咪唑類(lèi)離子液體-β-環(huán)糊精聚合物固相萃取-紫外分光光度法測(cè)定藥品和食品中蘆丁

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(南通市疾病預(yù)防控制中心, 南通 226000)

蘆丁是類(lèi)黃酮化合物的一種,分布于槐米、蕎麥、蕓香草中,是天然的抗氧化劑。蘆丁能降低毛細(xì)血管通透性和脆性,促進(jìn)細(xì)胞增生和防止血細(xì)胞凝聚,具有抗炎、抗過(guò)敏、利尿、解痙、鎮(zhèn)咳、降血脂等方面的作用[1]。臨床上蘆丁主要用于高血壓病的輔助治療,預(yù)防和治療糖尿病及合并高血脂癥。醫(yī)藥工業(yè)中用蘆丁作原料生產(chǎn)蘆丁片、維腦路通(曲克蘆丁)、蘆丁鎂鉻鹽等心血管藥物[2]。由于蘆丁的這些治療和預(yù)防作用,人們常用富含蘆丁的藥食兩用植物作保健品,如常見(jiàn)的苦蕎。

因蘆丁在醫(yī)藥及食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,研究實(shí)際樣品中蘆丁的測(cè)定方法具有重要的意義。目前蘆丁的測(cè)定方法有毛細(xì)管電泳法[3]、高效液相色譜法[4]、電化學(xué)方法[5]、紫外分光光度法[6]等。其中紫外分光光度法具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定、分析成本低、易于普及等優(yōu)點(diǎn)。但由于實(shí)際樣品中存在基體干擾,紫外分光光度法常與分離富集技術(shù)聯(lián)用,以提高方法的選擇性和靈敏度。

固相萃取(SPE)因具有重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn),在分離富集技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越多[7]。常見(jiàn)的固相萃取材料包括沸石、螯合樹(shù)脂、活性炭、環(huán)糊精聚合物等。環(huán)糊精聚合物(CDCP)因自身的物理化學(xué)特性(結(jié)合位點(diǎn)多,價(jià)格低廉等),作為固相萃取材料廣泛應(yīng)用于分離、分析樣品中的金屬元素、有機(jī)化合物[8]。近年來(lái)功能化環(huán)糊精逐漸成為超分子領(lǐng)域新熱點(diǎn),以環(huán)糊精分子作為骨架進(jìn)行選擇性修飾,構(gòu)建新型超分子,既保持了環(huán)糊精自身的疏水性空腔,又體現(xiàn)了修飾基團(tuán)的特性,性能往往優(yōu)于母體環(huán)糊精。

本工作合成了咪唑類(lèi)離子液體([C6min][PF6]),應(yīng)用浸漬法制得咪唑類(lèi)離子液體-β-環(huán)糊精聚合物(IL-β-CDCP),建立IL-β-CDCP固相萃取-紫外分光光度法測(cè)定蘆丁的方法。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

SHA-BA型數(shù)顯恒溫振蕩器;TU-1905型紫外分光光度計(jì);Tensor 27型紅外光譜儀。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.000 g·L-1,稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99.0%) 100.0 mg于100 mL容量瓶中,用乙醇溶解并稀釋至刻度,于4 ℃冰箱中保存。

所用試劑均為分析純,試驗(yàn)用水為純水。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 IL-β-CDCP聚合物制備

[9]方法合成并進(jìn)行表征。

1．2．2 樣品制備

將20粒復(fù)方蘆丁片研磨至粉末狀,稱(chēng)取試樣1.000 0 g至50 mL錐形瓶中,加入乙醇15 mL超聲提取1 h,離心并氮吹至近干,用pH 4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液定容至100 mL。

稱(chēng)取粉碎均勻的苦蕎掛面試樣2.000 0 g至50 mL錐形瓶中,加入乙醇15 mL超聲提取1 h,離心并氮吹至近干,用pH 4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液定容至100 mL。

