, , , , *

(1. 貴州省疾病預防控制中心, 貴陽 550004; 2. 貴州師范學院 化學與生命科學學院, 貴陽 550018)

甲硝唑(MNZ)是人工合成的硝基咪唑類藥物,廣泛用于預防和治療組織滴蟲病、球蟲病等疾病[1]。近年來,甲硝唑被許多蜂農用來預防和控制蜜蜂孢子蟲病,因療效明顯,價格低廉,被蜂農廣泛使用,這造成了甲硝唑藥物在蜂蜜中殘留[2]。甲硝唑對細菌有誘變作用,對人體具有神經毒性和潛在致癌性[3]。為防止甲硝唑殘留對人體健康產生危害,歐盟、加拿大、美國等禁止甲硝唑用于食源性動物養(yǎng)殖。我國農業(yè)部和國家藥品監(jiān)督管理局2002年頒布的227號公告規(guī)定甲硝唑及其鹽、酯及制劑不準以促進動物生長為目的在所有食品動物飼養(yǎng)過程中使用。為了解蜂蜜中甲硝唑的殘留現狀,建立準確、快速地測定蜂蜜中甲硝唑含量的方法十分必要。

目前,甲硝唑的測定方法主要有高效液相色譜法[4]、液相色譜-質譜法或液相色譜-串聯質譜法[5-9]、氣相色譜法[10]、氣相色譜-質譜法[11]等。氣相色譜法和高效液相色譜法只能依靠保留時間定性,蜂蜜基質干擾嚴重,且甲硝唑殘留量低,檢出限達不到要求;氣相色譜-質譜法測定時甲硝唑需衍生化,受衍生效率的影響;雖然液相色譜-串聯質譜法具有靈敏度高、檢出限低等特點,但是蜂蜜中甲硝唑的殘留量接近高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)的檢出限,還需要提高樣品的前處理技術進行富集凈化。本工作以固相萃取柱富集凈化,采用超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)測定蜂蜜中甲硝唑的含量。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Thermo Ultimate 3000型超高效液相色譜儀;TSQ Quantum ultra型三重四極桿質譜儀,配電噴霧離子源;3-18K型臺式高速離心機;TTL-DC Ⅱ型氮吹儀;Aquaplus型超純水機;IKA MS3型渦旋混勻器;KQ-700DV型數控超聲波清洗器;MCS固相萃取柱(500 mg/6 mL)。

甲硝唑標準儲備溶液:1.000 g·L-1,稱取甲硝唑標準品(純度大于99.5%) 10 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,-18 ℃冰箱保存。

D4-甲硝唑(內標)儲備溶液:0.100 g·L-1,取D4-甲硝唑1 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,-18 ℃冰箱保存。

磷酸氫二鉀溶液:0.5 mol·L-1,稱取三水合磷酸氫二鉀57.00 g,用水配制成500 mL溶液。

甲酸、甲醇和乙腈為色譜純,氨水、鹽酸為優(yōu)級純,乙酸乙酯、磷酸氫二鉀為分析純,試驗用水為超純水。

1．2 儀器工作條件

1) 色譜條件 Hypersil Gold-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,1.9 μm),柱溫為30 ℃;進樣體積為10 μL;流量為0.3 mL·min-1。流動相:A為0.1%(體積分數,下同)甲酸溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～0.5 min時,A為95%;0.5～5.5 min時,A由95%降至10%,保持1.5 min;7.0～7.1 min時,A由10%升至95%。

2) 質譜條件 電噴霧正離子源(ESI+),噴霧電壓3 kV;毛細管溫度350 ℃,蒸發(fā)溫度270 ℃;鞘氣壓力270 kPa,輔助氣壓力104 kPa;多反應監(jiān)測(MRM)模式。其余質譜參數見表1,其中“*”為定量離子。

