符東順， 何冠諦， 付天嶺， 何騰兵，3

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025； 2.貴州大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，貴州貴陽(yáng) 550025； 3.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025)

重金屬污染是當(dāng)今世界關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題之一[1]，主要表現(xiàn)在重金屬對(duì)生物和環(huán)境的危害性上。一方面，重金屬被排入環(huán)境后具有永久性，且可在生物體內(nèi)慢慢累積[2]。另一方面，大部分重金屬并非生物體的必需元素，當(dāng)重金屬元素含量達(dá)到某一生物的耐受水平時(shí)，過(guò)量重金屬可以對(duì)生物體的結(jié)構(gòu)成分造成破壞，進(jìn)而威脅生物生存。隨著人們對(duì)重金屬危害這一問(wèn)題的進(jìn)一步關(guān)注，重金屬污染土壤修復(fù)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。傳統(tǒng)的重金屬修復(fù)手段本身有較大缺陷，如客土、覆土、鈍化劑等措施花費(fèi)巨大但收效甚微，同時(shí)可能還會(huì)引入新的污染物造成更嚴(yán)重的危害[3]。生物修復(fù)技術(shù)因其材料廣、價(jià)格低、吸附能力強(qiáng)、易于管理等優(yōu)勢(shì)成為當(dāng)前的主流修復(fù)技術(shù)[4]。目前生物修復(fù)技術(shù)以豆科植物根瘤菌協(xié)助植物抵御重金屬脅迫作為新的研究趨勢(shì)[5]。雖然新修復(fù)手段能克服傳統(tǒng)修復(fù)手段中的大部分弊端，但該研究尚處于初步階段。在種源方面，自然生長(zhǎng)狀態(tài)下豆科植物的根瘤菌幾乎無(wú)協(xié)助植物體抵御重金屬吸收的能力或者效果很低，而基因技術(shù)獲得的高抗性豆科植物在實(shí)際中的應(yīng)用效果并不明確；根瘤菌與植物的共同體是否有活化周圍環(huán)境中重金屬的能力也尚未明確；除植物體吸收的重金屬外，剩余的重金屬是否對(duì)人體和環(huán)境造成危害等許多新問(wèn)題還沒(méi)得到很好解決。另外，以抗性植物(高累積和低吸收的生物)作為新的土地修復(fù)手段從20世紀(jì)50年代[6-7]后開始受到廣泛關(guān)注，隨著分子水平研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，植物體在重金重屬脅迫下不僅外在特征會(huì)發(fā)生改變，植物體內(nèi)的抗性基因也可通過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄蛋白來(lái)響應(yīng)重金屬脅迫。這些植物體內(nèi)所表現(xiàn)的作用機(jī)制及其模型逐漸被探討并在品種選育以及食品安全和土地修復(fù)等領(lǐng)域被運(yùn)用?？偠灾┠昕怪亟饘俚纳镅芯恐饕獜目剐曰虻暮Y選、耐抗基因/數(shù)量性狀座位(quantitative trait locus，簡(jiǎn)稱QTL)的定位、基因分離及表達(dá)、耐受性的遺傳模型分析等方面取得進(jìn)展，因此本文主要從抗性材料的發(fā)現(xiàn)和基因獲取、基因定位的方法和技術(shù)、抗性基因的作用機(jī)制等方面進(jìn)行論述。

1 抗性材料與篩選方法

植物抗性(plant resistance)是指植物適應(yīng)逆境的能力?？剐圆牧系墨@取在闡釋整個(gè)生物抗性的研究中具有關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，生物普遍具有不同程度的抗重金屬脅迫能力，如微生物具有生命周期短、適應(yīng)性強(qiáng)、突變頻率高等特點(diǎn)，是抗重金屬脅迫試驗(yàn)的首選材料；動(dòng)物生命周期長(zhǎng)，抗性性狀不明顯，基因突變低，卻能穩(wěn)定遺傳，可用來(lái)進(jìn)行特定的研究；植物只須觀察脅迫環(huán)境下的生存狀態(tài)就可以被辨認(rèn)是否具有抗逆性，具有來(lái)源廣，穩(wěn)定遺傳，且可通過(guò)有性和無(wú)性生殖來(lái)適應(yīng)不同環(huán)境等特點(diǎn)，因此成為科學(xué)研究中最常見的試驗(yàn)材料[8]，當(dāng)前用來(lái)研究耐重金屬脅迫的植物主要有紅景天[9]、蜈蚣草[10]、黑麥草[11]等以及經(jīng)濟(jì)作物水稻[12]、黑麥[13]等。就植物耐重金屬的能力而言，不同科屬植物所表現(xiàn)的能力不同，一般來(lái)說(shuō)，木本植物抗重金屬脅迫的能力最好[14]。Mench等通過(guò)研究普通煙草(NicotiamatabacumL.)、黃花煙草(N.rustica)、玉米等3種植物對(duì)鎘(Cd)脅迫的響應(yīng)表明，由于生理代謝差異，不同植物對(duì)鎘的耐受能力不同，其中煙草抗性比玉米強(qiáng)；同一物種由于個(gè)體單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，簡(jiǎn)稱SNP)的不同，其抗性也存在明顯差異，普通煙草(NicotiamatabacumL.)抗鎘能力比黃花煙草(N.rustica)強(qiáng)[15]。Mench等的研究也表明，這2種煙草耐鎘脅迫強(qiáng)度與重金屬活化能力呈正相關(guān)關(guān)系[16]，因此，可以在不同濃度梯度重金屬脅迫下，通過(guò)觀察不同植物和品種間的耐受情況來(lái)篩選抗性品種；也可以通過(guò)馴化來(lái)培養(yǎng)種源，增強(qiáng)其耐受上限；或者用物理、化學(xué)等手段(紫外突變，化學(xué)藥劑等)誘導(dǎo)生物體基因突變，對(duì)突變的材料進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，從而獲得目的材料。