1．2．3 蘆丁吸附-洗脫步驟

稱(chēng)取IL-β-CDCP 0.1 g于離心管中,加入一定量的1.0 mg·L-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,用pH 4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(調(diào)節(jié)pH至4.0)定容至40 mL,于15.0 ℃水浴振蕩10.0 min,離心分離,取上層清液,用紫外分光光度法測(cè)定(測(cè)定波長(zhǎng)為342 nm),得到蘆丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為w0。吸附了蘆丁的IL-β-CDCP(下層)中加入乙醇4.0 mL,于35.0 ℃水浴振蕩10.0 min,洗脫液用紫外分光光度法測(cè)定(測(cè)定波長(zhǎng)為360 nm),得到蘆丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為w,吸附率、脫附率分別按公式(1)、公式(2)計(jì)算:

E=(m0-m1)/m0×100(1)

E0=m2/(m0-m1)×100(2)

式中:E為吸附率,%;E0為脫附率,%;m0為溶液中加入蘆丁的質(zhì)量,g;m1為IL-β-CDCP吸附后上層清液中蘆丁的質(zhì)量,g;m2為洗脫后洗脫液中蘆丁的質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與討論

2．1 吸附條件的選擇

試驗(yàn)考察了酸度、溫度、溶液體積等吸附條件對(duì)IL-β-CDCP吸附蘆丁吸附率的影響,并與β-CDCP吸附蘆丁的吸附率進(jìn)行了比較。

2．1．1 酸度

不同pH(pH為2.0～12.0)對(duì)IL-β-CDCP吸附蘆丁有顯著的影響。兩種聚合物對(duì)蘆丁的吸附效果都是隨pH增大而遞減,且IL-β-CDCP對(duì)蘆丁的吸附率明顯高于相同pH下β-CDCP對(duì)蘆丁的吸附率。當(dāng)溶液pH為2.0～6.0時(shí),IL-β-CDCP的吸附率為90%以上;pH為4.0時(shí),IL-β-CDCP的吸附率為92.0%。由于蘆丁的解離常數(shù)(pKa)為4.3,在pH小于4.3時(shí),蘆丁主要以分子形式存在,其分子形式的疏水性大于離子形式的疏水性,更易于被IL-β-CDCP吸附[10]。試驗(yàn)選擇在pH 4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的環(huán)境下進(jìn)行測(cè)定。

2．1．2 樣品溶液體積

樣品溶液體積與洗脫液的比例越大,該方法對(duì)蘆丁的富集效果越好。固定蘆丁的質(zhì)量為10.0 μg,考察了樣品溶液體積為5～65 mL時(shí)對(duì)蘆丁吸附率的影響。結(jié)果表明:樣品溶液體積為5～40 mL時(shí),吸附率為92.0%。試驗(yàn)選擇樣品溶液體積40 mL。

2．1．3 吸附溫度和吸附時(shí)間

試驗(yàn)考察了吸附溫度為5.0～50.0℃時(shí)IL-β-CDCP對(duì)蘆丁的吸附情況。結(jié)果表明:隨溫度的升高,吸附率遞減;吸附溫度為5.0～15.0 ℃時(shí),吸附率不小于92%。試驗(yàn)選擇吸附溫度為15.0 ℃。

試驗(yàn)還進(jìn)行了IL-β-CDCP的吸附動(dòng)力學(xué)研究,結(jié)果表明:吸附過(guò)程在10.0 min內(nèi)完成,并且在1.0 h內(nèi)吸附率保持穩(wěn)定(92.0%)。試驗(yàn)選擇吸附時(shí)間為10.0 min。

2．1．4 吸附容量

試驗(yàn)計(jì)算了IL-β-CDCP對(duì)蘆丁的吸附容量(1.0 g IL-β-CDCP吸附蘆丁的最大量)。結(jié)果表明:當(dāng)體系中蘆丁的質(zhì)量濃度為30.0 mg·L-1時(shí),吸附達(dá)到飽和,IL-β-CDCP對(duì)蘆丁吸附容量是12.0 mg·g-1。

