馬 寧 楊 曉 彭 薇 李 昊 王 艷

中國人民解放軍陸軍總醫(yī)院附屬八一兒童醫(yī)院發(fā)育生物學實驗室，出生缺陷防控關鍵技術國家工程實驗室，兒童器官功能衰竭北京市重點實驗室（北京，100700）

遺傳性耳聾基因芯片在新生兒耳聾基因篩查中的應用

馬 寧 楊 曉 彭 薇 李 昊 王 艷

中國人民解放軍陸軍總醫(yī)院附屬八一兒童醫(yī)院發(fā)育生物學實驗室，出生缺陷防控關鍵技術國家工程實驗室，兒童器官功能衰竭北京市重點實驗室（北京，100700）

目的：探索應用遺傳性耳聾基因芯片對新生兒進行常見耳聾基因的篩查，為輔助臨床診斷提供遺傳咨詢。方法：采集2085例新生兒足跟血，制成干血斑，提取血斑中淋巴細胞基因組DNA，用9項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒檢測中國人常見的4個耳聾基因的9個突變位點。結果：共檢出73例突變，總突變率3．5%。其中GJB2突變28例，線粒體突變5例，SLC26A4突變34例，GJB3突變5例，三雜合突變1例（235delC雜合突變299delAT雜合突變IVS7－2A＞G雜合突變）。結論：正常人群也會攜帶常見的遺傳性耳聾突變基因，在新生兒期，檢測出耳聾基因突變對遺傳性耳聾的早期發(fā)現(xiàn)、預防及治療有很大幫助。

新生兒；遺傳性耳聾；基因芯片；GJB2基因；12SrRNA基因；SLC26A4基因；GJB3基因

導致聽力損失的因素包括環(huán)境因素和遺傳因素，另外還包含一些不明原因，其中遺傳因素占60%［1］。聽力障礙會直接影響患兒的語言發(fā)育，從而導致由聾致啞，給患兒的生長發(fā)育及社會生活帶來非常嚴重的影響。而常規(guī)聽力學篩查無法發(fā)現(xiàn)遲發(fā)型、藥物敏感性和漸進性耳聾患者。因此，為了早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預，本院對2085例新生兒進行了9項耳聾基因篩查，本文對此進行總結分析。

1 對象與方法

1．1 篩查對象

新生兒家長簽署知情同意書后，采集2085例新生兒的足跟血干血斑，共3個血斑。經干血斑基因組DNA提取試劑盒提取DNA后，－20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 試 劑 盒

9項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒［微陣列芯片法，國食藥監(jiān)械（準）字2013第3401518號，北京博奧晶典生物技術有限公司提供］可檢測4個基因9個突變位點，包括 GJB2（35delG、176del16、235delC和299delAT）、GJB3（C538T）、SLC26A4（IVS7－2A＞G、A2168G）以及線粒體12SrRNA（A1555G、C1494T）。

1．3 設 備

晶芯LuxScanTM10K－A微陣列芯片掃描儀、洗干儀、雜交儀及配套分析軟件（北京博奧晶典生物技術有限公司）。

1．4 方 法

PCR反應：4個基因9個突變位點分成A和B兩個反應體系進行多重PCR擴增，在A和B擴增體系中加入5μl待測人基因組DNA （濃度2～20ng／μl）、擴增引物混合物和擴增試劑混合物各10μl。PCR 擴增程序：37℃10min，95℃ 15min，96℃1min，94℃ 30s，55℃ 30s，70℃45s，32個循環(huán)，60℃10min，55℃30s處設置降溫速率0．4℃／s，在70℃45s處設置升溫速率0．2℃／s。擴增結束進行雜交、清洗和掃描，最終根據(jù)產品配套分析軟件得到結果。

2 結果

2085例新生兒中共檢出73例基因突變，突變率3．5%。其中68例為單雜合突變型（為耳聾基因突變攜帶者），1例為1555A＞G異質突變，4例為1555A＞G均質突變型，1例為雙雜合突變型。見表1。

表1 73例新生兒基因突變位點

3 討論

遺傳性耳聾基因診斷芯片可同時檢測先天性耳聾、藥物敏感性耳聾和遲發(fā)性耳聾相關4個基因中的9個突變位點，具有通量高，操作簡便，自動化的特點。用于新生兒篩查，可以彌補常規(guī)聽力學篩查的不足，可篩查出新生兒常規(guī)聽力學篩查無法篩出的遲發(fā)型耳聾、藥物敏感性耳聾或者漸進性耳聾的新生兒，為新生兒的用藥治療和生長發(fā)育評估都提供了可靠依據(jù)。

SLC26A4基因與大前庭導水管綜合征相關，它同時也是耳聾常見突變基因，其發(fā)生純合突變一般會導致遲發(fā)型耳聾，而常規(guī)聽力篩查無法檢出，所以需要借助基因檢測聯(lián)合篩查。SLC26A4基因某一位點純合突變或兩個位點復合雜合突變，提示為先天性耳聾或后天遲發(fā)性耳聾的患者，建議結合影像學檢查結果進一步判斷，指導患者日常行為及注意事項，此種先天性耳聾具有良好的人工耳蝸植入治療效果。在2085例新生兒中檢出34例SLC26A4基因突變型，且都為雜合突變型，攜帶率為1．63%。

