邢紅宇，朱明月，李 偉，林 波

1.海南省中醫(yī)院檢驗科，海南 ?？?570203；

2.海南醫(yī)學(xué)院海南省腫瘤發(fā)生和干預(yù)重點實驗室，海南 ?？?570203

隨著我國人口老齡化速度加快及環(huán)境污染日益嚴(yán)重，我國癌癥發(fā)病率居高不下，其中男性前列腺癌發(fā)病率逐年增加。目前，對前列腺癌的診斷和評價其預(yù)后指標(biāo)，主要是根據(jù)臨床特征、病理結(jié)果，以及檢測血前列腺特異抗原(prostatespecific antigen，PSA)動態(tài)變化等，但臨床研究表明，臨床上只借助這類指標(biāo)不能全面概括前列腺癌的發(fā)病狀況。表觀遺傳的主要修飾方式之一是DNA甲基化，通過甲基化可調(diào)控基因表達(dá)水平、保持基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在多種癌癥細(xì)胞中異常表達(dá)，并且在不同組織上DNA甲基化存在不同表達(dá)模式［1］。谷胱甘S-轉(zhuǎn)移酶P1(glutathione S-transferase P1，GSTP1)可代謝多種致癌化合物，起到解毒的作用，保護(hù)細(xì)胞避免DNA損傷和抑制癌基因激活。GSTP1最初是在人胎盤組織中被發(fā)現(xiàn)的，在腎、肺及前列腺等多數(shù)組織中表達(dá)。有研究表明，在前列腺癌組織中，GSTP1基因被抑制，這可能為及時診斷和治療前列腺癌提供了新的方向［2］。GSTP1基因可能成為診斷前列腺癌新的可靠標(biāo)志物之一 。目前，關(guān)于前列腺癌組織中GSTPl基因甲基化與前列腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系尚不明確。本研究通過回顧性分析前列腺癌患者臨床病理特征與GSTPl基因甲基化的關(guān)系，為深入研究GSTPl基因甲基化在前列腺癌中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣本

收集2015年4月—2016年12月在海南省中醫(yī)院和?？谑腥嗣襻t(yī)院腫瘤及泌尿外科進(jìn)行住院治療的患者的前列腺癌石蠟包埋組織及對應(yīng)的前列腺癌旁石蠟包埋組織46例，所有組織均經(jīng)顯微切割所得，癌旁組織是指距病灶2 cm的組織。患者年齡50～90歲，平均76歲，所有患者均經(jīng)過病理穿刺活檢確診。根據(jù)美國臨床腫瘤協(xié)會推薦的前列腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行Jewett臨床分期：B期12例，C期18例，D期16例。所有分期患者均行尿道前列腺電切術(shù)后病理診斷證實。

1.2 儀器與試劑

DNA、RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，亞硫酸氫鈉修飾試劑盒購自英國Intergen公司，酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司，ABI7300PCR擴(kuò)增儀購自美國ABI公司，微型電泳儀購自天根生化科技(北京)有限公司，低溫離心機購自德國Eppendorf公司。

1.3 DNA與RNA的提取

選取石蠟包埋組織8～10片，按照DNA、RNA提取試劑盒說明書中的步驟提取前列腺癌組織與癌旁組織DNA、RNA，提取后的DNA、RNA放于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因組DNA修飾

經(jīng)酶標(biāo)儀檢測DNA在260和280 nm處的吸光度(D)比值，若比值在1.7～2.0區(qū)間內(nèi)則提示DNA合格；取600 ng DNA，按照甲基化修飾試劑盒說明書中的步驟對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，放于-20 ℃冰箱中備用。

1.5 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylationspecific polymerase chain reaction，MSP)

根據(jù)甲基化位點，參照文獻(xiàn)設(shè)計引物［3］，GSTP1基因非甲基化引物序列：順義鏈引物為5’-GATGTTTGGGGTGTAGTGG TTGTT-3’；反義鏈引物為5’-C C A C C C CAATACTAAATCACAACA-3’；GSTP1基因甲基化引物序列：順義鏈引物為5’-TTCGGG GTGTAGCGGTCGTC-3’，反義鏈引物為5’-GCCCCAATACTAAATCACGACG-3’，所有引物均由美國L i f e公司合成，甲基化、非甲基化上下游引物各50 pmo1/L，DNA模板100 ng，超純水加至50 μL，混勻4 000×g離心5 min后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 min；94 ℃ 45 s，59 ℃1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃延伸5 min，共40個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物10 μL加入凝膠槽中，配制1%的瓊脂糖凝膠，1×上樣緩沖與Gel red混勻后，1×TAE電泳緩沖液，在120 V電壓下電泳30 min后，在紫外燈照射下拍片記錄。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)檢測GSTP1 mRNA表達(dá)

每個樣品做3個重復(fù)對照，反應(yīng)分2步進(jìn)行：第1步，95 ℃ 10 min；第2步，95 ℃ 5 s和60 ℃ 35 s，共40個循環(huán)，在60 ℃ 1 min時收集熒光信號，內(nèi)參基因(GAPDH)在相同條件下進(jìn)行擴(kuò)增，最后使用2-△△Ct方法來分析基因GSTP1 mRNA的表達(dá)。GSTPl基因引物序列為5’-CTATGGGAAGGACCAGCAGG-3’和5’-TGGTCTCCCACAATG-3’，GAPDH基因引物序列為5’-CCTAAGCCATTGTCAAAGCGA-3’和5’-CAAAGTTGTCATGGA-3’。RTFQ-PCR反應(yīng)體系見表1。

表 1 RTFQ-PCR反應(yīng)體系Tab. 1 RTFQ-PCR reaction system

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

對所有數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用χ2檢驗兩組差異，用Spearman方法分析相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GSTP1基因甲基化表達(dá)與一般臨床特征的關(guān)系