2 抗性基因的挖掘手段

植物表達(dá)的抗性主要由基因調(diào)控，對(duì)抗性性狀的深入研究就是對(duì)抗性物種基因的研究。在抗性基因的研究中，植物遺傳物質(zhì)測(cè)序是必不可少的。有時(shí)為了獲取更多的抗性基因信息，在對(duì)基因測(cè)序的同時(shí)還伴隨著基因定位。

2.1 抗性基因定位

基因定位(mapping of genes)即利用分子標(biāo)記和目的基因的關(guān)聯(lián)性來(lái)確定目的基因在染色體上的位置和片段的長(zhǎng)度。DNA測(cè)定的主要內(nèi)容是基因測(cè)序，并利用遺傳分析進(jìn)行基因定位。在DNA測(cè)序中，基因混合池和cDNA文庫(kù)等手段的利用能大大提高數(shù)據(jù)的精確度并降低基因定位的工作量，因此被廣泛應(yīng)用。以集團(tuán)分離分析法(bulked segregation analysis，簡(jiǎn)稱BSA)對(duì)基因測(cè)序?yàn)槔齕17]，該方法的思路是在構(gòu)建基因混合池后，將基因混合池中的基因打斷，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，通過(guò)遺傳分析進(jìn)行基因定位，然后對(duì)候選基因進(jìn)行再定位及測(cè)序。基因混合池是采用1對(duì)具有目標(biāo)基因且表型差異的親本所產(chǎn)生的任何一種分離群體進(jìn)行構(gòu)建的。在利用基因混合池檢測(cè)2組之間的遺傳信息差異時(shí)，與該性狀無(wú)關(guān)的差異會(huì)被消除，這樣所研究性狀相應(yīng)遺傳信息的差異就被凸現(xiàn)出來(lái)了，從而排除其他性狀的干擾。高等植物的DNA由外顯子和內(nèi)含子2部分構(gòu)成，外顯子具有編碼蛋白質(zhì)的功能，內(nèi)含子目前被普遍認(rèn)為可能與編碼區(qū)的表達(dá)量相關(guān)，但本身不具備編碼蛋白的能力。為降低基因測(cè)序費(fèi)用，通常會(huì)采用mRNA反轉(zhuǎn)錄或者其他一些技術(shù)來(lái)構(gòu)建不含內(nèi)含子的cDNA文庫(kù)，同源克隆是其中一種手段。同源克隆是在了解目的生物具有某一功能但其功能基因未知的情況下，尋找有該功能且親緣關(guān)系很近的另一物種，且該物種的功能基因已定位，通過(guò)引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增出該功能基因片段內(nèi)的1段保守編碼基因，以該保守基因?yàn)槟０逋ㄟ^(guò)PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends)，以獲取整個(gè)目的基因，從目的生物中擴(kuò)增出同源序列(homologous sequences，簡(jiǎn)稱RGA)[18-20]。雖然同源克隆技術(shù)的限制因素很多，但在抗病基因作用機(jī)制、物種間親緣度以及環(huán)境在植物進(jìn)化中的影響度等研究中具有很大的潛力。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，借助生物信息學(xué)與數(shù)據(jù)庫(kù)的聯(lián)用，能在短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模識(shí)別、鎖定同源物種中人們所需要的基因，并通過(guò)生物技術(shù)獲取大量的抗逆性RGA。將這些RGA和功能基因比對(duì)后，可預(yù)測(cè)出目的基因的序列、結(jié)構(gòu)及其轉(zhuǎn)錄蛋白所參與的抗脅迫反應(yīng)，保守區(qū)域基因頻率的變化也可作為物種間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的依據(jù)，同時(shí)也能判斷不同環(huán)境脅迫對(duì)物種間的影響。