表1 質譜參數Tab. 1 MS parameters

1．3 試驗方法

1) 樣品提取 稱取試樣5.00 g于50 mL聚丙烯刻度離心管中,分別加入40 μg·L-1D4-甲硝唑溶液200 μL和0.5 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液10 mL,渦旋溶解,再加入乙酸乙酯10 mL,渦旋提取2 min,以10 000 r·min-1轉速離心3 min。移取上層乙酸乙酯5 mL于10 mL試管中,水浴50 ℃氮吹干,加入甲醇-40 mmol·L-1鹽酸(5+95)溶液2.0 mL,超聲溶解1 min,溶解液待凈化。

2) 樣品凈化 依次用甲醇5 mL、40 mmol·L-1鹽酸溶液5 mL活化MCS固相萃取柱,將上述溶解液轉移至MCS固相萃取柱內。待溶解液過柱后,依次用水5 mL、甲醇5 mL淋洗雜質,真空抽干后用氨化甲醇(5+95)溶液5 mL洗脫。收集洗脫液于50 ℃下氮吹至干,加入0.1%甲酸-乙腈(90+10)溶液1.0 mL溶解殘留物,渦旋混勻10 s,過0.22 μm濾膜,按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2．1 色譜行為

甲硝唑標準溶液和樣品的MRM圖見圖1。

2．2 儀器工作條件的選擇

甲硝唑呈弱堿性,使用ESI+模式進行測定。試驗對目標化合物進行全掃描,找出準分子離子峰,通過改變試驗條件(毛細管溫度、蒸發(fā)溫度等),使母離子以最大效率通過一級質譜進入二級質譜,并且以此準分子離子峰為母離子進行轟擊,進行二級質譜掃描,找出兩個信號較強的碎片離子構成監(jiān)測離子對。選擇不同的碰撞電壓和滯留時間優(yōu)化特征離子,選擇的碰撞電壓和離子對見表1。

在流動相中加低含量的甲酸可得到更加豐富的離子碎片信息,改善甲硝唑峰形,提高測定的靈敏度。試驗選擇0.1%甲酸溶液和乙腈作為流動相,進行二元梯度洗脫。

(a) 甲硝唑標準溶液 (b) 樣品 圖1 甲硝唑標準溶液和樣品的MRM圖Fig. 1 MRM chromatograms of metronidazole standard solution and the sample

2．3 樣品提取條件的選擇

考察了二氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈為提取劑時對測定的影響。結果表明:二氯甲烷毒性大,不利于試驗人員的健康;文獻[1]中報道乙酸乙酯和乙腈對甲硝唑的提取效率相當,乙腈作為提取劑時,需加入氯化鈉促使分層,且沸點較高,濃縮耗時較長。試驗選擇乙酸乙酯作為提取劑。

蜂蜜基質的物理性狀差別較大,直接使用有機溶劑提取時很難完全混勻,所以需用水或0.5 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液(pH約為8.8)稀釋溶解蜂蜜后再用有機溶劑提取。甲硝唑是弱堿性化合物,酸性條件下呈質子化狀態(tài),不易進入有機相,在弱堿性條件下呈游離分子狀態(tài)。試驗考察了用水和0.5 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液稀釋溶解蜂蜜對甲硝唑回收率的影響。結果表明:使用水、0.5 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液稀釋溶解蜂蜜時甲硝唑的回收率依次為93.0%,82.0%。試驗選擇0.5 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液稀釋溶解蜂蜜后用乙酸乙酯提取蜂蜜中甲硝唑。

2．4 基質效應的影響

基質和干擾組分的存在影響待測物的離子化效率,從而影響定量結果的準確性,常表現為基質增強或基質抑制效應。試驗分別采用空白蜂蜜按照試驗方法提取與凈化后的定容液和初始流動相作為標準溶液的稀釋溶劑,通過測定標準溶液的峰面積的比值考察基質效應的強弱。結果表明:兩者的峰面積比值為0.757,這表明蜂蜜基質對甲硝唑的測定具有一定的抑制效應,可采用內標法或基質匹配的標準曲線定量,從而有效地降低樣品的基質效應。試驗選擇同位素內標法定量。