結(jié)合患者的臨床病理資料，GSTP1基因啟動子區(qū)甲基化與患者的年齡、PSA水平無關(guān)，與臨床分期有關(guān)(表2)。

2.2 前列腺癌組織、癌旁組織GSTP1基因啟動子甲基化比較

結(jié)果顯示，前列腺癌組織GSTP1基因啟動子甲基化率顯著高于其對應(yīng)的癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表3)。

表 2 GSTP1基因甲基化與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab. 2 The relationship between gene methylation and clinicopathological parameters of GSTP1

表 3 前列腺癌組織、癌旁組織GSTP1基因啟動子甲基化水平Tab. 3 The promoter methylation level of GSTP1 gene in prostate cancer tissues and para-cancerous tissues

2.3 GSTP1基因甲基化水平

用MSP法對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示出現(xiàn)清晰條帶(圖1)，電泳結(jié)果顯示，4號標(biāo)本癌旁組織只出現(xiàn)非甲基化條帶，表明沒有發(fā)生甲基化。2號前列腺癌組織標(biāo)本只出現(xiàn)甲基化條帶，為完全甲基化。其余則為部分甲基化。

2.4 GSTP1基因mRNA表達(dá)及與GSTP1基因啟動子甲基化相關(guān)性

通過RTFQ-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，癌組織GSTP1 mRNA表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P＜0.01，圖2)。將GSTP1 mRNA表達(dá)水平與GSTP1基因啟動子甲基化用Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲基化與mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=0.724，P=0.026)。

圖 1 GSTP1基因MSP電泳結(jié)果Fig. 1 GSTP1 gene MSP electrophoresis results

圖 2 GSTP1 mRNA表達(dá)水平Fig. 2 GSTP1 mRNA expression levels

3 討 論

我國前列腺癌的患病率逐年上升，但目前臨床上面臨的問題是對前列腺癌的診斷準(zhǔn)確率相對較低，因而導(dǎo)致諸多患者失去最佳治療時機，生存率得不到提高。目前，臨床上常綜合運用PSA動態(tài)監(jiān)測、監(jiān)測白細(xì)胞黏附抑制、直腸指診及影像學(xué)診斷再結(jié)合病理活檢等多種方法進(jìn)行綜合診斷，但這些手段都存在一定程度的誤檢和漏檢率，因而不能完全適應(yīng)臨床診斷和及時治療等迫切需求。發(fā)現(xiàn)新的前列腺癌特異性生物標(biāo)志物，預(yù)防和提高前列腺癌愈后的難點是建立前列腺癌有效預(yù)警、早期診斷及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測的方法。

GSTP1屬于代謝酶家族，參與代謝、解毒等多種重要功能，可清除入侵機體的有毒物質(zhì)，發(fā)揮防止損傷細(xì)胞DNA和抑制癌變的作用［4］。GSTP1基因定位于染色體11q13，GSTP1基因發(fā)生甲基化，導(dǎo)致它的正常代謝、解毒功能受損甚至消失，無法起到消除致癌物質(zhì)的作用，從而使腫瘤發(fā)生可能性增加。有研究證實，在其他實體腫瘤中GSTP1表達(dá)升高；但在前列腺癌組織中表達(dá)則不同，GSTP1特異性的表達(dá)被抑制甚至缺失［5-6］。關(guān)于GSTP1在不同腫瘤組織中的表達(dá)差異，其原因暫不清楚，有待繼續(xù)深入研究。M?ller等［7］研究顯示，GSTP1基因甲基化有助于增加診斷前列腺癌的特異度和靈敏度。本研究也顯示，GSTP1 mRNA水平在前列腺癌組織中顯著降低，提示GSTP1發(fā)生甲基化后，其mRNA水平被抑制，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Ellinger等［8］推斷，導(dǎo)致前列腺癌組織中GSTP1基因表達(dá)抑制或沉默可能是由于GSTP1基因啟動子區(qū)CpG島超甲基化，且被認(rèn)為是檢測前列腺癌癌變的生物標(biāo)志物，在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。有研究顯示，在前列腺癌組織中過表達(dá)GSTP1，可顯著抑制癌細(xì)胞的活力及增加死亡率，可能是通過抑制MEK/ERK1/2通路實現(xiàn)的。綜合現(xiàn)有研究表明，GSTP1基因發(fā)生甲基化常預(yù)示著前列腺癌患者的預(yù)后較差［9-11］。在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中，GSTP1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平逐漸升高，通過MSP檢測GSTP1基因甲基化水平具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，因此，前列腺癌中GSTP1基因的異常甲基化沉默將來可能成為該病治療的重要靶標(biāo)之一［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，GSTP1基因甲基化與臨床分期有關(guān)，而與其他臨床特征無關(guān)，提示在前列腺癌的不斷發(fā)展中GSTP1基因甲基化的水平是呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，有助于判斷前列腺癌的發(fā)展?fàn)顩r。本研究發(fā)現(xiàn)，73.9%的前列腺癌組織中有GSTP1基因甲基化，甲基化率顯著高于癌旁組織。張彥等［2］研究50例前列腺癌石蠟組織中GSTP1基因甲基化表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有樣本GSTP1基因均未發(fā)生甲基化。出現(xiàn)這種結(jié)果可能與不同研究所選擇的樣本、實驗方法差異及不同地域等諸多因素有關(guān)。因而，在后續(xù)研究中還要進(jìn)行臨床多中心的樣本篩選，規(guī)范統(tǒng)一實驗方法，將有助于確認(rèn)GSTP1基因在前列腺癌中的診斷價值。

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