植物的抗性基因主要有水平抗性(數(shù)量性狀)和垂直抗性(質(zhì)量性狀)等2種類型[21]。前者的生物抗性性狀由多個(gè)微效基因累積控制，而后者則由單個(gè)主效基因控制。所以在對(duì)基因進(jìn)行定位時(shí)，可先進(jìn)行遺傳分析，判斷抗性表現(xiàn)型是由主效基因控制還是多個(gè)微效基因控制，進(jìn)而從1對(duì)具有目標(biāo)基因且表型差異的親本所產(chǎn)生后代基因型分離比例來(lái)推斷抗性類型。另外，還須通過(guò)等位性測(cè)定來(lái)驗(yàn)證目的基因是否已被定位。完成基因測(cè)序的前期工作后，即可進(jìn)行基因的粗定位，通過(guò)遺傳圖譜上的分子標(biāo)記連鎖目的基因，從而找到目的基因在染色體上的位置。分子標(biāo)記之所以能連鎖目的基因是因?yàn)榛蚝瓦z傳標(biāo)記都位于染色體的基因座位上，每個(gè)座位都以1個(gè)DNA片段的形式存在，兩者屬于同源物質(zhì)。與其他基因片段相比，它是以個(gè)體間核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，可直接在DNA水平上檢測(cè)生物個(gè)體之間的差異，是生物個(gè)體在DNA水平上遺傳變異的直接反映[22]。此外分子標(biāo)記有明顯分辨區(qū)域，在穩(wěn)定性、共顯性、多樣性和數(shù)量方面也具有明顯優(yōu)異性[23]，因此具有輔助基因定位的作用。同樣在基因定位中，遺傳圖譜也是必不可少的工具。遺傳圖譜是某一物種的染色體圖譜，功能是顯示所知基因或遺傳標(biāo)記的相對(duì)位置，可由遺傳重組測(cè)驗(yàn)結(jié)果推算出在1條染色體上可以發(fā)生的突變位點(diǎn)的直線排列(基因位點(diǎn)的排列)圖[24]。為提高遺傳圖譜的分辨率和精度，須對(duì)作圖群體的選擇進(jìn)行嚴(yán)格要求：親本間的相對(duì)性狀要表現(xiàn)出明顯差異；親本要有較高的單核苷酸多態(tài)性，以便尋找與要定位基因緊密連鎖的分子標(biāo)記；試驗(yàn)材料的種群數(shù)量應(yīng)該滿足試驗(yàn)要求，試驗(yàn)材料的相對(duì)性狀分離要符合孟德爾分離定律；目的基因的基因型由其表現(xiàn)型表達(dá)，因此對(duì)表現(xiàn)型進(jìn)行測(cè)定也是決定基因定位質(zhì)量的關(guān)鍵。通過(guò)嚴(yán)格篩選出來(lái)的分離群體可用來(lái)構(gòu)建遺傳圖譜。遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建須依靠繪圖軟件(MapMarker、JionMap等)進(jìn)行標(biāo)記和表型統(tǒng)計(jì)，分析分子標(biāo)記和基因控制的表現(xiàn)型的連鎖關(guān)系，參照連鎖圖譜構(gòu)建的理論基礎(chǔ)(染色體的交換與重組)，1%的重組率近似于1 cM遺傳圖距，把已定位的基因片段按連鎖關(guān)系繪制在軟件上。用分子標(biāo)記作遺傳圖譜會(huì)產(chǎn)生不同的帶型，因此只須找到和基因控制的表現(xiàn)型有連鎖關(guān)系的分子標(biāo)記在遺傳圖譜產(chǎn)生的特定帶型便能完成主效基因的初定位。性狀是由基因和環(huán)境共同決定的，微效基因的每個(gè)基因只能產(chǎn)生部分影響效果，其性狀表現(xiàn)為連續(xù)變異。相對(duì)主效基因而言，數(shù)量性狀的表現(xiàn)型由環(huán)境條件引起的變異概率更大。所以在分析數(shù)量性狀的表現(xiàn)型值中，通常先對(duì)環(huán)境影響進(jìn)行評(píng)估，再算出基因所占的比率，進(jìn)而評(píng)估數(shù)量性狀遺傳力的大小。