GJB2基因突變是最常見耳聾基因，它的遺傳方式為常染色體隱性遺傳。前庭水管綜合征是近30年發(fā)現(xiàn)的一種能夠根據(jù)影像學分類的感音神經性耳［2－3］，隨著顳骨 CT 和 MRI在中國的逐漸普及［4］，此病的發(fā)現(xiàn)日趨頻繁。此綜合征的特點多為雙側感音神經性耳聾，CT或MRI提示前庭水管或內淋巴囊擴大，一部分患者出生時可能聽力正常，聽力下降程度在不同的個體具有較大的差別，從聽力完全正常至中重度聽力損失，因墮床、兒童玩?；蝮w育活動中的輕度碰撞或感冒可以造成明顯的聽力下降［5］，也存在無明顯誘因而發(fā)生聽力下降的情況。在2085例新生兒中檢出28例為GJB2。均為雜合突變型，攜帶率1．34%和1．65%。

GJB2基因和SLC26A4基因都是以隱性遺傳方式遺傳，本次篩查出的63份樣本均為雜合突變型，未檢出以上兩個基因的純合突變型。但檢出1例為235、299和IVS7－2雙雜合突變，并且聽力學篩查未通過，可以確定為先天性耳聾患者。需要及早進行人工耳蝸移植以避免由聾致啞。通過篩查，可以對患兒的聽力進行長期監(jiān)測，觀察聽力變化，及早發(fā)現(xiàn)異常。

12SrRNA基因突變的攜帶者，耳毒性藥物可能導致其發(fā)生藥物敏感性耳聾，需要禁用耳聾性藥物，同時要提醒攜帶者，其母系親屬也應該禁用耳聾性藥物，從而避免或減少藥物性耳聾的發(fā)生。本次檢出4例1555A＞G均質突變型和1例1555異質突變型，可明確這5例新生兒是耳毒性藥物的敏感個體，應告訴監(jiān)護人需要進行用藥指導，新生兒以及其母系親屬應該終生禁用氨基糖甙類抗生素，從而可避免發(fā)生耳聾。藥物性耳聾基因篩查，可“篩一益十”，對其所有母系親屬都有預防作用。

GJB3突變攜帶者為基因攜帶有遺傳性耳聾突發(fā)病基因，如果發(fā)生高頻聽力損失，建議及時到醫(yī)院就診。本次檢出5例為GJB3耳聾基因的攜帶者，GJB3基因突變主要表現(xiàn)為語后進行性高頻感音性耳聾，這些患兒有發(fā)生遲發(fā)型聽力損失的可能［6］，以上是基因篩查結果還需要結合臨床表現(xiàn)診斷，如果臨床表現(xiàn)為耳聾，可能還有其他致聾基因或者外來因素導致耳聾，需要進行進一步的聽力學篩查，盡早明確病因，采取適當治療手段，避免由聾致?。蝗绻ㄟ^常規(guī)聽力學篩查，在婚育時可進行遺傳咨詢。

本文結果提示，在正常人群中也會攜帶常見的遺傳性耳聾突變基因。因此，進行新生兒耳聾基因篩查，對遺傳性也聾的早期發(fā)現(xiàn)，預防及治療具有積極作用。

［1］ 韓德民，新生兒聽力及耳聾基因聯(lián)合篩查［J］．中國醫(yī)學文摘耳鼻喉科學，2012，27（6）；290－292．

［2］ Valvassori GE，Clemis JD．The large vestibular aqueductsyndrome［J］．Laryngoscope．1978，88：723－728．

［3］ Emmett JR．The large vestibular aqudect syndrome［J］．Am J Otology，1985，6：387－415．

［4］ 楊偉炎，張素珍，趙承君，等．95例大前庭水管綜合征的臨床分析［J］．中華耳鼻咽喉科雜志，2003，38：191－194．

［5］ 汪吉寶．大前庭水管綜合征［J］．中華耳鼻咽喉科雜志，2002，37：400．

［6］ 馬靜，林墾，毛志勇，等．中國云南地區(qū)非綜合征型感音神經性耳聾GJB2和GJB3基因突變分析［J］．中國耳鼻喉顱底外科雜志，2015，21（2）：99－103．

The application of genetic deafness gene chip in screening of neonatal deafness gene

Ma Ning，YANG Xiao，PENG Wei，LI Hao，WANG Yan
DevelopmentalBiologyLaboratory，BaiyiChildren’sHospitalAffiliatedtoPLAArmyBeijingGeneralHospital，Beijing，100700

Objective：To screen common deneness gene of newborn by genetic deafness gene chip，to use the result of genetic screening to assist clinical diagnosis，and to provide genetic counseling．Methods：The heel blood of newborns were collected and made for dried blood spots，and then lymphocyte DNA was extracted from the dried blood spots．Nine mutations of four common deafness genes of Chinese were tested by Nine Deafness Gene Mutations Detection Kit，which included GJB2（35delG／176del16／235delC／299delAT），GJB3（C538T），SLC26A4（IVS7－2A＞G／A2168G）and mitochondrion 12SrRNA（A1555G／1494T）．Results：Mutations were found in 73cases，and the rate of mutation was 3．5%．Among the 73cases，28cases were mutations of GJB2gene，5cases were mutations of 12SrRNA gene，34 cases were mutations of SLC26A4gene，and 5cases were mutations of GJB3gene，1case had three heterozygous mutation （235delC heterozygous，299delAT heterozygous and IVS7－2A＞G heterozygous）．Conclusion：Normal persons maybe carry genetic deafness because of gene mutation，so deafness gene detection of newborns will help to find deafness mutation early，and it is also help for preventing and treating deafness．

Newborn；Hereditary hearing loss；Gene chip；GJB2gene；12srRNA gene；SLC26A4gene；GJB3gene

10．3969／j．issn．1004－8189．2017．09．011

2017－05－24

2017－06－09

張 璐］