋白是體內(nèi)貯存鐵的主要場所，血清鐵蛋白濃度是評(píng)價(jià)機(jī)體是否缺鐵或鐵負(fù)荷過多的有效指標(biāo)。細(xì)胞生長和發(fā)育離不開鐵的調(diào)節(jié)，研究表明，在青春期快速生長過程中，需要補(bǔ)充鐵蛋白和血紅蛋白， 以避免貧血癥的發(fā)生[26]。蛋白S100-A2和A10作為S100蛋白的家族成員，在軟骨組織中表達(dá)量較高，主要功能是抑制軟骨細(xì)胞的肥大分化[27]。這些結(jié)果表明鹿茸在快速生長期的血液循環(huán)及生長能力旺盛，進(jìn)而確保鹿茸的快速生長進(jìn)程。

3.5 代表性蛋白特征肽段二級(jí)譜圖分析

圖3為軟骨低聚基質(zhì)蛋白（Cartilage oligomeric matrix protein）某一特征肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖。b離子是CONH之間CN鍵斷裂左側(cè)的離子，而y對(duì)應(yīng)是該鍵斷裂后右側(cè)的離子。以CN鍵計(jì)數(shù)，從左至右，b離子編號(hào)； 從右至左，y離子編號(hào)。鑒定到序列為VTSILDWVR，其中y1-10和b1、b3、b4、b6、b9和b10共16個(gè)氨基酸碎片離子被鑒定到，利用MASCOT軟件分析Peptide score為82.18。

4 結(jié) 論

采用iTRAQ技術(shù)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)東北梅花鹿初生期和快速生長期鹿茸頂端生長組織進(jìn)行蛋白質(zhì)定性和定量分析，鑒定出多種不同生長時(shí)期鹿茸頂端組織差異表達(dá)蛋白，闡明鹿茸在初生期和快速生長期發(fā)生顯著性變化的蛋白成分主要為細(xì)胞外基質(zhì)類成分以及參與調(diào)控鹿茸神經(jīng)生長和血液循環(huán)的功能因子。在初生期鹿茸中，多種細(xì)胞外基質(zhì)類蛋白成分如軟骨低聚基質(zhì)蛋白、 核心蛋白聚糖、層粘連蛋白亞基、聚集蛋白核心蛋白和二聚糖等表達(dá)量顯著上調(diào)。當(dāng)鹿茸進(jìn)入快速生長期時(shí)，這些細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)。同時(shí)，參與調(diào)控神經(jīng)生長及血液循環(huán)過程的相關(guān)蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，這些功能蛋白和相關(guān)信號(hào)通路共同確保鹿茸的生長發(fā)育。本研究為全面揭示鹿茸生長機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)于研究鹿茸的臨床應(yīng)用具有重要的參考意義。

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