永久性作圖群體、高世代回交QTL分析[25]、次級(jí)作圖群體[26]等在QTL分析中的應(yīng)用，能把復(fù)雜性狀變?yōu)楹?jiǎn)單性狀，把多基因分解為符合孟德爾分離定律的單基因。永久性作圖群體在對(duì)QTL進(jìn)行分析時(shí)具有以下優(yōu)勢(shì)：以各個(gè)品系作為分離單元，使得數(shù)量性狀的測(cè)量更加精準(zhǔn)；易于進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，以減少試驗(yàn)誤差；可通過(guò)多點(diǎn)測(cè)試來(lái)評(píng)價(jià)基因與環(huán)境的互作關(guān)系。高世代回交QTL分析(advanced backcross QTL，簡(jiǎn)稱AB-QTL)是用回交2代(BC2)或回交3代(BC3)進(jìn)行微效基因定位的分析方法之一，該方法能很好地從野生型等非優(yōu)良材料中篩選優(yōu)良的QTL，為優(yōu)良品系的育種服務(wù)。AB-QTL分析的優(yōu)點(diǎn)：在低世代遠(yuǎn)源雜交的群體中，通常會(huì)出現(xiàn)一些不良的性狀(如落花、落果等)影響數(shù)量性狀的測(cè)量。相對(duì)于低世代群體(F2、BC1等)，在AB群體的發(fā)展過(guò)程中，逐步淘汰一些來(lái)自供體的不良性狀；在高代回交群體中，個(gè)體表現(xiàn)型與優(yōu)良的輪回親本更加相似，AB群體的數(shù)量性狀表現(xiàn)更加正常，從而提高優(yōu)異數(shù)量性狀的測(cè)定；AB群體中供體的基因頻率很小，因此供體基因型之間的相互作用(上位性作用)基本可以消除，所以供體中的QTL轉(zhuǎn)移到受體后，其效應(yīng)值變化不大；隨著回交次數(shù)的不斷增加，越容易地獲得近等基因系和進(jìn)行重復(fù)的田間試驗(yàn)。由于多次回交可使優(yōu)良性狀基因在減數(shù)分裂過(guò)程中的重組概率更大，容易打破QTL與不良基因之間的連鎖關(guān)系，因此可更好地進(jìn)行QTL分析。次級(jí)作圖群體由近等基因系(near-isogenic line，簡(jiǎn)稱NIL)、導(dǎo)入系(introgression line，簡(jiǎn)稱IL)、染色體片段代換系(chromosomal segment subsititution line，簡(jiǎn)稱CSSL)等次級(jí)品系發(fā)展而來(lái)。次級(jí)作圖群體在QTL分析中之所以能得到廣泛利用是因?yàn)樗哂忻黠@的優(yōu)勢(shì)：首先次級(jí)作圖群體具有永久性群體的特點(diǎn)，能夠被反復(fù)使用，且能排除環(huán)境的影響；其次每個(gè)品系與輪回親本的遺傳背景十分相似，所以無(wú)遺傳背景的干擾，因此QTL表型分析的結(jié)果較準(zhǔn)確；最后各個(gè)品系只含有供體親本很小部分的遺傳物質(zhì)，通常只含有1個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因片段，所以能把控制同一數(shù)量性狀的多個(gè)QTL進(jìn)行分解，即把多基因分解為符合孟德爾定律的單一因子，使復(fù)雜性狀簡(jiǎn)單化，從而大大提高QTL分析的準(zhǔn)確度和可靠性?？傊虼侄ㄎ痪褪峭ㄟ^(guò)找出與目的基因有關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記來(lái)確定基因在染色體上的位置，而精細(xì)定位則是利用更小的標(biāo)記分子大幅度縮小候選基因的范圍。