2．2 洗脫條件的選擇

2．2．1 洗脫劑

試驗(yàn)考察了10 g·L-1溴化十六烷三甲基銨(CTAB)溶液,2.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液、甲醇、乙醇的洗脫效率。結(jié)果表明:上述不同的洗脫劑的脫附率依次為24.0%,59.0%,81.0%,94.0%。試驗(yàn)選擇乙醇作為洗脫劑。

試驗(yàn)考察了洗脫劑的體積為2.0～10.0 mL時(shí)對(duì)洗脫效率的影響。結(jié)果表明:洗脫劑體積為4.0 mL時(shí),洗脫效率為94.0%。試驗(yàn)選擇洗脫劑體積為4.0 mL。預(yù)富集倍數(shù)(吸附前樣品體積除以洗脫體積)為10。

2．2．2 洗脫溫度及洗脫時(shí)間

試驗(yàn)考察了洗脫溫度為25.0～60.0 ℃時(shí)對(duì)蘆丁的洗脫情況。結(jié)果表明:隨洗脫溫度的升高,脫附率遞增;洗脫溫度為35.0～60.0 ℃時(shí),脫附率不小于94%。試驗(yàn)選擇洗脫溫度為35.0 ℃。

試驗(yàn)考察了洗脫時(shí)間為5.0～60.0 min時(shí)對(duì)蘆丁洗脫情況的影響。結(jié)果表明:隨洗脫時(shí)間的增加,洗脫過(guò)程在10.0 min內(nèi)完成,并且在1.0 h內(nèi)脫附率保持穩(wěn)定(94.0%)。試驗(yàn)選擇洗脫時(shí)間為10.0 min。

2．3 IL-β-CDCP的重復(fù)利用

IL-β-CDCP經(jīng)6次洗脫后,對(duì)蘆丁的吸附率保持在85.0%以上,表明IL-β-CDCP有良好的重復(fù)利用性能。

2．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按試驗(yàn)方法對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:蘆丁的線性范圍為0.06～7.0 mg·L-1,線性回歸方程為y=0.420x+0.129,相關(guān)系數(shù)為0.996 1。方法的檢出限(3s/k)為8.1 μg·L-1。

與其他文獻(xiàn)方法比較[4,11-13],本方法具有比直接紫外分光光度法檢出限低、實(shí)用性更強(qiáng),比高效液相色譜法線性范圍寬、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)。

2．5 樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)復(fù)方蘆丁片及苦蕎掛面樣品進(jìn)行測(cè)定,并與高效液相色譜法(HPLC)[1]進(jìn)行對(duì)比,樣品分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品分析結(jié)果(n=6)Tab. 1 Analytical results of the samples(n=6)

2．6 IL-β-CDCP-蘆丁的包合作用

通過(guò)傅里葉變換紅外光譜(FTIR)及包合常數(shù)討論IL-β-CDCP與蘆丁之間的相互作用。

2．6．1 FTIR

IL-β-CDCP、IL-β-CDCP-蘆丁、蘆丁的紅外光譜圖見(jiàn)圖1。

由圖1可知:IL-β-CDCP-蘆丁在1 574～1 618 cm-1處有蘆丁結(jié)構(gòu)里苯環(huán)的σC=C吸收峰,3 390 cm-1處峰形變強(qiáng),這些改變說(shuō)明蘆丁進(jìn)入了IL-β-CDCP的空腔中。

2．6．2 包合常數(shù)

包合常數(shù)(K)是決定環(huán)糊精與客體包合性質(zhì)的重要參數(shù),K越大越易形成包合物。包合常數(shù)可通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法和Hildebrrand-Benesi方程獲得[14]。

β-CD、IL-β-CD的濃度與吸光度的雙倒數(shù)曲線見(jiàn)圖2。

(a) IL-β-CDCP (b) IL-β-CDCP-蘆丁 (c) 蘆丁 圖1 IL-β-CDCP、IL-β-CDCP-蘆丁、蘆丁的紅外光譜Fig. 1 FTIR spectra of IL-β-CDCP, IL-β-CDCP-rutin and rutin