2．5 標準曲線與測定下限

用0.1%甲酸-乙腈(90+10)溶液將1.000 g·L-1甲硝唑標準儲備溶液稀釋成0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0,32.0,64.0 μg·L-1標準溶液系列,其中D4-甲硝唑內標的質量濃度為4.0 μg·L-1。在儀器工作條件下對上述標準溶液系列進行測定,以甲硝唑的質量濃度為橫坐標,對應的甲硝唑峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標繪制標準曲線。結果表明:甲硝唑的線性范圍為0.5～64.0 μg·L-1,線性回歸方程為y=0.431x-0.005,相關系數為0.999 8。

以10倍信噪比計算方法的測定下限(10S/N)為0.15 μg·kg-1。

2．6 方法的精密度和回收試驗

在空白蜂蜜樣品中進行加標回收試驗,平行測定6次,其結果見表2。

表2 精密度和回收試驗結果(n=6)Tab. 2 Results of tests for precision and recovery(n=6)

由表2可知:加標回收率為95.6%～98.8%,相對標準偏差(RSD)為4.2%～8.3%。

2．7 樣品分析

按試驗方法對在某超市隨機購買的30批次蜂蜜樣品進行測定。結果表明:26批次蜂蜜樣品中未檢出甲硝唑,4批次蜂蜜樣品中檢出甲硝唑,檢出率為13.3%,甲硝唑的質量分數為0.4～6.5 μg·kg-1。這說明蜂農在養(yǎng)蜂過程中濫用甲硝唑藥物預防和控制蜜蜂疾病等現象仍有發(fā)生。

本工作采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定蜂蜜中甲硝唑,有效地減少了基質對甲硝唑測定的干擾,該方法專屬性強、測定下限低、快速、靈敏、準確。

[1] 張鴻偉,簡慧敏,林黎明,等.液相色譜-四極桿/離子阱質譜快速測定蜂蜜中痕量硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留[J].分析測試學報, 2012,31(7):763-770．

[2] 張璐,孔祥虹,王菡,等.在線凈化-超高效液相色譜同位素稀釋串聯質譜法檢測蜂蜜中硝基咪唑類及其代謝物的殘留[J].分析化學, 2014,42(12):1735-1742．

[3] 殷居易,謝東華,劉永明,等.蜂產品中9種硝基咪唑類藥物原藥及代謝物殘留量的HPLC-APCI(+)MS/MS分析[J].分析測試學報, 2009,28(8):935-939．

[4] 高小龍,王大菊,汪紀倉,等.蜂產品中硝基咪唑類藥物殘留高效液相色譜法研究[J].湖北大學學報(自然科學版), 2008,30(1):71-75．

[5] 丁濤,徐錦忠,劉飛,等.高效液相色譜-串聯質譜聯用測定蜂王漿中的三種硝基咪唑類殘留[J].色譜, 2006,24(4):331-334．

[6] 郭少飛,王鵬,荊濤,等.高效液相色譜-串聯質譜法同時測定蜂蜜中甲硝唑、二甲硝咪唑和洛硝噠唑殘留[J].華中科技大學學報(醫(yī)學版), 2008,37(6):830-833．

[7] 左志輝,高立勤,唐素芳.固相萃取-液相色譜串聯質譜法同時定量檢測蜂蜜中28種抗生素類藥物殘留的研究[J].藥物分析雜志, 2009,29(7):1196-1201．

[8] 倪曉丹,盧平,何旭倫,等.食品中甲硝唑殘留的碳納米管固相萃取-高效液相色譜法測定[J].分析測試學報, 2010,29(8):807-811．

[9] 劉永明,曹彥忠,李金,等.液相色譜-串聯質譜法快速測定蜂蜜中3種硝基咪唑類藥物殘留[J].色譜, 2010,28(6):596-600．

[10] 劉波,黃為紅,王金中.氣相色譜-電子捕獲檢測器同時測定硝基咪唑類藥物[J].分析科學學報, 2008,24(5):586-588．

[11] 何東,李秀英,冼燕萍,等.氣相色譜-質譜法測定祛痘化妝品中4種硝基咪唑類化合物[J].分析測試學報, 2015,34(8):911-916．