2.2 基因測(cè)序

基因定位對(duì)研究植物的抗性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，植物響應(yīng)重金屬脅迫一般是以基因?yàn)橹鲗?dǎo)的行為變化，通過(guò)功能基因的堿基序列編碼蛋白來(lái)調(diào)節(jié)植物生理，從而適應(yīng)環(huán)境脅迫，因此還須了解已定位基因的堿基序列。從1977年第一代DNA測(cè)序技術(shù)(Sanger法)應(yīng)用至今，短短幾十年內(nèi)，基因測(cè)試技術(shù)已發(fā)展到第三代。Sanger雙脫氧鏈終止法原理是在新合成的DNA鏈中加入雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)這種特殊核苷酸底物后，由于在脫氧核糖的3′位置缺少1個(gè)羥基，不能形成磷酸二酯鍵，從而無(wú)法與其他正常核苷酸連接[27]；將此片段和其他參與DNA合成的材料一起保溫，可形成許多以雙脫氧核苷酸ddx(dd表示雙脫氧，x表示A，C，G，T)殘基為3′端結(jié)尾的基因片段，再將這些基因片段平行地點(diǎn)加在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳板上，通過(guò)跑膠進(jìn)行分離，從而得到相應(yīng)的放射性自顯影圖譜，進(jìn)而確定x的信息。但一代測(cè)序的定位時(shí)間長(zhǎng)、價(jià)格高、低通量等特點(diǎn)導(dǎo)致其無(wú)法大規(guī)模地流行，二代測(cè)序由于具有高通量的特點(diǎn)，因此目前依然占有很大的市場(chǎng)。目前的二代測(cè)序平臺(tái)主要有基于焦磷酸測(cè)序原理的454(GS-FLX)，以DNA簇和可逆性末端終止為核心技術(shù)的Solexa-Illumina Genome Analyzer[28]，基于雙堿基編碼原理的SOLiD[29]和以連接反應(yīng)進(jìn)行DNA序列分析的Polonator[30]。但二代測(cè)序技術(shù)存在讀取長(zhǎng)度短、樣品制作難等缺陷。三代測(cè)序是一種納米單孔測(cè)序技術(shù)，其測(cè)序過(guò)程無(wú)須進(jìn)行基因的擴(kuò)增。其中PacBio SMRT技術(shù)[31]采用邊合成邊測(cè)序的策略，以SMRT芯片為測(cè)序載體，使DNA聚合酶和模板結(jié)合4色熒光標(biāo)記的4種堿基，在堿基配對(duì)階段，隨著不同堿基的加入所產(chǎn)生的不同光就會(huì)被捕獲，這樣就能依據(jù)光的波長(zhǎng)和峰值來(lái)判定進(jìn)入的堿基種類。三代測(cè)序相對(duì)于二代測(cè)序來(lái)說(shuō)，準(zhǔn)確度偏低，但所產(chǎn)生的誤差都是隨機(jī)誤差，可以通過(guò)多次試驗(yàn)進(jìn)行消除，還能利用零模波導(dǎo)孔(zero mode waveguide hole，簡(jiǎn)稱ZMW)消除孔外過(guò)多的游離核苷酸單體產(chǎn)生的熒光，從而降低背景值；也可通過(guò)相連2個(gè)堿基的測(cè)序時(shí)間來(lái)檢測(cè)一些基因的修飾情況，避免傳統(tǒng)測(cè)序手段中對(duì)甲基化基因組進(jìn)行的重亞硫酸鹽(bisulfite)處理。DNA定位和測(cè)序完成后即可得出目的基因的位置和堿基序列，通過(guò)基因比對(duì)找到突變基因，QTL定位還須對(duì)每個(gè)基因的貢獻(xiàn)度進(jìn)行評(píng)估。相對(duì)而言，表達(dá)水平的抗性基因研究省去了基因定位環(huán)節(jié)，只須提取某種細(xì)胞在特定生理?xiàng)l件下產(chǎn)生的mRNA并直接對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，再用Q-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因，也可以采用RNA干擾(RNA interference，簡(jiǎn)稱RNAi)干擾技術(shù)啟動(dòng)正向驗(yàn)證，或者通過(guò)過(guò)表達(dá)目標(biāo)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，基因驗(yàn)證后即可得到目的基因的全部信息或者基因序列的信息，同時(shí)也可獲得該基因所轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)信息，進(jìn)而根據(jù)表達(dá)蛋白質(zhì)的類型和所涉及的功能等來(lái)闡述基因的作用機(jī)制。

3 植物抵抗重金屬的作用機(jī)制

重金屬對(duì)植物的毒害是由重金屬的吸收位點(diǎn)、植物細(xì)胞中對(duì)重金屬結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)、重金屬離子的特性和有效性以及各種化學(xué)作用等一系列因素決定的[32]。重金屬脅迫對(duì)生物的作用是相對(duì)的，一方面重金屬脅迫對(duì)植物水分代謝、光合作用、呼吸作用、碳水化合物代謝、氮素代謝、核酸代謝產(chǎn)生直接傷害，另一方面為適應(yīng)不良的生存環(huán)境，植物已建立起一系列以基因表達(dá)為主導(dǎo)的生理機(jī)制，通過(guò)多種離子通道運(yùn)輸轉(zhuǎn)錄蛋白參與自身生理活動(dòng)，使植物作出一系列調(diào)整(滲透調(diào)節(jié)、脫水保護(hù)、抗氧化防御)來(lái)響應(yīng)重金屬的脅迫，從而更好地適應(yīng)逆境[33]。重金屬脅迫首先被各種受體感知，這種感知通常以滲透脅迫的形式傳遞到細(xì)胞受體，再通過(guò)各種信使傳導(dǎo)引起胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的響應(yīng)，以避免或者減輕重金屬脅迫的危害。在脅迫應(yīng)答過(guò)程中，基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)起關(guān)鍵性作用。