圖2 雙倒數(shù)曲線Fig. 2 Double reciprocal plots

由圖2可知:雙倒數(shù)曲線中β-CD、IL-β-CD的濃度的倒數(shù)與吸光度的倒數(shù)呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.994 8,0.996 7。β-CD、IL-β-CD對(duì)蘆丁形成了包合比為1∶1的包合物,由所得直線的斜率與截距計(jì)算得β-CD對(duì)蘆丁的包合常數(shù)為1.36×103L·mol-1,IL-β-CD對(duì)蘆丁的包合常數(shù)為1.72×103L·mol-1。包合常數(shù)反應(yīng)了主體分子對(duì)客體結(jié)合能力的強(qiáng)弱,由此可以說(shuō)明IL-β-CD對(duì)蘆丁的包合能力強(qiáng)于β-CD對(duì)蘆丁的包合能力。

本方法操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好,增加了被測(cè)物與離子液體的接觸面積,減少了離子液體的使用量和在水中的損失。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊俊,王文輝,王齊,等.苦蕎掛面中蘆丁含量測(cè)定方法研究[J].光譜實(shí)驗(yàn)室, 2010,27(5):1834-1836．

[2] 臧志和,曹麗萍,鐘鈴.蘆丁藥理作用及制劑的研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2007,26(7):758-760．

[3] WANG J, WANG H, HAN S. Ultrasensitive determination of epicatechin, rutin, and quercetin by capillary electrophoresis chemiluminescence[J]. Acta Chromatographica, 2012,24(4):679-688．

[4] SUN Y, LI W, WANG J, et al. Determination of rutin in cigarette tobacco, filters, mainstream smoke and burned ash of different branded cigarettes by high performance liquid chromatography[J]. Molecules, 2012,17(4):3751-3760．

[5] YIN H, ZHOU Y, CUI L, et al. Sensitive voltammetric determination of rutin in pharmaceuticals, human serum, and traditional Chinese medicines using a glassy carbon electrode coated with graphene nanosheets, chitosan, and a poly (amido amine) dendrimer[J]. Microchimica Acta, 2011,173(3):337-345．

[6] LI X, ANGST M S, CLARK J D. Opioid-induced hyperalgesia and incisional pain[J]. Anesthesia & Analgesia, 2001,93(1):204-209．

[7] 高廣慧,田金苗,趙飛,等.固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定中藥制劑及保健食品中芍藥苷[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè), 2015,51(2):228-230．

[8] CRINI G. Recent developments in polysaccharide-based materials used as adsorbents in wastewater treatment[J]. Progress in Polymer Science, 2005,30(1):38-70．

[9] PING W H, ZHU X S, WANG B S. An ionic liquid loadedβ-cyclodextrin-cross-linked polymer as the solid phase extraction material coupled with high-performance liquid chromatography for the determination of rhodamine B in food[J]. Analytical Letters, 2014,47(3):504-516．

[10] SLABBERT N P. Ionisation of some flavanols and dihydroflavonols[J]. Tetrahedron, 1997,33(7):821-824．

[11] WU H, CHEN M, FAN Y, et al. Determination of rutin and quercetin in Chinese herbal medicine by ionic liquid-based pressurized liquid extraction-liquid chromatography-chemiluminescence detection[J]. Talanta, 2012,88(1):222-229．

[12] PENG L, WANG Y, ZENG H, et al. Molecularly imprinted polymer for solid-phase extraction of rutin in complicated traditional Chinese medicines[J]. Analyst, 2011,136(4):756-763．

[13] 李曉芳.紫外分光光度法測(cè)定銀杏葉提取物中蘆丁含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2001,12(3):204-204．

[14] ZARZYCKI P K, LAMPARCZYK H. The equilibrium constant of beta-cyclodextrin-phenolphtalein complex; influence of temperature and tetrahydrofuran addition[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 1998,18(1/2):165-170．