3.1 植物外部在重金屬脅迫下的變化

植物體可通過(guò)改變自身的形態(tài)結(jié)構(gòu)來(lái)更好地適應(yīng)重金屬脅迫環(huán)境。葉和根既是主要吸收重金屬的器官又是抵御多余重金屬毒害的第一道防線。部分植物的葉片絨毛有利于抵御空氣中重金屬離子進(jìn)入氣孔，且在低濃度的重金屬環(huán)境中，重金屬主要富集在新葉，但在高濃度的環(huán)境中，重金屬能從新葉遷移到老葉并以脫落的形式達(dá)到降低體內(nèi)重金屬含量的目的[34]；而根際表面的多糖黏液與Cd、鋁(Al)等重金屬有很強(qiáng)的親和性，能把重金屬阻止在根部外；同時(shí)，在重金屬的誘導(dǎo)下，根部產(chǎn)生有機(jī)酸，這些有機(jī)酸可通過(guò)改變土壤的理化性質(zhì)形成根際效應(yīng)來(lái)減少根部對(duì)重金屬的吸收。通過(guò)Al刺激不同品種小麥發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸先從小麥根尖陰離子通道[35-37]釋放出去，這些不同基因型的小麥產(chǎn)生的有機(jī)酸含量與該品種抗重金屬的能力成正比[38-41]，往Al敏感品種中加入有機(jī)物酸(蘋果酸鹽、檸檬酸鹽或草酸鹽)能提高敏感品種抗Al的能力[42]。這種情況在Mench等的研究中也有大量體現(xiàn)[15]，他們還計(jì)算出了Cd與分泌物絡(luò)合的穩(wěn)定常數(shù)和最大吸附量呈正相關(guān)關(guān)系，表明Cd可與根分泌物形成配位化合物，且這些化合物不會(huì)被運(yùn)往膜內(nèi)或被根吸收[43-44]；研究還發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸陰離子的釋放與植物體受到重金屬脅迫的時(shí)間一致[45]，在受Al脅迫后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，參與合成有機(jī)酸的關(guān)鍵酶(PEP羧化酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、檸檬酸合成酶)一直處于活躍狀態(tài)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在Al脅迫下小麥根尖組織外排的有機(jī)酸和基因有關(guān)，將細(xì)菌內(nèi)合成檸檬酸的基因轉(zhuǎn)錄到馬鈴薯中，能促進(jìn)檸檬酸的合成并明顯提高馬鈴薯的抗性。植物體除了通過(guò)老葉外排重金屬來(lái)減輕重金屬危害外，通過(guò)研究植株各個(gè)部分的重金屬富集情況發(fā)現(xiàn)，植物體還可通過(guò)將大部分重金屬集中在地下部分，有效防止重金屬遷移到地上部分，從而減輕地上部分受到的傷害。這種植物體不吸收環(huán)境中高含量的重金屬?gòu)亩馐芏竞Φ默F(xiàn)象被稱為避性。在這種避性作用下，植物體內(nèi)的重金屬濃度并不高，且能維持自身在重金屬污染環(huán)境中較正常的生長(zhǎng)。

3.2 植物體內(nèi)細(xì)胞在重金屬脅迫下的變化

3.2.1 細(xì)胞壁在重金屬脅迫下的變化 細(xì)胞壁是由多糖(纖維素和果膠)、蛋白質(zhì)和脂類等組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；其中多糖含有羥基、羧基和磷酸根等各種離子基團(tuán)和一定的負(fù)電荷，這些結(jié)構(gòu)決定了細(xì)胞壁具有吸附多種重金屬的能力。研究表明，處理后的鎘作用于某些植物后，部分植物的細(xì)胞壁上含有大量可溶性鎘[46]，另外密毛厥細(xì)胞壁能固定70%～90%的銅、鋅、鎘，通過(guò)顯微鏡能觀察到外部的重金屬含量高于細(xì)胞內(nèi)部，但不是所有植物都能出現(xiàn)這種現(xiàn)象[47]。重金屬要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)必須先通過(guò)根尖細(xì)胞的細(xì)胞壁，且通過(guò)胞外途徑和胞內(nèi)途徑運(yùn)往細(xì)胞內(nèi)時(shí)至少還須再經(jīng)過(guò)1層細(xì)胞壁，所以細(xì)胞壁可以作為阻擋重金屬進(jìn)入植物體的第一道屏障。

3.2.2 質(zhì)膜在重金屬脅迫下的變化 細(xì)胞膜是最重要的分隔細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外不同介質(zhì)和組分的界面，同時(shí)是重金屬脅迫信號(hào)的接收器，也是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的關(guān)鍵。當(dāng)重金屬與細(xì)胞壁的結(jié)合達(dá)到飽和時(shí)，就必須經(jīng)過(guò)跨膜運(yùn)輸運(yùn)往原生質(zhì)體，此時(shí)部分重金屬會(huì)與磷脂雙分子層上的離子絡(luò)合，如膜上Ca2+能與砷結(jié)合形成砷酸鹽和亞砷酸鹽沉淀。在非生物脅迫下，信號(hào)先被膜受體感知，再被跨膜蛋白上的酶聯(lián)反應(yīng)放大，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子激活下游功能基因的表達(dá)從而轉(zhuǎn)錄成各種調(diào)節(jié)蛋白，這些蛋白質(zhì)可通過(guò)各種離子通道進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，以調(diào)節(jié)重金屬外排和絡(luò)合重金屬等方式來(lái)減少植物體內(nèi)重金屬有效態(tài)。最具有代表性的是脫落酸(abscisic acid，簡(jiǎn)稱ABA)的合成，ABA是一種重要的參與逆境響應(yīng)的植物激素[48]。當(dāng)細(xì)胞膜上的受體感應(yīng)到重金屬脅迫信息時(shí)，ABA合成酶的相關(guān)基因會(huì)被激活，通過(guò)各種細(xì)胞器合成ABA。ABA可誘導(dǎo)、活化大部分功能基因啟動(dòng)子，從而誘導(dǎo)抗重金屬基因的表達(dá)，因此1個(gè)功能蛋白的被轉(zhuǎn)錄可能是多個(gè)基因相互表達(dá)的結(jié)果。如玉米的ZmUBP基因與Cd2+的脅迫響應(yīng)有關(guān)[49]。泛素特異蛋白酶(ubiquitin-specific protease，簡(jiǎn)稱VSP)[50]存在于真核生物中，經(jīng)組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，檉柳的ZmVBP和ZmVBPa/b/c基因可響應(yīng)脫落酸與重金屬脅迫，在ABA脅迫下這些基因的轉(zhuǎn)錄蛋白活躍表達(dá)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將這些基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，可提高擬南芥對(duì)ABA的敏感性和重金屬的抗性，研究還發(fā)現(xiàn)，ZmVBP16a基因的過(guò)量表達(dá)可引起3個(gè)抗氧化功能基因表達(dá)量的上調(diào)，經(jīng)過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(bimolecular fluorescence complementation，簡(jiǎn)稱BiFc)分析得出，Zmtcp15b和Zmtcp15a在植物體內(nèi)外相互作用，因此Zmvbp14與Zmtcp15家族蛋白可能在逆境響應(yīng)上具有協(xié)同作用，同樣運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)也驗(yàn)證檉柳能響應(yīng)Zn2+、Cd2+、Cu4+的脅迫[50]。受到脅迫時(shí)，檉柳Lea基因過(guò)量表達(dá)會(huì)引起植物內(nèi)的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡(jiǎn)稱SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxisome，簡(jiǎn)稱POD)活性上升，脯氨酸含量以及可溶性蛋白的增加，丙二醛(malonaldehyde，簡(jiǎn)稱MDA)減少，說(shuō)明Lea基因能輔助其他抗重金屬功能基因的表達(dá)，但是Lea本身有順式反應(yīng)元件，所轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)有穩(wěn)定細(xì)胞膜、作為分子屏障、與重金屬離子結(jié)合和防止細(xì)胞氧化等功能，有些像檉柳Les基因一樣，本身就具有抗重金屬的能力，這部分基因的5′非翻譯區(qū)通常含有與重金屬脅迫相關(guān)的順式原件，從而直接響應(yīng)重金屬的脅迫[50]。如重金屬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)能產(chǎn)生活性氧自由基，使細(xì)胞內(nèi)的生物大分子受到損傷，而植物體內(nèi)的SOD、POD、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone，簡(jiǎn)稱GSH)等抗氧化物能夠消除部分重金屬侵害植物時(shí)隨之產(chǎn)生自由基過(guò)多的問(wèn)題[51]。擬南芥中編碼谷胱甘肽合成酶的ATGC、ATGCS基因能直接響應(yīng)重金屬脅迫，進(jìn)而催化產(chǎn)生GSH和植物螯合肽(phytochelatin，簡(jiǎn)稱PC)，這些物質(zhì)能與被吸收的重金屬通過(guò)沉淀、絡(luò)合、吸附等形成無(wú)毒穩(wěn)定的化合物并固定在相對(duì)無(wú)害的區(qū)域[52]。同樣，紫花苜蓿的AtATM3基因(編碼色素氧化酶)能與ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)b基因來(lái)增強(qiáng)GSH和PC的合成來(lái)響應(yīng)重金屬脅迫[53]。細(xì)胞除了能消除重金屬脅迫帶來(lái)的細(xì)胞氧化、絡(luò)合作用以及無(wú)毒區(qū)域固定化的功能外，還具有外排重金屬的功能。在耐鋁品種的研究中，在小麥細(xì)胞外液pH值為4.0～4.5，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)pH值為7.0的體系中，鋁離子通過(guò)質(zhì)外體運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)后能和蘋果酸、檸檬酸結(jié)合，形成的絡(luò)合物再通過(guò)細(xì)胞膜上的通道運(yùn)出[13]。總而言之，植物體消除重金屬脅迫主要依賴外排、內(nèi)解作用。

4 總結(jié)

植物抗性的研究起步早，各種基因定位方法和作用機(jī)制隨著時(shí)間推移形成了從淺到深，從點(diǎn)到面的發(fā)展體系?，F(xiàn)有的抗性基因研究已能夠全面深入地闡釋植物體如何通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白調(diào)控自身生理活動(dòng)，如何通過(guò)編碼特殊的組織蛋白響應(yīng)重金屬毒害，以適應(yīng)逆境。這些理論同時(shí)也揭示了不同植物體之間由于基因上的差異導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)和生理上的差異，致使植物體呈現(xiàn)不同抗重金屬的能力，這為抗性品種的選育和環(huán)境的重金屬污染治理提供一定的理論和技術(shù)支撐。然而現(xiàn)有技術(shù)的不完善和使用上的受限加之大部分的抗逆性能力是由多種微效基因加持而來(lái)，很少由主效基因直接控制，使得抗性基因和抗性植物在土地修復(fù)中難以運(yùn)用。目前研究的主要障礙有2個(gè)方面：(1)抗性植物在修復(fù)重金屬污染的過(guò)程中，部分已被植物體吸收的重金屬又會(huì)以殘枝落葉的形式回歸土壤，而回收植物體生長(zhǎng)各個(gè)時(shí)期的枯枝落葉消費(fèi)巨大，回收后的物質(zhì)也難資源化；自然界中以重金屬為植物生理代謝所需元素的品種較少，即使找到該品種，在修復(fù)污染土壤的問(wèn)題上，它只作為轉(zhuǎn)換重金屬價(jià)態(tài)的介質(zhì)，植物體從土壤中吸收的重金屬同樣面臨著資源化的問(wèn)題?？傮w而言，不管抗性基因還是抗性品種都存在資源大卻難以利用的局面，但是隨著科技的發(fā)展，相信新的技術(shù)能把植物體吸收和外排重金屬的特性和化學(xué)純化重金屬原理結(jié)合，從而資源化這些放錯(cuò)位的重金屬資源。例如，是否可以利用離子通道載體蛋白吸收特定的重金屬，使其以一種螯合物的形式富集起來(lái)，再結(jié)合化學(xué)中的可逆反應(yīng)，通過(guò)改變反應(yīng)條件使重金屬與載體蛋白分離，從而使重金屬純化。(2)基因測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序同是研究抗性性狀的一種手段，但兩者的側(cè)重點(diǎn)不同，基因測(cè)序大部分通過(guò)檢察目的基因編碼區(qū)域突變位點(diǎn)來(lái)闡述作用機(jī)制，而轉(zhuǎn)錄組測(cè)序則關(guān)注于某種脅迫下全部cDNA的表達(dá)。2種技術(shù)就像按源頭和按過(guò)程處理問(wèn)題一樣，相輔相成。轉(zhuǎn)錄組作為一種過(guò)程來(lái)研究抗性基因，結(jié)果應(yīng)該以一種動(dòng)態(tài)的、連續(xù)的狀態(tài)進(jìn)行表現(xiàn)，而不是以點(diǎn)的形式表達(dá)。這樣就能避免在非生物脅迫下，一部分抗性基因由于點(diǎn)式的測(cè)樣而未能被記錄。筆者認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序過(guò)程中動(dòng)態(tài)檢測(cè)最難的是不斷往測(cè)序系統(tǒng)中輸入RNA，在測(cè)序系統(tǒng)前添加多個(gè)自動(dòng)、獨(dú)立、高效提取RNA的提取器或許能解決這一問(wèn)題。這樣構(gòu)建系統(tǒng)測(cè)得的結(jié)果就能以動(dòng)態(tài)譜線的形式呈現(xiàn)出來(lái)。

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